电子束辐照对小麦幼苗生长、生理特性及相关基因表达的影响

摘 要 为了探讨电子束辐照对‘普冰151’小麦幼苗生理及相关基因表达的影响，采用150 Gy、250 Gy和350 Gy加速器电子束辐照处理小麦干种子，测定不同辐照剂量处理对小麦幼苗株高、根长等生长特性以及相关生理特性，分析光合和抗氧化酶相关基因的表达差异。结果表明：随着辐照剂量增加，小麦幼苗的苗高、根长、生物量均降低，与对照相比，250、350 Gy处理幼苗生长受到显著抑制（Plt;0.05）；随着辐照剂量的升高，抗氧化酶活性均呈先升后降变化趋势，150、250 Gy处理显著提高 SOD和CAT活性（Plt;0.05），低中剂量的辐照有促进保护酶活性增加的作用；不同辐照处理均显著降低了叶片叶绿素a含量和最大光能转换效率值（Fv/Fm）；随着辐照剂量的提高，叶片超氧阴离子（O-·2）、MDA含量和质膜透性增加，说明辐照剂量增高引起活性氧代谢失调；与对照组相比，辐照处理下光合相关基因 TaPEPC-5、 TaPPDK-1、TaMDH-7、TaRuBisco-2、TaNADP-ME-1表达有所上调，可能与调动光合能力有关。150、250 Gy辐照处理明显提高了小麦叶片SOD、CAT活性以及TaSOD、TaPOD、TaCAT基因的表达水平，说明中高剂量有提高抗氧化的作用。

关键词 高能电子束；诱变育种；光合基因；抗氧化酶

小麦是中国主要的粮食作物之一，品种改良是提高我国小麦产量的关键[1]。物理诱变育种是其中最便捷的方法[2]，辐射诱变是培育新品种和创制新种质的有效途径之一[3-4]。辐射诱变育种通常是利用γ射线、激光、离子束等对植物体进行空间诱变，从而产生遗传变异[5]。其中60Co-γ射线是辐照诱变育种中应用最广的一种方法，可在较短时间内培育出新品种。

电子束辐照技术从上世纪90年代才广泛受到人们的关注，该技术辐照成本低、效率高、易于控制、不产生放射性废物[6-8]，已经成为理想的γ射线辐照的替代技术[9]，目前发展迅猛，有很广阔的发展前景[10]。该方法已成功应用于农产品贮藏与保鲜，以提高食品质量和安全性[11-12]。电子束辐照还可以用于小麦种子进行预播前的种子消毒以优化播种[13]。

电子束辐照在植物育种中的研究报道较少，对不同辐照剂量对小麦生长发育过程的影响和适宜剂量不太明确。 本研究采用电子加速器所产生的电子射线辐射处理小麦种子，分析不同剂量辐照对水培小麦幼苗叶片生长特性、生理特性及相关基因表达的影响，筛选合适的辐照剂量，为阐明电子束辐照诱变机理及农作物物理诱变育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 辐照处理 试验选用小麦品种为‘普冰151’，由西北农林科技大学农学院张正茂教授提供。挑选籽粒饱满、大小均匀的小麦种子分为4组，每组600 g，处理组使用10 MeV电子直线加速器（DZ型，中广核辐照技术有限公司）进行辐照处理，辐照剂量分别为0、150、250和350 Gy，剂量率为1 Gy·min-1，其中0 Gy为对照组（未辐照）。

1.1.2 水培小麦幼苗 将处理后的种子洗净后置于垫有滤纸的培养皿中，放置在培养箱内发芽，前3 d设置黑暗环境，待种子发芽约1 cm时，将其移至光照培养箱（光照强度：80 μmol·m-2·s-1，温度：22 ℃，光照周期：16 h光照/8 h黑暗），用1/2 Hoagland营养液培养，每2 d更换1次培养液。

1.2 试验方法

1.2.1 幼苗生长特性的测定 水培第14天测量小麦株高、根长、鲜质量及地上、地下生物量。每个指标随机选取10株幼苗用于统计分析。

1.2.2 生理指标的测定 叶绿素含量测定采用96%乙醇研磨比色法；丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸比色法；超氧阴离子（O-·2）测定采用比色法；过氧化物酶（POD）含量测定采用愈创木酚氧化法；超氧化物歧化酶（SOD）含量测定采用 NBT光化还原法；过氧化氢酶（CAT）含量测定采用紫外吸收法；质膜透性测定采用电导法。以上测定方法均参照高俊凤[13]主编的《植物生理学实验指导》 ，每个处理设3个生物学重复。

叶绿素荧光测定：将小麦放到黑暗条件下处理至少30 min，后用弱光（小于0.1 μmol·m-2·s-1）照射，使用基础型调制叶绿素荧光仪（Junior-PAM，德国）测定单个小麦叶片的初始荧光（F0），然后照射饱和脉冲光（10 000 μmol·m-2·s-1）0.8 s，测定暗适应最大荧光（Fm）。每个处理测定3个叶片，每个叶片重复测3次，取平均值。

1.2.3 光合相关基因及抗氧化酶相关基因表达分析 取14 d龄的小麦叶片，加入液氮研磨成粉，按照TRIzol试剂盒说明提取总RNA，测量OD值以确定总RNA浓度，-80" ℃保存，备用。之后以RNA为模板，按照反转录试剂盒说明进行反转录得到cDNA，参照 PrimeScriptTM RT reagent Kit 试剂盒（TaKaRa，Dalian，China）说明书进行反转录，反转录后于-20 ℃保存，备用。

利用Primer 3Plus设计光合作用相关基因（ TaPEPC-5、 TaPPDK-1、TaMDH-7、TaNADP-ME-1、TaRuBisco-2、TaPsb27）和抗氧化酶相关基因（TaSOD、TaPOD、TaCAT）引物（表1），以TaActin为内参基因进行实时荧光定量PCR。反应体系及反应条件参照 SYBR Premix Ex TaqTMII 试剂盒（TaKaRa，Dalian，China）说明书，采用实时定量PCR仪（CFX96，BioRad，Hercules，California，USA）进行荧光实时定量PCR测定。

每个样品做3个生物学重复和3个技术性重复。Green I与DNA双链结合后可以发出荧光，通过检测PCR反应结果中的荧光信号强度，使用 Microsoft Office Excel 2013 进行分析，利用 2-△△CT法分析目的基因的表达情况。

1.3 统计分析

数据首先使用Microsoft Office Excel 2013进行分析，用SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析（ ANOVA），采用*Plt;0.05、**Plt; "0.01、***Plt;0.001和****Plt;0.000 1的t检验方法进行显著性水平分析，采用Graphpad prism 7.0绘图。

2 结果与分析

2.1 不同剂量辐照处理对小麦幼苗生长发育特性的影响

随着辐照剂量增加，幼苗株高和根长都呈下降趋势（图1）。与对照组相比，150、250、350 Gy处理下苗高分别降低10.570%、18.400%和 "23.003%；根长分别降低1.209%、12.808%和 "13.089%。与对照组相比，250 Gy和350 Gy处理对苗长、根长、地下和地上生物量的抑制作用都达到显著水平（Plt;0.05），而且剂量越高对小麦幼苗地上生物量的影响越大，说明辐照主要是通过抑制地上生物量而对小麦生长产生了抑制作用。

2.2 不同剂量辐照处理对小麦幼苗叶绿素和O-·2含量的影响

随着辐照剂量增大，与对照组相比，150、250、350 Gy 3组处理的叶片中叶绿素a含量都显著降低（Plt;0.05），分别降低9.65%、14.79%、 "18.40%（图2）。随着辐照剂量增加，幼苗叶片中O-·2含量显著上升（Plt;0.05），辐照剂量越高组织内活性氧物质增加越多。

2.3 不同剂量辐照处理对小麦幼苗MDA含量、质膜透性的影响

随着辐照剂量增加，MDA含量也呈上升变化，但MDA含量只有350 Gy 辐照处理组较对照组有显著的增加（Plt;0.05），说明辐照剂量增加导致叶片的活性氧物质的增加，进而引起膜脂过氧化，使MDA含量升高。

随着辐照剂量增加，叶片质膜透性逐渐增大。与对照组相比，250、350 Gy处理的质膜透性都到达到显著增加水平（Plt;0.05），150 Gy处理组电导率升高21.703%，但未达到显著水平。结果表明辐照剂量升高会导致质膜透性增加，在350 Gy剂量范围内，辐照剂量越高，细胞质膜破坏越严重（图3）。

2.4 不同剂量辐照处理对小麦幼苗保护酶活性及基因表达的影响

图4表明，随着辐照剂量升高，小麦叶片中SOD、POD、CAT活性均呈先升高后降低的趋势，对应酶基因表达也呈现先升高后降的变化趋势。150、250 Gy辐照处理明显提高了小麦叶片SOD、CAT活性以及TaSOD、TaPOD、TaCAT基因的表达水平，而高辐照剂量无促进作用，表明在150、250 Gy辐照处理下小麦抗逆境胁迫能力有所增强，低辐照剂量促进SOD、POD、CAT合成，有利于提高活性氧的清除能力。低辐照剂量下，3种抗氧化酶基因的相对表达水平升高，促进作物产生抗氧化酶，以便抵抗活性氧，提高作物抗胁迫能力；高辐照剂量下，相对表达水平下降，小麦抗胁迫能力下降。

2.5 不同剂量辐照处理对小麦幼苗叶绿素荧光特性的影响

叶绿素荧光参数最大光能转换效率值 "Fv/Fm反映了植物的潜在最大光合能力。由表2表明，辐照剂量增加，F0和Fv/Fm都呈下降的变化趋势，150 Gy处理下Fm升高，250 Gy和350 Gy处理下均显著降低，说明辐照剂量越高，对叶片光合能力的影响越大，植物受到的伤害程度 "越高。

2.6 不同剂量辐照处理对小麦光合相关基因表达的影响

在250、350 Gy辐照剂量下 TaPEPC-5、 "TaPPDK-1均明显上调，与对照组相比，两个基因在250 Gy处理下分别上调86.187%、 "108.300%，在350 Gy处理下分别上调 "140.284%、130.884%。 "TaMDH-7在150、250 Gy辐照剂量下无明显变化，在350 Gy下明显上调。 "TaNADP-ME-1、 "TaRuBisco-2的表达量随辐照剂量升高均呈先上升后降低趋势， "TaNADP-ME-1在250 Gy处理下表达量达到最大。 "TaRuBisco-2在150 Gy处理下表达量达到最大。与对照组相比，3个处理组的 "TaNADP-ME-1分别上调 "53.180%、152.484%、103.970%，在150、250 Gy处理下， "TaRuBisco-2分别上调 "95.939%、 "51.347%，而在350 Gy处理下， "TaRuBisco-2下调15.735%。与对照组相比，250 Gy处理下的TaPsb27下调33.130%，而150 Gy和350 Gy处理组无明显变化（图5）。

3 讨" 论

本研究中随着辐照剂量的升高，小麦幼苗的苗高、根长、鲜质量、生物量均下降，剂量越高生长受到抑制就越明显，与王泽港等[14]在γ辐照处理小麦种子和陈金跃等[15]在γ辐照处理玉米种子的结果相似。李春牛等[16]采用60Co-γ处理茉莉花果实，结果表明高剂量辐照可使茉莉花叶片中抗氧化酶活性下降；崔玲艳等[17]采用UV-B对马铃薯进行辐照，结果表明适当增加辐射剂量提高了植株抗氧化酶活性。本研究发现150、250 Gy处理下抗氧化酶活性提高，而在350 Gy下抗氧化

酶活性有所下降，与崔玲艳的结果相似。梁俊青[18]报道辐照处理小麦的保护酶呈现先增后降的变化，也与本研究结果一致。电子束照射和60Co-γ照射对植物的诱变效果因植物种类、照射剂量和照射方式等因素而异，需要根据实际应用和研究目的来确定具体的照射方法和照射剂量。无论采用何种照射方法，诱变育种都需要经过多轮筛选和淘汰，以获得符合要求的变异新品种。

叶绿素荧光特性被用于植物光合作用的研究，Fv/Fm值可以反映植物的光合能力，作为研究作物生理状况和受胁迫程度等的间接方法[19]。张娅等[20]用钠盐或钙盐单独处理小麦幼苗叶片，Fv/Fm值均显著下降，而钠盐和钙盐结合处理有缓解Fv/Fm值下降的作用。本研究发现辐照剂量升高，Fv/Fm值明显下低，说明辐照剂量越高，植物所受胁迫越严重，与活性氧代谢失调引起的膜损伤和光合系统受损相关。

辐照处理下小麦叶片中 TaPEPC-5、 TaPPDK-1、 "TaMDH-7、 "TaNADP-ME-1、 "TaRuBisco-2的表达水平均出现不同程度的上调，但是辐照处理引起小麦幼苗生长能力减弱，O-·2含量增加、膜受损等变化，这些上调的光合相关基因可能与胁迫后光合能力补偿以及光合复合体保护机制有关。但是由于辐照处理会导致不可逆的损伤，最终引起小麦的生长能力减弱和光合能力下降。因此，在辐射诱变育种中，筛选适宜的辐照剂量对于增加诱变频率具有重要的理论与实践意义。在本试验选取的辐照剂量中，250 Gy可作为适宜的电子加速器源射线辐照小麦诱变育种的候选参考剂量。

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Effects of Electron Beam Irradiation on Wheat Growth Vigor，Photosynthetic Characteristics，and Photosynthesis and Antioxidant-related Genes’" Expression

Abstract Food safety faces significant challenges due to the rapid growth of human population，the reducion of agriculture land area，and climate change. Irradiation mutagenesis methods，such as those usingγ rays，laser，or ion beams，provide promising techniques for crop breeding.These methods are highly efficient，cost-effective，widely applicable and environmentally-friendly.In this study，electron beam irradiation was applied to wheat seeds to investigate its effects on plant growth vigor，physiology and photosynthetic and antioxidant-related gene expressions，and to determine the optimal dose of irradiation for wheat breading.The dry seeds of wheat variety ‘Pubing 151’ was exposed to three different doses of electron beam irradiation-150 Gy，250 Gy and 350 Gy by using a 10 MeV electron linac，with non-irradiated seeds as control. The effects of different irradiation doses on the growth characteristics of hydroponic wheat seedlings，such as plant height，root length，biomass，were analyzed." Chlorophyll fluorescence，，malondialdehyde（MDA） content，electrical conductivity，superoxide anion（O-·2）content，superoxide dismutase （SOD） activity，the Catalase （CAT） activity and peroxidase （POD） activity were also measured. The results showed that the seedling height，root length，biomass of wheat seedlings decreased with the increasing irradiation dose，and the growth of wheat seedlings treated with 250 Gy，and 350 Gy was inhibited significantly compared with the control seedlings （Plt;0.05）." The antioxidant enzyme activities were activated by low or middle strength irradiation. For instance，the activities of SOD and CAT in 150 Gy and 250 Gy treatments were significantly higher than the control and 350 Gy treatments （Plt;0.05），indicating that low and middle dose irradiation could increase the expression and activity of protective enzyme genes. The content of chlorophyll a and the maximum light energy conversion efficiency （Fv/Fm） significantly decreased by irradiation treatments. The content of MDA and O-·2，and the permeability of plasma membrane increased with the irradiation dose，indicating that electron beam irradiation caused the metabolic disorder related to active oxygen species. Compared with the control group，electron beam irradiation up-regulated the photosynthesis-related genes，such as "TaPEPC-5， TaPPDK-1， TaMDH-7， TaRuBisco-2， TaNADP-ME-1.This up-regulation may be related to the compensatory photosynthetic ability and the protective activity of photosynthetic apparatus.In conclusion，electron beam irradiation significantly affects the growth vigor，physiological characteristics，and expression of photosynthesis and antioxidant-related genes in wheat. High-dose irradiation not only inhibits growth and photosynthesis activity but also causes metabolic disorder involving reactive oxygen species. Therefore，optimizing radiation dose is both theoretically and practically necessary for effective radiation mutagenesis breading. Among the three doses applied in this study，250 Gy is highly recommended for wheat mutagenesis breeding.

Key words Electron beam irradiation; Mutagenesis breeding; Photosynthetic gene; Antioxidant enzyme