不同贮藏温度条件下普洱生茶有效成分及理化特征分析

摘要" 为探讨不同温度贮藏条件下普洱生茶中有效成分及理化特征变化情况，本试验采用高效液相色谱技术（HPLC），测定不同贮藏温度（5、20和35"℃）条件下普洱生茶中没食子酸（GA）、儿茶素（C）和表儿茶素（EC）等6种多酚类化合物和咖啡因的含量，并检测茶汤色泽和pH变化。结果表明，该方法分离7种化合物分离度良好，质量浓度范围与其峰面积呈现良好的线性关系，精密度、稳定性和重复性的相对标准偏差（RSD）均小于5%，加样平均回收率99.45%～100.96%，RSD为0.08%～1.99%；温度对茶汤颜色无明显影响；pH呈现波动变化，5和20"℃贮藏条件下的茶汤pH变化较平缓，35"℃变化较明显；7种化合物含量变化均呈先下降后缓慢上升趋势。综上，HPLC测定方法简便、准确，重复性好，可同时测定普洱生茶中GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因7种成分的含量，且贮藏在5～20"℃条件下更有利于茶汤pH及化合物含量的稳定，本研究为普洱生茶贮藏的质量控制提供参考。

关键词" 普洱生茶；多酚类化合物；咖啡因；贮藏温度；高效液相色谱

中图分类号" TS272.7；O657.7+2"""""" 文献标识码" A"""""" 文章编号" 1007-7731（2025）01-0101-07

DOI号" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.01.020

Analysis of active components and physicochemical characteristics of Pu-erh raw tea at different storage temperatures

Abstract" To investigate the changes in active components and physicochemical characteristics in Pu-erh raw tea under different temperature storage conditions， high-performance liquid chromatography （HPLC） technology was used to" determine the content of 6 polyphenolic compounds， including GA， C， and EC， sa well as caffeine in Pu-erh raw tea under different temperature storage conditions （5， 20， and 35"℃）， and to detect the changes in tea color and pH value. The results showed that the separation of 7 compounds by this method was good， and the mass concentration range showed a good linear relationship with its peak area. The relative standard deviation of precision， stability， and repeatability were all less than 5%， and the average recovery rate was 99.45% to 100.96% （RSD was 0.08% to 1.99%）; temperature storage conditions had no significant effect on the color of tea soup; the pH value shows fluctuating changes. The pH changes of tea soup under storage conditions of 5"and 20"℃ were relatively gentle， while the change was more significant at 35"℃; the content changes of the seven compounds showed a trend of first decreasing and then slowly increasing. In summary， HPLC method is simple， accurate， and has good reproducibility， and can simultaneously determine the content of GA， EC， EGCG， GCG， ECG， and caffeine components， and storing at 5-20"℃ is more conducive to the stability of tea pH and compound content， providing a reference for the quality control of Pu-erh raw tea storage.

Keywords" Pu-erh raw tea; polyphenolic compounds; caffeine; storage temperature; high performance liquid chromatography

普洱茶历史悠久，是以云南大叶种晒青毛茶为原料加工而成的紧压茶，分为熟茶和生茶，其中生茶以自然的方式陈化，不经过人工发酵、堆制处理[1-2]。普洱茶原料源自云南的大叶种茶，生长在海拔1 200～1 400"m的亚热带和热带山地森林中，在保山、临沧和普洱等地均有分布[3]。普洱生茶的主要化学成分包括多酚类化合物，有机酸及其衍生物，如没食子酸（Gallic acid，GA）、咖啡酸、绿原酸、柠檬酸和苹果酸等；氨基酸及其衍生物，如茶氨酸、亮氨酸等；生物碱及其衍生物，如咖啡碱、可可碱等。这些物质为茶叶提供了鲜爽和苦涩的口感。茶多酚是普洱生茶中一类重要的化合物，是多种酚类衍生物的总称，占茶叶干物质总量的20%～30%，主要包括儿茶素类，如儿茶素（Catechin，C）、表儿茶素（Epicatechin，EC）等[4-6]。普洱生茶具有降脂、消炎、降血糖、降血压以及保肝、抑制酒精性胃损伤等功效[7-9]。

普洱生茶在陈化过程中，茶多酚、氨基酸和糖类等主要化学成分发生变化，发酵形成独特的品质和香气。温度和湿度是影响普洱生茶品质的重要因素，GB/T 331608—2023《食品安全国家标准 茶叶》[10]对茶叶中的污染物和农药残留做出了相关规定。钟舒洁等[11]研究发现，超高效液相色谱-串联质谱联用法受杂质干扰较小，适用于检测普洱茶中的黄曲霉菌含量；侯冬岩等[12]研究表明，采用高效液相色谱法测定生普洱茶和熟普洱茶样品的咖啡因含量，其变异系数较小、回收效率较高。关于温度对普洱生茶影响的研究鲜有报道。本试验将普洱生茶分别在5、20和35"℃条件下贮藏30"d，采用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）测定其没食子酸、表儿茶素、儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、表儿茶素没食子酸酯（Catechin gallate，ECG）和咖啡因的含量，观察温度对茶汤色泽和pH的影响，得出普洱生茶较适宜的贮藏温度，为建立一种准确灵敏、快速简便测定普洱生茶中有效成分的方法提供参考。

１ 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

普洱生茶茶饼购自云南龙润茶业集团有限公司，原料为云南大叶种晒青毛茶，产地为云南保山，生产日期为2023年4月18日。试验开始前，茶叶按要求存放在干净、通风、避光、干燥且无异味的环境中。将茶饼分散并随机分成3份，分别装入1 000"mL棕色广口瓶中，分别在5、20和35"℃条件下保存。

乙腈（色谱纯）购自Sigma Aldrich西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；甲醇（分析纯）和磷酸（分析纯）均购自天津大茂化学试剂厂。没食子酸（批号：wkq16081904，纯度≥98%）、表没食子儿茶素没食子酸酯（批号：wp24010207，纯度≥98%）和没食子儿茶素没食子酸酯（批号：wkq23030804，纯度≥98%）购自四川维克奇生物科技有限公司；表儿茶素（批号：N1106CS，纯度≥98%）和表儿茶素没食子酸酯（批号：J0106BS，纯度≥98%）购自大连美仑生物科技有限公司；儿茶素（批号：P02A9F57645，纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；咖啡因（批号：PS011597，纯度≥98.5%）购自成都普思生物科技有限公司。试验用水为超纯水。

1.2 试验仪器

HPLC采用Agilent 1200高效液相色谱仪，键合硅胶柱为Agilent Zorbax C18 （150 mm× 4.6"mm，5 μm）（美国Agilent公司）；T-10900型电子天平（上海普春计量仪器有限公司）；AB265-SMET-TLER TOLEDO 十万分之一分析天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；pHS-25酸碱度测量仪（上海仪器仪表有限公司）；冰箱（合肥美菱股份有限公司）；303A-0S电热恒温箱（绍兴上虞鲁丰仪器制造有限公司）；303-0A恒温培养箱（绍兴一成仪器制造有限公司）；8002TDA温度控制仪（北京永光明医疗仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 样品在Agilent Zorbax C18（150 mm× 4.6"mm，5 μm）上分离，流动相由乙腈（溶剂A）和0.1%磷酸水（溶剂B）组成。流速0.8"mL/min，色谱柱温度30"℃，紫外检测器的检测波长275"nm，进样量均为10 μL。梯度程序如表1所示。

1.3.2 样品和标准溶液的制备 准确称量GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因，并将其溶解在甲醇中，分别配制成浓度为2.640、0.227、0.404、0.430、0.687、0.443和0.503"mg/mL的标准溶液，储存于5"℃条件下。分别称取储存在5、20和35"℃条件下的茶叶1"g，将其加入50"mL预热至70"℃的70%甲醇中，混匀后静置10"min，溶液经0.45 μm滤膜过滤后，进行HPLC分析。

1.3.3 线性关系检验 分别吸取2、4、6、8、10和12 μL的GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因标准溶液，按照1.3.1色谱条件进样测定，记录峰面积相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）。以进样量和峰面积绘制各成分的线性回归方程。

1.3.4 精密度 精密吸取配制成1.3.2中各成分样品溶液，在1.3.1色谱条件下连续进样6次，测定其峰面积RSD。

1.3.5 稳定性 分别于0、2、4、8、12和24"h精密吸取1.3.2中各成分样品溶液，在1.3.1色谱条件下进样，测定其峰面积RSD。

1.3.6 重复性 取1.3.2中各成分样品溶液，在1.3.1色谱条件进行程序洗脱，测定其峰面积RSD。

1.3.7 加样回收率 精确称量样品，加入已知量的各标准化合物，获得回收率；然后按照相同方法处理和分析这些混合样品，重复6次，计算平均回收率及回收率RSD。

1.3.8 化合物含量 每7 d取不同贮藏温度条件下茶叶样品，按1.3.2方法制备供试品溶液，在1.3.1色谱条件下进样，测定7种化合物含量。

1.3.9 颜色变化与pH 分别取3个贮藏温度的茶叶0.5"g，将其加入预热至100"℃的30"mL水中，混匀静置10"min，测定pH；然后将溶液转移到透明塑料离心管中，拍照记录颜色变化。

1.4 数据处理

将高效液相色谱原始数据导入Origin 2022软件并绘制成色谱图，使用GraphPad Prism 9.5.0软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 方法学检验

2.1.1" 线性关系 以GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的进样量（x，μg）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行回归，线性回归方程见表2。说明各成分在各自范围内线性关系良好。

2.1.2 精密度 GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的峰面积RSD分别为0.08%、0.08%、0.11%、0.08%、0.09%、0.12%和0.13%，说明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性 24"h内GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的峰面积RSD分别为0.68%、0.23%、0.28%、0.18%、0.33%、0.19%和0.25%，表明样品溶液在24"h内具有良好的稳定性。

2.1.4 重复性 GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的峰面积RSD分别为0.21%、0.16%、0.22%、0.23%、0.36%、0.21%和0.17%。结果表明，该制备方法具有良好的重复性。

2.1.5 加样回收率 由表3可知，GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的回收率RSD分别为0.97%、0.09%、0.65%、0.69%、1.99%、0.83%和0.08%，回收率符合要求。综上，HPLC方法符合测试结果要求。

2.2" 化合物含量HPLC测定

2.2.1" 样品峰图叠加""" 检测的5次结果经软件处理后形成叠加图，可以更直观地显示每种化合物含量的变化。如图1所示，不同温度贮藏条件和保留时间下的化合物含量存在差异，以3个贮藏温度条件下的GA、咖啡因、EGCG和ECG差异较明显。35"℃贮藏条件下HPLC峰面积变化最为明显，其他2种贮藏温度条件下峰面积变化较为平缓。GA、C和EC等7种成分HPLC峰面积均呈先下降后上升的趋势，在第3周出现最低值。

2.2.2 化合物含量变化""" 由图2可知，3个贮藏温度条件下的各化合物含量变化趋势基本一致，在处理0—2周时，3个温度下GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的含量均出现明显下降，在第2周达到最低值，20"℃下GCG含量在第1周为最低值，之后呈缓慢上升趋势。整体上看，随着贮藏温度的升高，化合物含量变化较明显。

2.3 茶汤颜色变化分析

由图3可知，3个贮藏温度条件下的茶叶存放30"d后，制成的茶汤颜色差异较小，均呈黄绿色。说明贮藏温度条件对茶汤颜色无明显影响。

2.4 pH变化分析

由图4可知，5和20"℃贮藏条件下的茶汤pH变化较小，其中5 ℃贮藏条件下的茶汤pH呈先下降后上升的趋势，20 °C贮藏条件下的茶汤pH呈先下降后上升再下降的趋势，35"°C贮藏条件下的茶汤pH变化较大，以第4周的pH较大。说明在5和25"℃贮藏条件下的茶汤pH变化较稳定，其口感较为均一。

3 结论与讨论

普洱生茶因其独特的品质特征，具备越陈越香的贮藏价值[13]。优质贮藏条件能够改善普洱生茶的风味品质，关于普洱茶的研究主要集中在贮藏环境条件及贮藏过程中其品质变化等方面[14-15]。本研究采用HPLC测定3个温度贮藏条件下的普洱生茶中GA、C、EC等7种物质含量，同时检测其茶汤色泽、pH变化。结果表明，HPLC测定普洱生茶中化合物含量的方法重复性好、准确性高。王丽等[16]研究认为，HPLC方法检测普洱茶中黄酮类化合物含量相对偏差较小，准确率较高，该方法的回收率及精密度均符合测定要求；徐丹萍等[17]研究表明，HPLC测定方法重复性和精密度较好，其测定普洱熟沱茶叶中咖啡因含量的结果较为稳定、可靠，咖啡因峰面积与含量之间具有良好的线性关系，本试验结果与此基本一致。在不同的贮藏温度下，普洱生茶中不同种类化合物的含量呈不规则波动，35"℃贮藏条件下的普洱茶中化合物含量波动较大，5和20"℃贮藏条件下的化合物含量变化相对稳定，处理第1周的化合物含量降低的原因可能是外界环境的突然改变。不同贮藏温度存放30"d对茶汤色泽无明显影响，在35"℃贮藏条件下，普洱生茶的pH波动较大，5和20"℃时pH相对稳定。

综上，本研究建立了一种通过HPLC测定普洱生茶中GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因 7种物质含量的方法，该方法分离7种化合物分离度良好，质量浓度范围与其峰面积呈现良好的线性关系，精密度、稳定性、重复性及回收率均满足测定要求。普洱生茶中化合物含量会因贮藏温度的不同而发生变化，较高温度会导致其含量波动性较大，因此阴凉的环境（5～20"℃）更有利于保持普洱生茶的品质，需保持贮藏温度恒定。本研究为普洱生茶的贮藏质量控制提供参考。

参考文献

[1] 黄桂枢. 普洱茶文化大观[M]. 昆明：云南民族出版社，2005.

[2] 史靖昱. 普洱茶的起源、发展与兴盛[J]. 中国茶叶，2021，43（8）：72-76.

[3] 陈红伟. 云南普洱茶产地及其历史变迁[J]. 中国茶叶加工，2001（4）：45-46.

[4] 张裕君，黄逢阳，邵瑞祥，等. 普洱茶陈化过程中品质变化规律的研究进展[J]. 食品研究与开发，2024，45（14）：201-208.

[5] WANG Y J，KAN Z P，THOMPSON H J，et al. Impact of six typical processing methods on the chemical composition of tea leaves using a single Camellia sinensis cultivar，Longjing 43[J]. Journal of agricultural and food chemistry，2019，67（19）：5423-5436.

[6] CAO X X，LIU M M，HU Y J，et al. Systemic characteristics of biomarkers and differential metabolites of raw and ripened pu-erh teas by chemical methods combined with a UPLC-QQQ-MS-based metabolomic approach[J]. LWT，2021，136：110316.

[7] LUO D，CHEN X J，ZHU X，et al. Pu-erh tea relaxes the thoracic aorta of rats by reducing intracellular calcium[J]. Frontiers in pharmacology，2019，10：1430.

[8] 邓洪燕，毛静春，毛建富，等. 普洱茶中儿茶素研究进展[J]. 农学学报，2024，14（1）：83-89.

[9] YANG C Y，HUNG K C，YEN Y Y，et al. Anti-oxidative effect of Pu-erh tea in animals trails：a systematic review and meta-analysis[J]. Foods，2022，11（9）：1333.

[10] 国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局. 食品安全国家标准" 茶叶：GB 31608—2023[S]. 北京：中国标准出版社，2023.

[11] 钟舒洁，陈晓嘉，周芳梅，等. UPLC-MS/MS、HPLC和ELISA法测定普洱茶中黄曲霉毒素研究[J]. 安徽农学通报，2021，27（16）：15-19.

[12] 侯冬岩，刁全平，李铁纯，等. 生普洱茶与熟普洱茶中咖啡因含量的HPLC分析[J]. 鞍山师范学院学报，2016，18（4）：21-23，27.

[13] 王秋霜，吴华玲，凌彩金，等. 普洱茶理化品质及特征“陈香”物质基础研究[J]. 食品工业科技，2017，38（5）：308-314.

[14] 肖巧梅，张晓宇，王娟，等. 2020年普洱茶相关研究动态[J]. 热带农业科技，2021，44（3）：32-37.

[15] 单治国，张春花，满红平，等. 普洱茶贮藏过程中含水量与多酚变化的相关性分析[J]. 现代食品，2022，28（10）：155-160.

[16] 王丽，邵金良，魏茂琼，等. 普洱茶中黄酮类化合物含量的测定方法[J]. 江苏农业学报，2016，32（6）：1410-1415.

[17] 徐丹萍， 艾凌艳， 夏小凤. 高效液相色谱法测定普洱熟沱茶叶中咖啡因的含量[J]. 海峡药学， 2016， 28（8）： 63-66.