基于祖先性状演化和叶绿体基因组的马先蒿形态特征分析

摘要：为了探究马先蒿属（Pedicularis）植物的关键形态特征，为其辨别与鉴定提供参考。本研究采用祖先性状演化推测Pedicularis最保守的形态特征，并基于10种马先蒿属植物完整叶绿体基因组，探讨马先蒿属植物形态的变异原因。结果表明基于花序类型性状演化分析和系统发育分析支持马先蒿属隶属于列当科（Orobanchaceae）的分类地位。叶绿体基因组变异分析找到Pi值较高的7个变异基因和6个变异区域，且多分布在大单拷贝区（LSC）和小单拷贝区（SSC）区。反向重复区（IRs）的rps19和ycf1基因跨越了区域边界造成IRs基因丢失。因此，总状花序是马先蒿属最为保守的形态特征，可作为其分类依据。而IRs的扩张导致IRs基因丢失的同时提高LSC和SSC的多样性，导致二者为高变异区，可能是马先蒿属植物形态变异的原因之一。这些结果将促进马先蒿属植物系统分类和种间进化的研究。

关键词：马先蒿属；叶绿体基因组；系统发育；祖先形态

中图分类号：Q732""" 文献标识码：A""""" 文章编号：1007-0435（2024）07-2039-15

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.005

引用格式：

王" 涛， 徐成体， 唐楚煜，等.基于祖先性状演化和叶绿体基因组的马先蒿形态特征分析［J］.草地学报，2024，32（7）：2039-2053

WANG Tao， XU Cheng-ti， TANG Chu-yu，et al.Morphological Analysis of Pedicularis Based on Ancestral Character Evolution and Chloroplast Genome［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2039-2053

收稿日期：2023-12-12；修回日期：2024-03-01

基金项目：国家自然科学基金（32360349）资助

作者简介：

王涛（1995-），男，汉族，安徽淮北人，博士研究生，主要从事草学研究，E-mail：13085500761@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：yulingli2000@163.com

Morphological Analysis of Pedicularis Based on Ancestral Character

Evolution and Chloroplast Genome

WANG Tao， XU Cheng-ti， TANG Chu-yu， CAO Zheng-fei， XIAO Meng-jun，

HE Min， LI Xiu-zhang， LI Yu-ling*

（Key Laboratory of the Alpine Grassland Ecology in the Three Rivers Region， Ministry of Education，

Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：To explore the key morphological characteristics of Pedicularis plants and to provide reference for their identification，the most conserved morphological characteristics of Pedicularis were speculated by the evolution of ancestral traits，and the reasons for the morphological variation of Pedicularis were discussed based on the complete chloroplast genomes of 10 species of Pedicularis in this study. The results showed that the evolution analysis and phylogenetic analysis based on inflorescence type traits supported the taxonomic status of Pedicularis belonging to Orobanchaceae. The chloroplast genome variation analysis found 7 variable genes and 6 variable regions with high Pi values，and most of them were distributed in the LSC and SSC. The rps19 and ycf1 genes in the IRs crossed the region boundary and caused the loss of IRs genes. Therefore，raceme is the most conserved morphological feature of Pedicularis，which can be used as the basis for its classification. The expansion of IRs leads to the loss of IRs genes and the diversity of LSC and SSC，which leads to the high variation area of LSC and SSC，which may be one of the reasons for the morphological variation of Pedicularis. These results will promote the study of systematic classification and interspecific evolution of Pedicularis.

Key words：Pedicularis;Chloroplast genome;Phylogeny；Ancestral morphology

马先蒿属植物由于其自然生殖隔离和自身快速辐射分化繁衍方式的双重影响，该属植物分化强烈、形态变异复杂，且栖息地和物种起源中心较多且差异较大［1］，导致该属植物资源丰富，种类繁多，虽然为其遗传育种提供了极丰富的种质资源，但也限制了其的分类和系统学研究。全球约有568个已确认的种，335个同义种和450个未被确定的种，亚洲具有最高的生物多样性，约有350种，大部分分布在中国及其周边国家，其中271种为特有种，83种分布于印度，欧洲国家仅约有70种［3］。

基于叶绿体基因组证据阐明物种的系统发育地位，重建物种类群的系统发育是分类学和系统学研究的永恒主题之一，叶绿体全基因组数据在此过程中发挥重要作用［4］。大多数高等植物叶绿体基因组呈四聚体结构，由一个大单拷贝区域（Large single copy region，LSC）、一个小单拷贝区域（Small single copy region，SSC）和一对反向重复区域（Inverted repeat，IRs）组成［5］。植物叶绿体内拥有独立的基因组合遗传系统即单系遗传，且具有序列短小（120～160 kb）、基因结构相对稳定、含有保守序列区域（matK、rbcL、trnH-psbA和trnL-F）的优点［6-7］，在植物系统学研究中得到广泛应用。因此，一般认为叶绿体基因组结构和含量相对稳定和保守［8］，但研究发现马先蒿属叶绿体基因组发生了强烈的IR扩增导致序列区域性的丢失和转移［9］。在轮叶马先蒿和碎米蕨叶马先蒿的叶绿体基因组中，除了ndhB基因之外，几乎所有的ndh基因都丢失了，rps16基因也发生了丢失现象但仅在轮叶马先蒿中丢失［10-11］。在过去的5年中，在阿拉善马先蒿中观察到由于ndh基因缺失导致叶绿体基因组长度减少的现象［12］。相似的报道均指出马先蒿属植物的叶绿体基因组异于传统被子植物的叶绿体基因组表现出高度的变异性［13］。这意味着马先蒿属植物形态特征的变异可能与叶绿体基因组存在某种关联。

马先蒿属植物在漫长的进化过程中，形态特征受栖息地气候特征的影响发生了剧烈改变，相对的其分类地位也经历了多次改变。传统分类学依据该属植物模式种马先蒿在形态学上的特点（叶呈互生、对生或轮生，全缘或羽状分裂顶生的穗状花序或总状花序；花萼管状，花药包藏在盔瓣中，两两相对，基部有时具刺尖［14］将其与毛麝香属、黑草属和火焰草属等隶属于玄参科［15］，并在该属下划分无枝群、轮枝群和马先蒿群等13个群［16］。而，随着该属更多新种和亚种叶绿体基因组证据的相继报道，借助于单核苷酸多肽、短串联重复序列和遗传多态性分析进行个体识别鉴定，学者们认为马先蒿属应隶属于列当科［17］，也是目前学者们广泛采用的分类地位。但可以预见的是已有的形态学分类法和分子生物学分类法对于马先蒿属的分类出现分歧，并且学者们并未对其形态做出关键描述，这导致马先蒿属植物的形态鉴定成为野外工作的难点。

因此，已有的形态学特征已经不能准确的鉴定马先蒿属植物的分类，筛选该属新的形态学特征筛选迫在眉睫，也是该属植物的分类和鉴定的急切需要。本研究采用祖先性状演替分析了该属保守的形态学特征，并与已报道的马先蒿属植物叶绿体全基因组进行对比分析，探究该属植物形态特征改变的原因。

1" 材料与方法

1.1" 叶绿体基因组获取

基于青海大学青海省畜牧兽医科学院冬虫夏草研究室已经组装完成的中国马先蒿和甘肃马先蒿序列（已投稿），并从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下载相关物种序列得到全部的叶绿体基因组数据用于后续分析（表1）。

1.2" 祖先性状演化和系统发育分析

根据中国植物志Flora of China （FOC）（http：//www.iplant.cn/info/Oryza%20 glaberrima？t=foc）的物种描述，对表1中68种植物形态性状进行分类。选取具有特殊分类意义的4种形态学性状，包括花序类型、花序着生位置和花叶类型进行统计与分析。利用性状演化工具Mesquite v3.61中贝叶斯法快速构建祖先性状演化树，从而推断马先蒿属祖先性状及演化式样［18］。从NCBI上收集马先蒿属、玄参科和列当科物种，以稻属为外群，共68个物种进行系统进化分析。将以上68个物种叶绿体基因组数据导入Mega软件进行序列对比［19］，完成后计算最佳拟合核苷酸模型并采用最大似然法构建系统发育树，参数设置为Models = GTR+GAMMA，Bootstrap=1 000获得系统发育树各分支的靴带支持率（Bootstrap values，BS）和种间支持率。

1.3" 叶绿体基因组变异性分析

使用MAFFT软件［20］对相应的基因组序列进行对齐。利用DnaSP v6.0［6］软件进行窗口长500 bp、步长 120 bp的滑动窗口分析，计算10个马先蒿属植物叶绿体基因组的核苷酸多态性（Pi）。使用mVISTA程序［21］，在ShuffleLAGAN模式下对10个马先蒿属植物的叶绿体基因组进行序列相似性分析并可视化。中国马先蒿被选为参考基因组。使用Mauve软件［22］对马先蒿属植物序列和基因进行共线性分析，并进行可视化。使用MISA软件，分别检测所有物种叶绿体基因组中的简单重复序列参数设置均为单核苷酸单元、二核核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复分别设置为10，5，4，3，3和3，并分析SSRs的类型、数量和分布模式。

1.4" 叶绿体全基因组比较和IR/SSC边界收缩和扩张分析

叶绿体基因组变化重要来源之一就是IR/SC边界变化［24］，利用mVISTA软件在LAGAN模型下对马先蒿属植物叶绿体全基因组进行比较分析［25］。利用IRscope在线软件（https：//irscope.shinyapps.io/irapp/） 绘制10个植物种间叶绿体基因组的IR/SC边界对比图，分析马先蒿属植物IR/SC，IRs区收缩与扩张特征［26］。

2" 结果与分析

2.1" 形态学祖先性状演化分析

2.1.1" 花序类型" 花序类型的形态学祖先性状演化分析指示（图1），马先蒿属植物祖先状态的花序类型最可能为总状花序（55.58%）。总状花序为列当科植物的主要花序类型，聚伞花序则为玄参科植物的主要花序类型。在选择的68种植物中，研究发现从它们共同的祖先开始，花序分化为聚伞花序的玄参科分支1和总状花序的列当科分支2。在分支2内花序类型至少经过节点1、节点2和节点3，3次分化过程。节点1和节点2稳定遗传了祖先的总状花序并未产生分化。然而节点3的马先蒿属植物在遗传祖先总状花序的同时也分化出穗状、亚头状、簇生状、穗状或亚头状和穗状或总状5种花序类型，其中仍以总状花序（58.83%）最多为该属稳定遗传的性状。这表明马先蒿属植物的花序类型在种间差异显著分化强烈但总体上仍为总状花序。对比发现，列当科分支的祖先花序类型为总状花序与马先蒿属植物的花序类型更为相似。因此，总状花序类型的形态学祖先性状演化分析结果符合马先蒿属植物隶属于列当科的现代分子生物学观点，可以作为马先蒿属植物形态分类的形态特征之一。

2.1.2" 花序位置" 从花序位置看（图2），马先蒿属植物祖先状态的花序位置最可能为腋生（62.40%）。其祖先的进化过程指示，花序位置主要分化为分支1的玄参科和分支2的列当科，且玄参科和玄参科均以腋生为主。在列当科分支中，至少有节点1和节点2，2次明显的分化过程。在节点1分化出花序位置顶生或腋生，在节点2分化出花序位置顶生。这表明马先蒿属植物花序位置为腋生与列当科或玄参科植物均较为相似。因此本研究认为随着马先蒿属植物不断的变异与进化，花序位置的形态学特征已不能将马先蒿属植物有效的分类。

2.1.3" 花叶类型" 分析花叶类型（图3），显而易见的是马先蒿属植物祖先状态的花叶类型最可能为互生（65.28%）。其祖先的进化过程指示，花叶类型主要分化为分支1的玄参科和分支2的列当科，且均以互生为主。在列当科分支中，至少有节点1、节点2和节点3，3次明显的分化过程。在节点1分化出对生的花叶类型，且这种花叶类型被马先蒿属植物遗传得到。在节点3的进化过程中，轮叶马先蒿又分化出轮生的花叶类型，这也是马先蒿属植物分化强烈的形态学特征之一。因此，马先蒿属植物最可能互生花叶类型，与列当科或玄参科植物无显著差异。基于此，研究认为花叶类型已不能将马先蒿属植物从玄参科和列当科中完成鉴定，不适用于马先蒿属的形态学特征分类。

2.1.4" 苞片形态" 苞片形态演化历史的追溯显示（图4），该特征的祖先状态并不明显，支持率最高的为卵形至披针形（34.30%），其次为卵形至长圆形（28.92%）和披针形（20.53%），剩余 2种均小于10%。在选择的17种马先蒿属植物中，29.4%的植物苞片呈线形，35.30%的植物苞片呈卵形至披针形，35.30%的植物苞片呈卵形至长圆形。而处于分支1的玄参科植物卵形至披针形苞片，分支2的列当科更多的倾向于披针形苞片。此时，马先蒿属植物与玄参科的相似度较列当科更高。因此，苞片形态的祖先演化分析，其结果更支持马先蒿属隶属于玄参科的分类结果。总体分析，苞片类型在种间分化变异显著，其祖先特征难以追溯，不是马先蒿属有效的形态学分类依据。

2.2" 系统基因组学分析

基于最大似然法的系统发育分析作者发现（图5），17个马先蒿属物种分为 8支。从上往下，第一支、第五支和第六支仅由一种物种组成，分别为：藓生马先蒿和甘肃马先蒿；第二支由东俄洛马先蒿、粗野马先蒿和山西马先蒿组成；第三支由欧亚马先蒿、中国马先蒿、黑马先蒿和头花马先蒿组成；第四支由全裂马先蒿和返顾马先蒿组成；第六支由阿拉善马先蒿和长花马先蒿组成；第八支由轮叶马先蒿组成。第七支的碎米蕨叶马先蒿最为特殊，它已脱离马先蒿属，可能是更为古老的物种。因此，本研究认为甘肃马先蒿和中国马先蒿隶属于马先蒿属并分别与P. hallaisanensis、黑马先蒿亲缘关系最近呈姊妹关系。其次，系统基因组学分析支持总状花序类型为马先蒿属植物祖先性状的结论。

2.3" 马先蒿属植物叶绿体基因组变异分析

2.3.1" 马先蒿属植物叶绿体基因组结构特征" 中国马先蒿叶绿体全基因序列拥有120个基因，包括75个蛋白编码基因（Protein-coding genes，PCGs）、37个转运RNA（Transfer RNA，tRNA）基因和8个核糖体RNA（Ribosomal RNA，rRNA）基因（表2）。LSC区包含60个PCGs，22个tRNA，SSC区包含5个PCGs和1个tRNA，IRs区包含10个PCGs，14个tRNA和所有的rRNA基因。甘肃马先蒿叶绿体全基因组编码116个基因，包括72 个蛋白编码基因、36个tRNA基因和8个rRNA基因（表2）。LSC区包含58个PCGs，21个tRNA，SSC区包含4个PCGs和1个tRNA，IRs区包含10个PCGs，14个tRNA和所有的rRNA基因。目前已发表的马先蒿属植物叶绿体基因组编码的基因数量范围为102～109个，PCGs约为69～74个，tRNA基因约为30个，rRNA基因均为8个。不难发现，甘肃马先蒿和中国马先蒿叶绿体基因组在结构组织、基因含量和基因排序上与其它马先蒿属植物基本相似，并未发现明显的基因重排或倒置现象。

甘肃马先蒿和中国马先蒿叶绿体全基因组中GC含量分别为38.46%，38.51%。LSC区域中GC含量分别为36.43%和36.49%，SSC区域中GC含量分别为32.25%和32.60%，IRs区域中GC含量分别为43.53%和43.33%（表2）。然而，甘肃马先蒿和中国马先蒿叶绿体全基因和SSC区的GC偏倚普遍低于同属其它物种，SSC区bp长度也更短。这表明在自然进化过程中二者叶绿体全基因组在碱基替换上具有GC偏倚性即AT碱基倾向于被GC碱基替换，且这种GC偏倚可能与SSC区域的GC偏倚有关。对17种马先蒿属的对比分析，研究发现甘肃马先蒿和中国马先蒿丢失ccsA，ycf2两个PCGs基因（图6A），同时编码更多的tRNA基因（trnE-UUC，trnM-CAU和trnS-CGA）（图6B），而ndhD，ndhJ，ndhH，trnM-CAU和trnI-CAU等基因在物种间表现出不同程度的缺失，这暗示基因丢失在马先蒿属植物叶绿体基因组进化过程中似乎是一种普遍现象。

2.3.2" 重复结构和简单重复序列分析（Simple repeat sequence，SSR）" 在马先蒿属植物叶绿体基因组中，单核苷酸以A（Adenosine）和T（Thymine）含量最丰富；同时也导致其具有最丰富的AT和TA双核苷酸重复（图7A）。在甘肃马先蒿和中国马先蒿的叶绿体基因组中，分别找到40和36个SSRs，略低于马先蒿属其它植物（37～55个SSRs），且大部分马先蒿属植物都不具备CTAGAA、TAAGTA和TACTTA六核苷酸重复（图7A），只有黑马先蒿叶绿体基因组具有这一重复类型。这表明在马先蒿属植物的进化过程中，丢失长核苷酸重复序列是一种普遍现象。

此外，研究发现马先蒿属植物的SSRs在叶绿体基因组不同区域的分布喜好差异较大，多分布在SSC和LSC区（图7B）。比较马先蒿属17种植物SSRs类型和数量，发现均具有以下4种（单、双、三和四核苷酸）重复类型，但多核苷酸重复单元类型和含量在不同物种间差异较大（图7A和7C）。如：碎米蕨叶马先蒿具有最丰富的四核苷酸含量（11个）和多样性（9种：TTCT，TTTA，TTTC，TAAA，TAAT，ATAG，AAAC，AGAA和GAAA），但它的三核苷酸重复数量较少。这表明在马先蒿属植物进化过程中，个体SSRs丰富度和种类的改变较大，且LSC和SSC区为高突变区。

2.3.3" IR收缩和膨胀" 通过对马先蒿属10种植物叶绿体基因组的比较分析，其中P. ishidoyana的IR区最长为35 263 bp，黑马先蒿最短为24 302 bp，长度最大差异达到10 961 bp，较黑马先蒿增加了45.1%（表2），很显然马先蒿属植物叶绿体基因组IR存在显著扩张现象。其次，rps19基因穿过LSC/IRb边界，ycf1基因由于其在IR区的反向重复重复跨越了IRb/SSC和SSC/IRa边界，trnH则跨越了IRa/LSC边界。

在马先蒿属植物中，rps19基因序列大部分位于LSC区内，7～15 bp延伸至IRb区内，但碎米蕨叶马先蒿仅34 bp（12.18%）的rps19基因仍留在LSC区内，245 bp（87.82%）的基因延伸至IRb区内，这表明碎米蕨叶马先蒿IR区的扩张更加剧烈，近乎将整个rps19基因吞并。这一结论在IRa/LSC边界得到了验证，仅碎米蕨叶马先蒿的IRa区包含rps19基因，且大部分基因分布在IRa中，仅有3 bp仍留在LSC区中（图8）。trnH基因受IR区扩张的影响，也有不同长度（0～20 bp）的基因序列跨越了IRa/LSC边界。一个有趣的现象是ycf1基因在跨越SSC/IRb边界时，仅有3～106 bp仍留在SSC区内，大部分基因在IRb区内；相反的是在跨越SSC/IRa边界时大部分基因处于SSC区内，458～1 149 bp的ycfl基因序列延伸到IRa区。这说明受IR区扩张的影响ycf1基因对SSC/IRb和SSC/IRa边界的跨越程度不同，导致其分裂成两段基因分属于不同的区域。因此，马先蒿属植物叶绿体基因组中IR区的扩张对rps19和ycf1基因在不同植物上表现不同，促使马先蒿属植物叶绿体基因组表现出多样性和高变异性。

2.3.4" 叶绿体基因组核苷酸多样性和序列相似性分析" 为了衡量马先蒿属种群的多态性，分析物种和相关物种的遗传变异，以确定进化关系。本文对包含甘肃马先蒿和中国马先蒿等10个马先蒿属植物的叶绿体基因组序列多样性进行分析和比对，并以核苷酸变异性值（Pi）进行表示。结果发现：10个马先蒿属植物的Pi从0增加到0.156 7（图9），这表明马先蒿属植物核苷酸替换程度较大。而作者检测到的4个高变异区域（Pigt;0.1）分别为：ndhJ-trnV，ycf4-cemA，ndhE-nhdG和rpl32-trnL和1个高变异基因（ndhH）均分布在LSC和SSC区，IR区Pi值最低，LSC较高，SSC区最高。为了比较核苷酸序列的变异情况，本研究以中国马先蒿为参考，分析了叶绿体基因组序列的变异程度。其中，rpl22，rps19，rpl12，ycf1，trnH，psbA和ndhH等基因编码区和trnS-GGA，trnV-UAC，ndhJ-trnV，ycf4-cemA，ndhE-nhdG，rpl32-trnL等基因间区的非编码区都发生了不同程度的变异（图10）。综合核苷酸多样性和序列相似性发现，与IR区相比，LSC和SSC是高突变区，并且SSC区为变异程度更高。

3" 讨论

马先蒿属植物形态多样，生境复杂，且种类众多，为列当科最难分类的属之一［27］。自马先蒿属被创立，对于该属的分类范畴便一直存在争议，大量分类研究认为马先蒿属较重要的形态学特征之一就是花序类型，花序着生位置、花粉结构和叶序结构也被作为重要的形态学鉴定依据。在这种分类背景下，马先蒿属属于玄参科范畴的证据更充分。随着马先蒿属更多植物的发现，学者［29］在马先蒿属植物的形态上找到更多差异性，这虽然促使马先蒿属植物多样性的增加，但也使学者逐渐对Maximowicz对马先蒿属的分类地位产生怀疑。中国学者在其中做出重大贡献，首先是Li等［30］将花和叶作为营养性状将马先蒿属划分到叶根科。他给出的理由如下：花序顶生或穗状；花叶轮生或对生；叶分螺旋状，花腋生。Li等［31］对这种分类的理论依据是主要为受传粉媒介诱导的自然选择压力独立作用于植物上，在花性状上产生更大的同质性。这也成为当时马先蒿属主流的分类方法。但这不能很好的解释马先蒿属内植物间花和叶的巨大变异性。由此，邹同进化的观点提出［32］，花性状如管长是不可靠的分类标记，更影响注重花形态的是异质性，这极大的扩展了马先蒿属的分类区域。基于此，本文在进行马先蒿属植物花序类型的形态学祖先性状演化发现，马先蒿属植物至少有6种花序类型，其中占据主导是穗状花序和总装花序，与列当科众多物种相似度显著高于玄参科。YU［33］等人提出依据马先蒿属的总装花序类型应将其作为列当科的亚科之一。最后，本文的研究结果也认为总状花序类型应该作为马先蒿属的分类特征。

叶绿体基因组为环形结构，一般由LSC，IRb，SSC和IRa区构成［34］，因此形成LSC/IRb，IRb/SSC，SSC/IRa和IRa/LSC 4个边界。在IR区进行扩张和收缩时，处于边界位置的基因有可能进入临近的LSC和SSC区中，而IR区的这种变化在被子植物是一种普遍现象［35］。其次，叶绿体基因组核苷酸多样性形成最根本的原因在于核苷酸序列的变异，这可能是由不同植物叶绿体基因组的长度和编码基因数量差异导致的［36］。甘肃马先蒿和中国马先蒿编码的基因数量和顺序与其它马先蒿属植物并无显著差异，而在进化过程中丢失的基因种类和数量有所差异。综合比较发现叶绿体基因组中的LSC区域变异程度更大，进化行为更加活跃，这可能是因为它含有更少的保守基因和保守区域［37］。研究指出在叶绿体基因组中matK，rbcL，trnH-psbA和trnL-F被认为是保守序列，包含两个保守基因和两个内含子区域，能有效的反应物种的进化和变异程度［38］。而在本研究中作者发现，两个保守基因均分布在SSC和IR区，保守序列全分布在IR区中，这是导致IR区最为保守，LSC区成为叶绿体基因组结构变异热点区的原因之一。

对丢失的基因已有研究认为可能是假基因化，当它被认为是假基因时则表示它失去了完全自我复制的能力，不再能编码完整的蛋白质导致生物功能的缺失［39-40］。也有研究报道成为假基因时只是原本的功能基因受核苷酸缺失、突变和倒位影响失去活性，导致功能基因的缺失［41-42］。但它仍具有编码蛋白质的能力并在转录过程中通过与功能基因竞争性的结合miRNA从而调控功能基因的表达［43］，另外，它也可以产生内源性小干扰RNA抑制功能基因的表达［44］。这些分子水平的改变可能与马先蒿属植物的形态变化存在某种关联。在本研究中，研究发现马先蒿属植物碎米蕨叶马先蒿核苷酸序列较短但编码更多的PCGs，这可能与rps19基因的假基因化有关，这也解释了碎米蕨叶马先蒿叶绿体基因组的高度变异性（Pi=0.156 71）。弄清楚这一问题有助于帮助了解马先蒿属植物叶绿体基因组的进化过程。

17种马先蒿属植物核苷酸变异值变化较大（0＜Pi＜0.156 71），意味着在进化过程中马先蒿属植物核苷酸替换较为强烈［45］。本研究发现马先蒿属植物叶绿体基因组IR区Pi值远低于LSC和SSC区，SSRs也更多的分布在LSC和SSC区，多种证据表明IR区为保守区域，因为它的核苷酸序列具有反向重复的特性。而LSC和SSC为变异活跃区，丰富了马先蒿属植物叶绿体基因组的多样性。在本文中，从甘肃马先蒿和中国马先蒿中识别到多个高变异基因（rpl22，rps19，rpl12，ycf1，trnH，psbA和ndhH）和多个高变异区域（trnS-GGA，trnV-UAC，ndhJ-trnV，ycf4-cemA，ndhE-nhdG ，rpl32-trnL）。从边界基因来看，ycf1基因受IR区扩张的影响，只有一小部分序列（3～106 bp）跨越SSC/IRb边界，而大部分核苷酸序列跨越SSC/IRa边界进入SSC区，458～1 149 bp的核苷酸序列保留在IRa区。本文发现碎米蕨叶马先蒿的rps19基因的分布位置由LSC转移到IRb区，其花序类型也由总状花序变异为亚头状［46］。同时，受IR区扩张的影响trnH基因靠近并部分进入LSC区。这种结果说明，马先蒿属植物叶绿体基因数量、位置和种类发生不同程度的变异，间接引起植物形态的改变。近几年关于植物叶绿体基因组和线粒体基因组的研究中指出，植物在进化过程中叶绿体基因组和线粒体基因组发生了不同程度的碱基交换，trnH基因被认为可能参与了这一过程［47］。因此，trnH基因远离IRa区靠近LSC区可能是为了更加方便与线粒体基因组发生基因交流［48］。马先蒿属植物具有极高的变异性，对其叶绿体和线粒体间基因交流的研究将促进研究人员解开马先蒿属植物的进化之谜。马先蒿属种间叶绿体基因组差异非常明显，基于Pi的变异程度排序为SSC＞LSC＞IR，编码区也远比非编码区更为保守。因此，SSC区中的ycf1，trnV-UAC，ndhJ-trnV和ycf4-cemA共4个非编码区对于开发DNA条形码具有普遍的参考价值或者在马先蒿属植物未来的鉴定工作中发挥作用。其中ycf4-cemA的高突变性已经被证明并广泛的应用于地理谱系研究［49］，在杜鹃花属和风毛菊属系统进化分析中取得成功［［50-51］。

4" 结论

马先蒿属植物形态特征种间差异较大，总状花序的花序类型是马先蒿属植物更加保守的形态学特征，能有效的鉴别马先蒿属植物。IR区在马先蒿属不同物种间的差异性扩张导致rps19和ycf1基因跨越了区域边界造成IR区基因数量的丢失，同时促使LSC和SSC区出现4个高变异区（ndhJ-trnV、ycf4-cemA、ndhE-nhdG和rpl32-trnL）和1个高变异基因（ndhH），提高了马先蒿属植物叶绿体基因组的多样性，间接导致二者成为马先蒿属植物叶绿体基因组的高变异区。马先蒿属植物高变异性的叶绿体基因组可能是诱使马先蒿属植物形态发生剧烈改变的原因之一，但仍需要进一步的研究。

参考文献

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（责任编辑" 刘婷婷）