微生物实验教学中微波炉对废菌灭活处理方法的探索

摘"要：高校微生物教学中菌类相关课程较多，为了降低废菌对实验室生物安全的威胁，避免其损害学生及教师的生命健康，本文以实验室常用的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉、根霉和黄曲霉为例，利用微波炉对其进行不同时长的照射处理，发现两种细菌在固体和液体环境中的灭活分别需要3min和2min，三种霉菌在固体和液体环境中的灭活分别需要2min和1.5min。该废菌灭活方案造价低、易操作、耗时短、效率高，适用于本科微生物教学实验室中学生的使用。因此可以安排在相关实验教学课程当中，并推广至医学、科研类实验室。

关键词：高校微生物教学；生物安全；废菌；微波炉；灭活

中图分类号：Q933""文献标识码：B

1"高校本科微生物教学实验室生物安全现状

高校微生物实验课主要是为了让学生掌握各类微生物相关的实验基本操作，其中“细菌革兰氏染色与形态观察”“霉菌制片与形态观察”是微生物实验课中较为重要的课程，该实验教学目的是让学生掌握细菌和霉菌形态观察的制片方法，并认识其形态结构，从而把理论的、抽象的知识具体化，锻炼学生动手操作能力，培养学生学习兴趣。然而，该课程的开展也引起了以下一些问题。

1.1"实验室环境复杂

进入实验室的本科生基数较大，需要的细菌和霉菌的实验材料较多。微生物随着实验操作过程中产生的气溶胶而扩散［1］，其中霉菌会附着在空气中的尘埃里［2］，因此实验结束后，如果这些材料没有得到及时灭活处理，会造成实验室的严重污染。目前各类呼吸道流行传染疾病较为高发，实验室微生物污染不仅会影响学生实验结果，还会增加教师和学生呼吸道感染、皮肤过敏等疾病的发病概率［3］。

1.2"学生缺乏实验室经验

进入高校本科教学实验室的群体主要是毫无科研实验经历的本科生，他们对实验原理理解不够深入、仪器使用不熟练、药品材料性能不了解、缺乏实验应变能力，加之本科生基数较大，课程时间有限，教师很难做到一对一详细的实验指导和监督，这些因素给实验室的废菌处理工作增加了一定的难度。

1.3"微生物灭活方法不适用

目前常用的微生物灭活方法较多，物理方法如加热、紫外线［4］等，然而加热不彻底会造成二次污染，紫外线照射的范围有限，效果不定；化学方法如漂白水、酸碱试剂和酒精等，该方法药品用量较大，并且细菌的细胞壁成分复杂，对消毒剂的敏感程度具有选择性，更有大量的化学残留；生物疗法如抗生素等，造价太高［56］。

经调研发现，微波的产热功能能够杀灭微生物［7］，并且病原微生物的细胞液吸收微波的能力强于周围其他物质，因此微波可以杀灭细菌、霉菌、病毒和细菌芽孢［8］。微波炉具有热效率高、耗电量小、方便快捷等特点，现今在普通家庭生活和实验室中使用非常普遍。实验设定了固体和液体灭菌环境、不同的微波炉照射时间，从而对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉、根霉和黄曲霉进行灭活处理，以确认微波炉对菌类灭活的有效性。

2"基于微波炉的废菌灭活实验

2.1"实验仪器与材料

2.1.1"实验仪器

微波炉（美的M1231E）、立式高压蒸汽灭菌锅（上海申安LDZX50KBS）、培养箱（博迅）等。

2.1.2"菌种

大肠杆菌（ATCC35218）、枯草芽孢杆菌（CMCC63501）、青霉（ATCC36839）、根霉（GM10）、黄曲霉（ATCC9643），购自普通微生物菌种保藏中心，本室传代保存。

2.1.3"培养基制备

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl"5g、琼脂10g、水1000mL。土豆PDA培养基：土豆200g、琼脂10g、葡萄糖20g、水1000mL。

2.2"实验设计

2.2.1"固体培养基中菌类灭活

将准备好的不同细菌和霉菌玻璃平板（每个平板内带菌固体培养基10g）置于微波炉托盘中央高火照射至预定时间，取出放凉后，拿至超净工作台中分别接种至牛肉膏蛋白胨和土豆PDA固体斜面（已灭菌），培养箱37℃和28℃，逐日观察是否有对应菌长出。

2.2.2"液体培养基中菌类灭活

取准备好的不同细菌和霉菌菌液（OD600=0.8）10mL于三角瓶中，将其置于微波炉托盘中央高火照射至预定时间，取出放凉后，拿至超净工作台中分别接种至牛肉膏蛋白胨和土豆PDA固体斜面（已灭菌），培养箱37℃和28℃，逐日观察是否有对应菌长出。

2.2.3"数据统计

周灭活率=（该组总样品数-周长菌样品数）/该组总样品数×100%，本文实验次数大于等于3，图表中为平均灭活率。

2.3"实验结果

2.3.1"微波炉对细菌的灭活效果

如表1所示，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在固体和液体环境中，分别经微波炉照射180s和120s，基本可达到废菌灭活效果。有研究发现微波炉对革兰阴性杆菌的作用强于革兰阳性菌［9］，这与本文的结果也是相符的。然而消毒灭菌的效果与样本量也有着十分明显的正相关关系，因此在实际应用过程中，需要根据废菌重量、体积和浓度设定好微波炉照射时间。

2.3.2"微波炉对霉菌的灭活效果

通过对微波炉照射后接种的青霉斜面观察，无论固体还是液体环境中，微波炉照射30s灭活率可达到50%，照射60s菌体基本已完全被灭活，照射90s可达到100%；根霉在固体和液体环境中分别照射120s和90s菌体基本已完全被灭活；黄曲霉在固体和液体环境中分别照射120s和90s可达到100%的灭活率（表2）。在实验过程中发现：（1）三种霉菌经微波炉照射后生长较为缓慢，这说明微波炉的辐射对霉菌产生了较大的损伤；（2）青霉在固体和液体环境中的灭活所需的微波炉照射时间基本相似，且与根霉和黄曲霉相比更容易被灭活；（3）根霉和黄曲霉在液体环境中更容易被灭活。

综上所述，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌若在固体环境中需要经微波炉照射3min，在液体环境中需要照射2min可达到完全的灭活；青霉无论在液体还是固体环境中，经微波炉照射1.5min可达到完全的灭活；根霉和黄曲霉在液体和固体环境中，分别经微波炉照射1.5min和2min可达到完全的灭活。根据以上数据发现：（1）微波炉对霉菌的灭活比细菌效率高，这可能是由于霉菌的孢子暴露在空气中，更容易被灭活；（2）液体环境中微波炉的灭菌效率更高。

因此，在“菌类的制片与形态观察实验”实验结束之后，要求学生将废弃固体废菌置于玻璃平皿或者烧杯中，液体废菌置于三角瓶或者烧杯中，按照下图进行废菌处理。由于微波炉对细菌和霉菌的灭活率与其种类、质量、体积和浓度有关，因此在应用中要根据实际情况设定好微波炉照射时间，经灭活处理后再丢弃，并清洗相关器具。该方法处理比较集中、造价低、耗时短、使用便捷、易操作，非常适用于实验技能较薄弱的本科生。

3"实验教学实施过程及时间安排

在菌类的制片与形态观察课程中，教师需要在讲述实验原理和操作之后，向学生讲述微波炉灭活的细节和方法及生物安全的重要性，让学生理解接受实验后对废菌处理的方法和必要性。表3中的4—7步骤为该课程加入的四个步骤。学生实验完成后，要求学生按照“三步法”完成实验室消毒工作，第1步，按照文中实验得到的结论（上图）以微波炉法处理固体或者液体废菌，本文在实验中每个样品量较少，如果学生废弃样品重量或者体积较大，需要延长微波炉照射时间，以确保灭活的有效性；第2步，用75%的酒精清洁实验室台面、地面及空气；第3步，用75%的酒精处理垃圾桶，并清理垃圾。在实验室清理消毒过程中，教师做好监督管理，避免学生将活菌直接丢在垃圾桶当中。

4"教学讨论及反思

在以往的实验教学中，实验人员会在学生实验下课之后进行废菌处理，并对教室进行消毒清理，这种方法虽然减轻了课程压力，但是导致学生忽视病原菌类的危害性、生物安全的紧迫性和实验室环境安全的重要性，并在实验过程中过度放松随意，引起个人及实验室大面积的废菌污染。菌类的制片与形态观察课程实验较为简单，学生基本在一个课时之内就能完成实验及结果观察分析，将生物安全的讲解、废菌处理、实验室环境卫生清理纳入该课程具有可行性和必要性。这部分课程内容的加入让学生在实验操作中保持对微生物的警惕性，在实验后能够认真积极地应用微波炉进行废菌处理和实验室卫生清理，一方面分担了实验室工作强度，维持了良好的实验室环境，另一方面让学生在掌握实验技术的过程中，加强生物安全、实验室环境安全和生态安全的意识，为自己和他人的生命健康安全负起责任。

目前已有微生物实验室［10］和临床细菌检验中［11］对常用培养基、相关器具［12］、实验服［13］等进行微波炉灭菌处理。因此，在微生物教学实验室中，可以利用微波炉的灭菌功能对相关器具材料进行处理，从而保证学生的实验顺利开展，该方法极大地节约了时间及能源。此外，不同实验室由于实验内容和微生物污染的种类不同，其他医疗卫生、食品、科研机构应根据本实验室的实际情况设定微波炉灭活方案，并结合多种方法来维护实验室生物安全。

参考文献：

［1］韩文东，孙志平，丁悦娜，等.结核分枝杆菌生物安全三级实验室表面去污染消毒剂杀菌效果的研究［J］.微生物与感染，2015，10（05）：301307.

［2］杨庆文，周惠新，王瑾，等.一起霉菌引起实验室污染的原因调查［J］.中国卫生检验杂志，2003（03）：346.

［3］郭震.病原生物学实验室几种常用空气消毒方法的研究［J］.现代医药卫生，2010，26（10）：15961597.

［4］WALKER"CM，KO"G.Effect"of"ultraviolet"germicidal"irradiation"on"viral"aerosols［J］.Environ"Sci"Technol，2007，41（15）：5460.

［5］HYEYEON"C，YONGHOON"L，CheolHong"L，et"al.Assessment"of"respiratory"and"systemic"toxicity"of"Benzalkonium"chloride"following"a"14day"inhalation"study"in"rats［J］.Particle"and"fibre"toxicology，2020，17（1）：5.

［6］史正晨，孙兴滨，刘佳蒙，等.高锰酸钾预氧化对大肠杆菌DBPsFP的去除［J］.中国环境科学，2018，38（2）：581587.

［7］王一娴，叶尊忠，斯城燕，等.适配体生物传感器在病原微生物检测中的应用［J］.分析化学，2012，40（04）：634642.

［8］庄健海.AC·T5diff血细胞分析仪临床应用评价［J］.实用医技杂志，2006（19）：34473448.

［9］赵嘉宁.微波炉对常见病原微生物的杀灭作用探析［J］.中西医结合心血管病电子杂志，2018，6（14）：190.

［10］傅金衡.微波炉对培养基的灭菌探讨［J］.生物学杂志，1994（04）：36.

［11］谢昌华，李凤英，孔祥华，等.微波炉用于培养基灭菌研究［J］.滨州医学院学报，1998（04）：20.

［12］罗丽.微波炉在微生物实验教学中的应用［J］.科技信息，2008（31）：355.

［13］孙开英.微波在消毒与灭菌工作中的应用研究进展［J］.医学动物防制，2001（07）：385387.