西维来司他钠对LPS诱导大鼠心肌细胞损伤的保护作用

【摘要】 目的：探讨西维来司他钠对脂多糖（LPS）诱导的大鼠心肌细胞损伤的保护作用。方法：海南省人民医院于2021年7月—2022年2月采用LPS建立大鼠H9c2心肌细胞损伤模型，分为对照组、LPS组、西维来司他钠+LPS组。其中西维来司他钠+LPS组分为高浓度组（LPS+high，10 μg/mL）、中浓度组（LPS+medium，4.8 μg/mL）、低浓度组（LPS+low，1.6 μg/mL）。LPS诱导心肌细胞损伤6 h后，检测心肌细胞上清液中的白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）的水平，对比各组上述因子水平的差异性。结果：与对照组比较，LPS组及低浓度组、中浓度组、高浓度组的IL-6、TNF-α、IL-1β、LDH水平均显著升高，SOD均下降，差异均有统计学意义（Plt;0.05）；与对照组比较，LPS组及低浓度组、中浓度组的MDA水平均显著升高（Plt;0.05）；与LPS组比较，低浓度组、中浓度组、高浓度组的IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA、LDH均下降，SOD水平均升高，差异均有统计学意义（Plt;0.05）。结论：西维来司他钠可减少LPS诱导的心肌细胞炎症因子和氧化应激因子的产生，减轻心肌细胞损伤，从而起到保护心肌细胞的作用。

【关键词】 脓毒症 脓毒症心肌病 炎症因子 氧化应激 西维来司他钠

Protective Effect of Sivelestat Sodium on LPS-induced Myocardial Cells Injury in Rats/GAO Xiaoxin， ZHANG Rujun， TIAN Jia， LEI Zhenlin， CHEN Qing’an. //Medical Innovation of China， 2024， 21（33）： -174

[Abstract] Objective： To investigate the protective effect of Sivelestat Sodium on lipopolysaccharide （LPS）-induced myocardial cells injury in rats. Method： The rat H9c2 myocardial cells injury model was established by LPS in Hainan General Hospital from July 2021 to February 2022， which were divided into control group， LPS group， and Sivelestat Sodium + LPS group. Among them， Sivelestat Sodium + LPS group were divided into high concentration group （LPS + high， 10 μg/mL）， medium concentration group （LPS + medium， 4.8 μg/mL） and low concentration group （LPS+low， 1.6 μg/mL）. The levels of interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， malondialdehyde （MDA）， lactate dehydrogenase （LDH） and superoxide dismutase （SOD） in the supernatant of myocardial cell were detected after 6 h of LPS-induced myocardial cell injury. The differences of the above factors in each group were compared. Result： Compared with control group， the levels of IL-6， TNF-α， IL-1β and LDH in LPS group and low concentration group， medium concentration group and high concentration group were significantly increased， and SOD were decreased， the differences were statistically significant （Plt;0.05）. Compared with control group， the levels of MDA in LPS group and low concentration group， medium concentration group and high concentration group were significantly increased， the differences were statistically significant （Plt;0.05）. Compared with LPS group， IL-6， TNF-α， IL-1β， MDA and LDH in low concentration group， medium concentration group and high concentration group were decreased， and SOD levels were increased， the differences were statistically significant （Plt;0.05）. Conclusion： Sivelestat Sodium can reduce the production of inflammatory factors and oxidative stress factors in LPS-induced induced myocardial cells， alleviate the injury of myocardial cells， and thus play a role in protecting myocardial cells.

[Key words] Sepsis Sepsis-induced cardiomyopathy Inflammatory factors Oxidative stress Sivelestat Sodium

First-author's address： Department of Intensive Medical Unit， Hainan General Hospital （Hainan Affiliated Hospital of Hainan Medical University）， Haikou 570311， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.33.041

脓毒症已成为临床上常见的危重症疾病，是导致重症监护病房患者死亡的主要原因之一。流行病学研究显示，目前全球脓毒症患者病死率仍处于较高的水平，约为20%[1]。随着对脓毒症的研究和深入了解，大多数学者认为，脓毒症是宿主对感染反应失调而出现的危及生命的多器官功能障碍[2]，常继发于全身各部位的感染、严重创伤、烧伤等，严重时可进展为脓毒症休克，具有较高的病死率[3]。脓毒症的发病机制非常复杂，至今仍未明确，可能是在致病因素的作用下导致宿主体内出现炎症反应级联风暴，诱发氧化应激损伤、免疫细胞凋亡和功能障碍等，最终导致机体出现多个器官、系统的功能衰竭甚至死亡。

心脏是脓毒症发生时容易累及的靶器官之一，有40%～60%的脓毒症患者在脓毒症基础上合并心功能障碍[4]，称为脓毒症心肌病（sepsis-induced cardiomyopathy，SIC），其是在感染基础上出现的心脏收缩和/或舒张功能障碍，表现为左右心室舒张和/或收缩功能障碍、左心室射血分数下降，为可逆性的心肌抑制性损伤[5]。SIC的发生加速了心血管系统的功能障碍，加重各器官的灌注不足和功能衰竭，导致脓毒症患者的死亡率明显升高，影响着脓毒症患者的生存和预后，亦是亟待解决的重要社会公共卫生问题[6]。目前对于该疾病的治疗主要是药物干预和各器官功能支持，包括使用增强心肌收缩力药物、有创或无创呼吸机支持及连续性血液滤过等，但是治疗效果、患者的疾病结局和预后并不乐观[7]。SIC的病理生理机制复杂多样，仍处于探索的阶段。目前研究表明，SIC可能是线粒体功能障碍、氧化应激、细胞凋亡等多种因素共同作用下发生的结果[8]。中性粒细胞弹性蛋白酶可促进血管内皮细胞损伤、增加血管通透性，导致心肌细胞损伤的发生。西维来司他钠作为该酶的抑制剂，是否可以通过抑制某些炎症因子、减少心肌细胞的损害，降低SIC的发生率，少有文献报道。本研究观察西维来司他钠对LPS诱导的大鼠心肌细胞损伤的保护作用，探索可能的机制，以期能够寻找到SIC有效的预防和治疗措施。

1 材料与方法

1.1 材料

研究时间为2021年7月—2022年2月。大鼠H9c2心肌细胞（武汉普诺赛公司），H9c2（2-1）细胞专用培养基（武汉普诺赛公司，CM-0089），注射用西维来司他钠（生产厂家：苏州二叶制药有限公司，上海汇伦江苏药业有限公司，批准文号：国药准字H20203093，规格：0.1 g）。ELISA试剂盒：白介素-6（IL-6，联科生物，EK306/3-96）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，联科生物，EK382/3-96）、白介素-1β（IL-1β，联科生物，EK301B/4-96）；丙二醛测定试剂盒（MDA，南京建成生物工程研究所，A003-1-2，TBA法）、乳酸脱氢酶测定试剂盒（LDH，南京建成生物工程研究所，A020-2-2，微板法）、超氧化物歧化酶测定试剂盒（SOD，南京建成生物工程研究所，A001-3-2，WST-1法）。本研究经海南省人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞培养 将大鼠H9c2心肌细胞在H9c2（2-1）细胞专用培养基中培养，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温密闭培养箱中进行培养，2～3 d更换培养基1次，每日在光学显微镜下观察细胞的形态和生长情况。待细胞生长密度达到传代要求后，给予0.25%胰蛋白酶消化，取消化完成的细胞进行离心，离心后将细胞分别接种于培养基中。

1.2.2 心肌细胞分组 将传代后正常生长的大鼠H9c2心肌细胞接种在96孔板上，调整细胞密度为1.0×105个/mL，分为5组：对照组、LPS组、西维来司他钠+LPS组，其中西维来司他钠+LPS组分为高浓度组（LPS+high，10 μg/mL）、中浓度组（LPS+medium， 4.8 μg/mL）和低浓度组（LPS+low，1.6 μg/mL）。每组细胞分为5个孔。西维来司他钠+LPS组细胞培养12 h后，先给予西维来司他钠溶液预处理2 h，然后用1.0 μg/mL LPS分别刺激诱导6 h。

1.2.3 生物学指标检测 LPS诱导6 h后（对照组无诱导）收集各组的心肌细胞上清液，离心后保存。检测各组心肌细胞上清液中的IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA、LDH、SOD浓度。

1.3 统计学处理

所有数据均采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用LSD-t检验，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 西维来司他钠对心肌细胞炎症因子的影响

与对照组比较，LPS组及低浓度组、中浓度组、高浓度组的炎症因子水平均明显升高（Plt;0.05）；与LPS组比较，低浓度组、中浓度组、高浓度组炎症因子水平逐渐下降（Plt;0.05）。见表1。

2.2 西维来司他钠对心肌细胞氧化应激的影响

与对照组比较，LPS组及低浓度组、中浓度组、高浓度组的LDH水平均显著升高，SOD均下降（Plt;0.05）；与对照组比较，LPS组及低浓度组、中浓度组的MDA水平均显著升高（Plt;0.05）；与LPS组比较，低浓度组、中浓度组、高浓度组的MDA和LDH逐渐下降，SOD均逐渐升高（Plt;0.05）。见表2。

3 讨论

随着全球医疗技术水平的快速发展，目前脓毒症的治疗措施和临床治疗效果已得到显著改善，但是脓毒症的发病率和死亡率仍居高不下，且对该病的认知仍然存有一定的局限。全球每年仍有数百万新增脓毒症患者，其中1/4以上的患者出现死亡，说明脓毒症是导致普通人群死亡和重大疾病发生的主要原因[9-10]。对于有糖尿病、慢性肾脏病、免疫性疾病等慢性疾病的患者，脓毒症造成的不良后果可能是致命性的。脓毒症主要是在感染的诱导下导致宿主体内出现多种细胞因子和炎症因子的释放[11]，包括大量的活性氧类物质、促炎症介质、肿瘤坏死因子等[12]，进而导致线粒体功能障碍、免疫功能异常、氧化应激损伤，从而出现多个器官或系统的功能障碍或衰竭[13]。脓毒症与心肌损伤的发生密切相关，并发SIC的患者，死亡率明显增加[14]。在脓毒症基础上引发的心功能障碍是可逆的病理过程[15]。有研究表明，线粒体损伤、功能缺陷导致的氧化应激增加是造成心肌损伤的重要原因之一[16]。研究发现，心肌细胞能量代谢异常是SIC发生的起始环节，包括心肌脂类和糖类代谢异常、线粒体损伤等[17]。SIC的主要临床表现是心功能障碍，往往会出现心输出量下降，甚至休克[18]，进一步导致全身各组织器官供血供氧不足，并且对液体复苏和儿茶酚胺类药物的反应明显下降[19]。

氧化应激反应主要是由于体内活性氧（ROS）和活性氮（RNS）产生过多，引起氧化与抗氧化作用的失衡。在过氧化起主导作用的情况下，机体会出现免疫细胞凋亡、免疫调节系统失衡，引发多器官功能的损伤[20]。ROS主要包括了O2-、OH-和H2O2等自由基。心肌细胞线粒体产生的ROS过量可抑制氧化磷酸化，使ATP生成减少，心肌细胞能量代谢异常，出现心肌抑制[21]。另外，氧化应激还可以通过ROS依赖的通路激活细胞凋亡途径，导致凋亡蛋白出现级联反应，促进心肌细胞的凋亡[22-23]，导致心功能障碍。研究发现，在采用盲肠穿孔法制作小鼠脓毒症模型时，氧化应激引起的脂质过氧化导致心肌细胞肌膜和肌层损伤[24]。此外，在脓毒症发生时，ROS使心肌细胞线粒体膜通透性发生改变而引起心肌细胞凋亡，进而导致心脏功能障碍[25]。内毒素LPS是常见的介导炎症的因子，在LPS的诱导下可使细胞出现炎症损伤从而出现氧化和抗氧化反应的失衡，可以模拟动物体内炎症反应机制，具有良好的效果[26]。

本研究发现经过LPS诱导的心肌细胞，可观察到IL-6、TNF-α、IL-1β水平均明显升高，但是在经过西维来司他钠进行干预处理后，血清中的炎症因子水平呈逐步下降的趋势，与药物剂量呈正相关。说明西维来司他钠可以降低LPS诱导心肌细胞损伤后炎症因子的分泌，降低心肌细胞损伤，对心肌细胞具有一定的保护作用。而在LPS的刺激下，心肌细胞产生的MDA和LDH均明显升高，SOD均下降，说明在炎症因子的刺激下细胞内出现氧化和抗氧化反应的失衡。在给予西维来司他钠处理后，抗氧化因子SOD水平均明显升高，氧化因子水平均下降，提示西维来司他钠可以通过减少氧化应激反应减轻炎症损伤从而达到保护心肌细胞的作用。但本研究存在一定的局限性，后期研究我们将通过结合临床和动物体内实验进一步探讨西维来司他钠对心肌细胞炎症损伤的保护作用的相关机制，以期寻找出相关的靶基因位点，为疾病的治疗提供更多的理论依据。

参考文献

[1]袁莹，邱建清，张洪光.脓毒性心肌病发病机制及其治疗的研究进展[J].中国医学创新，2023，20（20）：174-179.

[2] SINGER M，DEUTSCHMAN C S，SEYMOUR C W，et al.The third international consensus definitions for sepsis and septic shock （sepsis-3） [J].JAMA，2016，315（8）：801-810.

[3] VAN VUGHT L A，KLEIN KLOUWENBERG P M，SPITONI C，et al.Incidence， risk factors， and attributable mortality of secondary infections in the intensive care unit after admission for sepsis[J].JAMA，2016，315（14）：1469-1479.

[4] WANG X Y，DING Y，LI R，et al.N6-methyladenosine of Spi2a attenuates inflammation and sepsis-associated myocardial dysfunction in mice[J].Nat Commun，2023，14（1）：1185-1195.

[5] RAVIKUMAR N，SAYED M A，POONSUPH C J，et al.Septic cardiomyopathy： from basics to management choices[J].Curr Probl Cardiol，2021，46（4）：100767-100781.

[6] HOLLENBERG S M，SINGER M.Pathophysiology of sepsis-induced cardiomyopathy[J].Nat Rev Cardiol，2021，18（6）：424-434.

[7] L'HEUREUX M，STERNBERG M， BRATH L，et al.Sepsis-induced cardiomyopathy： a comprehensive review[J].Curr Cardiol Rep，2020，22（5）：35-47.

[8] CARBONE F，LIBERALE L，PREDA A，et al.Septic cardiomyopathy： from pathophysiology to the clinical setting[J].Cells，2022，11（18）：2833-2845.

[9]刘蕾，吴俊.中性粒细胞胞外诱捕网在血栓形成中发挥重要作用[J].中华检验医学杂志，2020，43（8）：5-11.

[10] TAN C Y，AZIA M，WANG P.The vitals of NETs[J].J Leukoc Biol，2021，110（4）：797-808.

[11] WANG J，WANG X T，LIU D W，et al.Induction and deduction in sepsis-induced cardiomyopathy： five typical categories[J].Chin Med J （Engl），2020，133（18）：2205-2211.

[12] MONTEIRO V，REIS J F，SOUZA G R，et al.Dual behavior of exosomes in septic cardiomyopathy [J].Adv Exp Med Biol，2017，998：101-112.

[13] ARULKUMARAN N， DEUTSCHMAN C S，PINSKY M R，et al.

Mitochondrial function in sepsis[J].Shock，2016，45（3）：271-281.

[14] JACOBI J.The pathophysiology of sepsis - 2021 update： part 2， organ dysfunction and assessment[J].Am J Health Syst Pharm，2022，79（6）：424-436.

[15] LIMA M R，SILVA D.Septic cardiomyopathy： a narrative review[J].Rev Port Cardiol，2023，42（5）：471-481.

[16]李景萍.革兰氏阴性细菌感染致脓毒症患者血清免疫、炎性指标与心肌损伤的相关性[J].临床医学，2023，43（11）：55-57.

[17]陈群，李霖，李秀娟，等.解耦联蛋白2对脓毒症腹腔感染大鼠心肌细胞凋亡、氧化应激及PKR/Caspase-11蛋白的影响[J].中国老年学杂志，2023，43（17）：4322-4326.

[18]魏延焕，董庆林.脓毒症心肌病的研究进展[J].中国医学创新，2022，19（30）：178-183.

[19] STENGL M，PRUCHA M，MATEJOVIC M.Cytokines，heart and calcium current in sepsis. Mechanical stretch and cytokines[J].Springer Netherlands，2012：87-106.

[20] SU L J，ZHANG J H，GOMEZ H，et al.Reactive oxygen species-induced lipid peroxidation in apoptosis， autophagy， and ferroptosis[J].Oxid Med Cell Longev，2019，2019：5080843-5080857.

[21] CHENNA S，KOOPMAN W J H，PREHN J H M，et al.

Mechanisms and mathematical modeling of ROS production by the mitochondrial electron transport chain[J].Am J Physiol Cell Physiol，2022，323（1）：C69-C83.

[22] TAN Y，CHEN S N，ZHONG J K，et al.Mitochondrial injury and targeted intervention in septic cardiomyopathy[J].Curr Pharm Des，2019，25（18）：2060-2070.

[23] LIN Y，DING Y C，WU Y，et al.The underestimated role of mitochondria in vitiligo： from oxidative stress to inflammation and cell death[J/OL].Exp Dermatol，2024，33（1）：e14856-e14868（2023-06-20）[2024-01-11].https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37338012/.DOI：10.1111/exd.14856.

[24] LI J M，WANG L Y，WANG B，et al.NOX4 is a potential therapeutic target in septic acute kidney injury by inhibiting mitochondrial dysfunction and inflammation[J].Theranostics，2023，13（9）：2863-2878.

[25] XIN T，LU C Z.SirT3 activates AMPK-related mitochondrial biogenesis and ameliorates sepsis-induced myocardial injury[J].Aging （Albany NY），2020，12（16）：16224-16237.

[26] KELLUM J A，FORMECK C L，KERNAN K F，et al.Subtypes and mimics of sepsis[J].Crit Care Clin，2022，38（2）：195-211.

（收稿日期：2024-04-02） （本文编辑：陈韵）