金荞麦转录组SSR位点分析及分子标记开发

摘 要 金荞麦具有较高的医疗保健价值，目前缺乏相应的分子工具用于系统评价金荞麦资源以保护及利用种质资源，SSR标记能够应用于植物多样性评价、品种鉴定以及遗传图谱构建等领域。为揭示金荞麦根系转录组SSR分布特征，开发更多有价值的SSR标记，本研究利用Krait软件对其46 923个Uingenes序列的SSR位点进行检索和标记开发。结果显示，在1 783个Unigenes序列中包含1 961个SSR位点，SSR分布频率为3.80%，平均分布间距为1/17.00 kb；其中三核苷酸重复基序数量最多（54.92%），其次是单核苷酸重复基序（23.36%）和二核苷酸重复基序（10.76%）；共发现104种重复基序，其中A/T的出现频率最高 "（23.10%），其次是AAG/CTT（16.32%）和AG/CT（5.61%）。随机合成了115对SSR引物，基于12份金荞麦种质资源检测其多态性，结果得出98对引物（85.2%）能扩增出目标条带，其中36对引物有多态性。单个SSR引物平均能检测到3.83个变异位点，多态信息含量（PIC）为0.15～0.96，平均为0.53；12个金荞麦之间的遗传相似系数为0.47～0.76，平均值为0.55，表明12个金荞麦种质具有一定的遗传多样性。本研究鉴定金荞麦根系转录组SSR标记，有效增加了金荞麦遗传多样性评价、品种鉴定和重要性状遗传机制的解析等研究中可用的分子标记，为金荞麦分子育种的深入研究奠定了基础。

关键词 金荞麦种质；转录组；SSR分子标记；聚类分析

金荞麦（Fagopyrum cymosum）为蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum）多年生半灌木植物，又有苦荞头、野荞麦及红三七等别称，是多年生野生大粒型荞麦的总称[1]。金荞麦原产于中国西南地区，现广泛分布于尼泊尔、不丹、印度以及中国西藏、云南、贵州等地[2]。金荞麦富含多酚类、甾体、萜类、有机酸类、黄酮类等物质，常以干燥的根茎入药，因其有较强的抗菌活性以及增强机体免疫能力等功能而被载入《中华人民共和国药典》和《中国兽药典》[3-5]。近年来，金荞麦人工栽培种产量和品质难以满足日渐增加的市场要求，而野生资源因过度采伐濒临灭绝，已被列为了国家二级保护植物。目前，由于缺乏系统的金荞麦资源评价体系，极大地限制了对金荞麦种质资源的保护及有效利用。因此，金荞麦种质资源的鉴定不但对野生金荞麦资源的保护具有重要作用，也有利于金荞麦资源的开发利用。

目前，SSR标记已广泛应用于植物多样性评价[6-7]、品种鉴定[8]以及遗传图谱构建[9]等领域。荞麦属的三大栽培种中普通荞麦和苦荞基因组及转录组SSR分子标记已大规模开发，并已广泛应用于荞麦属植物种质资源遗传多样性评价[10-13]、群体结构分析[14]和重要农艺性状的关联分析[15-16]等研究中。金荞麦是苦荞的野生近缘种，其基因组大小（1.08 Gb）是苦荞（0.48 Gb）的两倍多，遗传信息更为丰富[17]。然而金荞麦SSR标记的研究及应用还相对匮乏，目前仅赵莎等[18]利用5对金荞麦基因组SSR分子标记对来自云南、贵州、四川的野生金荞麦样本进行遗传多样性分析及聚类分析。任奎[19]利用甜荞10对SSR引物对497份金荞麦种质资源进行了遗传多样性分析，进一步验证了西南地区是野生荞麦的多样性中心。近年来，金荞麦的转录组[20-21]和基因组[17]序列相继释放，为大规模开发金荞麦SSR标记奠定了基础。

本研究分析了金荞麦根系转录组Uingenes序列SSR的信息和分布特征，利用12份金荞麦种质筛选多态性SSR引物，并进行遗传多样性分析，研究结果将为金荞麦亲缘关系鉴定、种质资源评价以及遗传图谱构建等研究提供多态性丰富的SSR标记。

1 材料与方法

1.1 试验材料及DNA提取

随机选取12份金荞麦种质作为转录组SSR引物多态性研究的材料（表1）。材料常年种植于贵州师范大学荞麦产业技术研究中心安顺研究基地（106°12′E，26°9′N）金荞麦种质圃，于2022年3月采取其幼嫩叶片，采用CTAB法提取基因组DNA[22]，使用B-500超微量分光光度计（中国上海元析仪器）测定DNA浓度和纯度。将检测合格的DNA样品稀释至100 ng·μL-1置于 "-20 ℃冰箱保存，备用。

1.2 转录组SSR位点搜索及引物合成

利用贵州师范大学生命科学学院贵州省荞麦工程技术研究中心前期基于高通量测序获得的金荞麦根系转录组的Unigenes序列[20]，采用Krait软件搜索其SSR位点并设计引物。SSR位点搜索参数设置为：单至六核苷酸重复的最小重复次数分别为12、7、5、4、4和4次。SSR引物设计参数为：引物长度18～20 bp，目标产物大小100～300 bp，GC含量30%～80%，退火温度58" ℃～60 ℃。

1.3 SSR引物的扩增和电泳

PCR反应体系为：DNA模板1 μL（100" "ng·μL-1），上下游引物各1 μL（10" "μmol·L-1），Green Taq Mix（中国南京诺唯赞），6 μL，补双蒸水至12 μL，再加入10 μL石蜡油。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s；最适退火温度（Tm），退火30 s；72 ℃复性" "45 s，32个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物加入6 μL的6×上样缓冲液，利用DYCZ-30C双板夹芯式垂直电泳仪（北京六一仪器厂）进行8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显影后，拍照记录带型。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 金荞麦根系转录组SSR位点信息

在金荞麦转录组的46 923个Unigenes序列中共搜索到1 961个SSR位点，分布在1 783条Unigenes上，发生频率（含有SSR的Unigene个数/Unigene总数）为3.80%。其中，含2个及以上SSR位点的Unigene序列有178条，其余 "1 626条序列均含1个SSR位点；SSR出现频率（SSR个数/Unigene总数）为4.18%，SSR平均分布间距1/17.00 kb（表 2）。

2.2 金荞麦根系转录组SSR分布特征

金荞麦转录组SSR类型主要集中于单至三核苷酸重复，共占SSR总数的89.04%，其中单核苷酸占23.36%，二核苷酸占10.76%，三核苷酸重复数目最多占54.92%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR分布较少，分别占比5.86%、 "2.29%、2.80%。共有104种重复基元类型，单至六核苷酸重复分别有2、4、9、21、23和45种（表 2）。从重复基元分布比例来看，单核苷酸重复基元 "A/T占SSR位点总数比例最高，为23.10%，其次是三核苷酸重复基元AAG/CTT，分别为16.32%；二核苷酸重复基元以AG/CT占比最高，为 "5.61%（图 1）。

金荞麦转录组SSR基序长度平均为16.25 bp，单至六核苷酸SSR基序的平均序列长度分别为14.36、16.19、16.33、17.18、20.67及24.98 bp（表 2）。SSR重复长度以15～19 bp最多，占比为67.87%，25～29最少，占比为0.15%；SSR重复次数以5次最多，10次最少；单核苷酸主要重复次数为12～15次，二核苷酸主要重复次数为 "7～11次，三核苷酸主要集中主要重复次数为5～7次，其他3种核苷酸类型主要重复次数为4次（图 2）。各类型SSR数量均随着重复长度的增加而减少，其中15 bp重复长度的SSR数量最多，19 bp数量最少；单核苷酸重复长度主要分布在 "12～17 bp，二核苷酸重复长度分布较为分散，主要集中在14 bp和16 bp，三至六核苷酸主要重复长度分别为15 bp、16 bp和20 bp，六核苷酸主要重复长度均为24 bp（图 3）。

2.3 金荞麦根系转录组SSR标记开发与验证

用Krait软件共设计1 961对SSR引物，随机选择115对引物对12个金荞麦种质的基因组DNA进行扩增，共有98对引物能在金荞麦中有效扩增，扩增效率为85.22%；扩增片段大小范围为63～800 bp，其中36对SSR引物有多态性，多态性比率为36.73%（图4）。36对多态性引物在12个金荞麦种质中共扩增出138条带，平均每对引物扩增出3.83条，多态性条带有110条，共扩增出119种带型，平均1对引物有3种带型；多态信息含量（PIC）范围为0.15～0.96，平均值为0.53；其中引物BCuni37047的总条带数、多态性条带数、带型最多（8条、8条、9种）以及BCuni1746的PIC值最高（0.96）（表 3）。

2.4 金荞麦种质的聚类分析

基于36对多态性SSR引物分析12份金荞麦种质的遗传关系（图 5），从UPGMA聚类图可以看出，12份金荞麦种质遗传相似系数介于 "0.47～0.76，说明这12份金荞麦种质间存在着一定的遗传变异。当遗传相似系数在0.61时，供试种质被分为4类。‘红心金荞’与其他在种质遗传背景较远，单独聚为一类；第Ⅱ类包含‘巨大F1’和‘B9-11’两个种质，二者均收集于贵阳市，遗传背景较为接近；第Ⅲ类包含4个种质，分别为‘A7-2’‘A6-6’‘A3-1’和‘金酮1号’，说明这 4个种质具有相近的遗传背景；其余5个种质‘矮金荞’‘A2-6’‘A11-6’‘A3-4’和‘A1-1’均来自贵州省被聚为第Ⅳ类，说明这5个种质遗传关系较近，与其他种质遗传关系较远（图5）。

3 讨论与结论

源自于转录组的SSR标记，比来自基因组的SSR标记具有更强的通用性，也更有利于后期与重要农艺性和品质状进行关联分析[25]。本研究从金荞麦转录组的46 923个Unigenes序列中共发现1 961个SSR位点，SSR位点的出现频率（1/17.00 kb）远小于甜荞根系转录组（1/1.71 kb）[26]、种子转录组（1/1.17 kb）[27]和花序转录组（1/8.21 kb）[28]以及苦荞籽粒转录组（1/7.81 kb、1/1.73 kb）[11，29]。SSR位点以三核苷酸重复基序为主，比例为54.92%，与苦荞转录组的研究结果一致[12]，与甜荞根系转录组以单核苷酸重复基序为主（48.13%）的研究结果不符[25]。金荞麦根系转录组SSR以单核苷酸重复基元A/T数量最多，这与甜荞[26]和苦荞[12]转录组SSR的研究结果相同；二核苷酸重复基元以AG/CT最高，这与防风的研究结果一致[30]。三核苷酸的优势基元是AAG/CTT，不仅与荞麦属转录组SSR的特征相同也与川党参[31]、油茶[32]及黑枣[33]等双子叶植物的研究结果相同，与水稻、高粱、玉米等单子叶植物CCG/CGG为优势基序的研究结果存在差异[34]。以上研究结果表明，SSR位点的出现频率、三核苷酸重复类型和各类型的优势基序的差异主要与物种、样品来源、序列数量、序列长度统计对象及SSR搜索标准等因素有关。

荞麦属有20余个种[35]，其分子标记相关研究主要集中在甜荞和苦荞这两个栽培种上，金荞麦的研究较少且仅为基因组SSR标记的开发。本研究根据金荞麦根系转录组高通量测序数据，设计合成了115对引物并进行多态性验证，其中有98对引物能够有效扩增，扩增效率为 "85.22%；其中有36对有多态性，多态性比率 "36.73%，高于苦荞（32.97%）[29]与甜荞 "（30.00%）[30，36]的多态率。36对多态性引物在12份金荞麦种质扩增的PIC值为0.15～0.96，其中高度和中度多态性位点的SSR共有33对，占比 "91.7%，表明金荞麦基于转录组序列开发多态性较高的SSR标记经济可行，能有效地丰富金荞麦SSRs数据库。

中国西南地区是世界公认的荞麦起源和遗传多样性中心，许多学者通过不同方法在分子水平上对金荞麦种质资源进行了评价及鉴定，探索了每个聚类群组的遗传特征、地理分布及生物学意义，揭示了金荞麦样品之间的遗传关系。赵莎等[18]利用5对SSR标记对不同产地野生金荞麦SSR标记鉴定，结果表明：云南、贵州居群的金荞麦种群关系近，四川与云南、贵州两居群种群关系相对更远。张春平等[37]利用随机扩增的多态性DNA（RAPD）标记对重庆市7个野生金荞麦居群的87个个体进行遗传多样性分析和聚类分析，发现金荞麦种内有丰富的遗传多样性。邓蓉等[38]应用简单序列重复间区（ISSR）标记对贵州省内11个不同地域的金荞麦种质进行了遗传多样性与亲缘关系分析，发现11份种质间遗传差异较小且相对稳定。程成[39]采用内转录间隔区（ITS）、matK分子标记手段对收集的云南省内金荞麦进行遗传多样性和亲缘关系分析，得出了海拔是影响其分类的主要因素的结论。本研究利用36对多态性SSR引物对12份金荞麦种质进行了遗传多样性和聚类分析，遗传相似系数为0.47～ "0.76，遗传多样性较好，每个类群间的遗传相似系数均大于0.60，证明各类群间的亲缘关系较近。

综上所述，本研究揭示了金荞麦根系转录组SSR位点的信息，开发了一批SSR分子标记，获得36对SSR标记，揭示了金荞麦种质资源的遗传多样性。研究结果对于丰富荞麦属植物SSR分子标记种类，促进金荞麦种质资源的评价与利用、开展品种鉴定和杂交种真实性鉴定以及重要农艺和品质性状的解析等奠定了基础。

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Transcriptome SSR Loci Analysis and Molecular MarkerDevelopment" in" Fagopyrum cymosum

Abstract The medical and healthcare value of Fagopyrum cymosum is widely acknowledged.However， the systematic evaluation and conservation of its germplasm resources face challenges due to a lack of molecular tools.SSR markers， crucial for assessing plant diversity， identifying species， and mapping genes， offer a solution.This study explored the distribution of SSR loci within the root transcriptomes of Fagopyrum cymosum to develop valuable SSR markers.Krait software was utilized to analyze 46 923 Unigene sequences，identifying 1 961 SSR loci across 1 783 Unigenes， indicating a 3.80% occurrence rate with an average spacing of 1 per 17.00 kb.Trinucleotide repeats emerged as the predominant form， accounting for 54.92%， overshadowing mononucleotide （23.36%） and dinucleotide （10.76%） repeats.Among 104 distinct repeat motifs， A/T motifs were the most common at" "23.10%， followed by AAG/CTT （16.32%） and AG/CT （5.61%）.The synthesis of 115 SSR primer pairs led to polymorphic screening across 12 Fagopyrum cymosum germplasm samples， resulting in 98 pairs （85.2%） amplifying expected bands and 36 pairs exhibiting polymorphism.The average allelic variation detected by a single SSR primer was 3.83， with polymorphic information content （PIC） ranging from 0.15 to 0.96， averaging 0.53.Genetic similarity coefficients among the 12 analyzed" Fagopyrum cymosum germplasms ranged from 0.47 to 0.76， with a mean of 0.55， demonstrating notable genetic diversity.This study not only identifies SSR markers within the root transcriptome of Fagopyrum cymosum but also significantly enriches the repository of molecular markers for comprehensive genetic diversity studies， species identification， and the investigation of significant trait genetic mechanisms.This foundation supports the advancement of molecular breeding research in Fagopyrum cymosum.

Key words Fagopyrum cymosum germplasms; Transcriptome; SSR molecular marker; Cluster analysis