发酵牦牛肉中的菌株分离鉴定及其应用研究

摘要：发酵牦牛肉是我国西藏地区的特色食品，富含多种营养物质，具有独特风味，深受消费者喜爱。然而，发酵牦牛肉目前的加工工艺较落后，大多仍然采用普通晾晒方式进行加工，生产周期长、效率低，且发酵牦牛肉的食品安全也得不到保障。该研究基于此，对发酵牦牛肉中的乳酸菌进行分离和鉴定，发现适用于发酵牦牛肉的乳酸菌菌株有4株，菌株7和菌株8为乳酸球菌（Lactococcus garvieae），菌株10和菌株12为清酒乳酸杆菌（Lactobacillus sakei）。将乳酸菌菌株与从北京微生物研究所种质资源库购买的低温酵母菌德巴利氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）进行混合发酵牦牛肉，采用单因素试验和正交试验对发酵牦牛肉加工工艺进行研究和优化，结果表明，发酵牦牛肉的最佳加工工艺为接种量1.5%、清酒乳杆菌与德巴利氏酵母菌比例1∶3、发酵温度33 ℃和发酵时间24 h。

关键词：牦牛肉；发酵；分子生物学；乳酸菌

中图分类号：TS201.3""""" 文献标志码：A"""" 文章编号：1000-9973（2024）11-0079-05

Study on Isolation， Identification and Application of Strains in

Fermented Yak Meat

WANG Fu-qing， ZHANG Chun-ying， YAO Xue-qing， XU Li-xin

（National and Local Joint Engineering Research Center for Deep Processing of Special Agricultural

and Animal Husbandry Products in Tibetan Plateau， Lhasa 850600， China）

Abstract： Fermented yak meat is a special food in Tibet， China. It is rich in a variety of nutrients and has a unique flavor， so it is deeply loved by consumers. However， the current processing technology of fermented yak meat is relatively backward， most of it is still processed using ordinary air drying methods. The production period is long， the efficiency is low， and the food safety of fermented yak meat can't be guaranteed. Based on this， in this study， lactic acid bacteria in fermented yak meat are isolated and identified. It is found that there are four strains of lactic acid bacteria suitable for fermenting yak meat. Strains 7 and 8 are Lactococcus garvieae， and strains 10 and 12 are Lactobacillus sakei. The lactic acid bacteria strains and the low-temperature yeast Debaryomyces hansenii purchased from Beijing Institute of Microbiology are mixed to ferment yak meat. Single factor test and orthogonal test are used to study and optimize the yak meat processing technology. The results show that the optimal processing technology of fermented yak meat is inoculation amount of 1.5%， strain ratio of Lactobacillus sakei to Debaryomyces hansenii of 1∶3， fermentation temperature of 33 ℃ and fermentation time of 24 h.

Key words： yak meat; fermentation; molecular biology; lactic acid bacteria

收稿日期：2024-06-14

基金项目：2019年国家产业技术基础公共服务平台项目（2019-00901-1-1）

作者简介：王福清（1963—），男，正高级工程师，硕士，研究方向：食品加工技术。

牦牛肉是一种营养丰富的肉类，其主要营养成分包括高质量蛋白质、脂肪、维生素和矿物质[1-2]。牦牛肉中的蛋白质含量高，且氨基酸组成均衡，有助于维持身体组织的生长和修复[3]。脂肪含量相对较低，但富含对人体有益的不饱和脂肪酸，如亚油酸和亚麻酸，有助于维护心血管健康[4]。此外，牦牛肉中还含有丰富的B族维生素和矿物质，如铁、锌、硒等，对提高免疫力、促进新陈代谢和维持神经系统功能都有益处[5]。

发酵牦牛肉是以新鲜的牦牛肉为原料，通过分割和腌制发酵后自然风干而成，深受消费者喜爱[6]。在自然环境条件下，发酵牦牛肉在环境微生物和内源酶的作用下发生了一系列化学变化，生成了具有独特风味的发酵牦牛肉干[7]。目前牦牛肉生产的主要方式为家庭小作+坊式，缺乏统一的生产标准，不规范的生产导致牦牛肉品质参差不齐，给食品的安全性带来了潜在风险[8]。

乳酸菌是一类革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中，它们通过分解糖类产生乳酸，被广泛应用于医药研究、农业生产和食品加工等领域，与人类生活密切相关[9]。乳酸菌有助于平衡肠道微生物群落，改善肠道环境并抑制有害微生物生长。研究表明，乳酸菌可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病微生物，能够提高免疫力和发挥益生功效[10]。

研究牦牛肉加工工艺不仅可以提高牦牛肉制品的品质和口感，延长产品的保质期，而且可以开发出更多种类的牦牛肉制品，满足消费者的需求。此外，优化加工工艺还能提高生产效率，降低生产成本，促进牦牛养殖业的发展[11-12]。另外，研究加工工艺还有助于探索牦牛肉的营养特点和功能成分，为开发更多具有营养保健功能的牦牛肉制品提供科学依据。

不同的海拔、气候环境、加工方式对发酵牦牛肉中的微生物多样性影响较大[13]，因此，本研究通过分离纯化的方法获得适用于西藏地区牦牛肉发酵的乳酸菌，并对西藏地区发酵牦牛肉的加工工艺进行研究和优化，旨在为西藏地区发酵牦牛肉的品质控制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

西藏传统发酵牦牛肉、新鲜牦牛肉、食用盐：购于当地农贸市场；MRS培养基：北京索莱宝科技有限公司；冰醋酸：南京松冠生物科技有限公司；NaNO2：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙三醇：汾阳堂（上海）实业有限公司。

1.2 试验仪器

恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；冰箱 东莞市昊昕仪器设备有限公司；电子天平 常州万泰天平仪器有限公司；超净工作台 苏州净化设备有限公司；电子显微镜 北京长恒荣创科技有限公司；pH计 优莱博技术（北京）有限公司；分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；PCR仪 西安天隆科技有限公司；振荡仪 广东洁盟超声实业有限公司；电泳仪 上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌分离纯化

将含有乳酸菌的发酵牦牛肉适当稀释，以便在培养基中形成单个菌落。使用MRS培养基对其进行培养，将处理后的样品在制备好的培养基表面均匀涂布，培养后可以在培养皿上观察到乳酸菌形成的菌落。根据形态特征，挑选单个菌落进行分离，利用无菌技术，使用接种环或接种针进行分离。将分离得到的单个菌落进行连续传代培养，确保培养物中只含有一种乳酸菌，将获得的乳酸菌保存于低温冰箱中待用。

1.3.2 乳酸菌生物量测定

取50 mL样品，使用高速离心机在转速为3 000 r/min的条件下离心10 min，之后将上清液移除，获得沉淀，将沉淀置于50～60 ℃的烘箱中快速烘干，最后称取重量并记录。

1.3.3 乳酸菌分子生物学鉴定

利用DNA试剂盒对乳酸菌中的DNA进行提取，DNA提取方法按照说明书进行，提取后的DNA以通用引物RSJ-F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）/RSJ-N（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）作为模板，利用PCR仪进行扩增，之后将扩增结果送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序分析。

将获得的序列于NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行比对，得到物种的近似种，将近似种与试验获得的结果进行系统发育分析，最终明确菌株的分类学地位。

1.3.4 单因素试验

控制接种量1%、清酒乳酸杆菌与德巴利氏酵母菌比例2∶3、发酵温度30 ℃和发酵时间18 h，分别研究不同接种量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%）、不同菌种比例（1∶1、1∶2、1∶3、2∶3、2∶1、3∶2）、不同发酵温度（24，27，30，33，36，39 ℃）、不同发酵时间（6，12，18，24，30，36 h）对发酵牦牛肉感官评分和pH值的影响。

1.3.5" 感官评价

邀请20位具有发酵牦牛肉感官评分经验的人员对发酵牦牛肉进行评分，以发酵牦牛肉的颜色、气味、组织结构和硬度为指标进行感官评分。感官评分标准见表1。

1.3.6 正交试验

在单因素试验的基础上，以接种比例、接种量、发酵时间和发酵温度为变量，发酵牦牛肉的感官评分为指标，进行四因素三水平正交试验，正交试验表见表2。

2 结果和讨论

2.1 牦牛肉中的乳酸菌分离鉴定及其生物学特性研究

2.1.1 菌株的分离鉴定

从发酵牦牛肉中分离获得25株革兰氏阳性菌，采用3M测试片对所有菌株进行筛选，一共获得13株符合乳酸菌特征的菌株，分别编号为1～13号。

2.1.2 不同温度对菌株生长能力的影响

低温发酵剂相比于常温发酵剂能够很好地维持食物中的营养物质，有效防止食物中的营养物质流失。在低温环境条件下，采用低温发酵剂对食物进行发酵，能够更好地将食物中的原料分解成相关的功能因子。我国西藏地区海拔高，菌株需在低温条件下生长繁殖，所以，本研究对13株乳酸菌在不同温度条件下的生物量进行测定对比，分析不同温度对乳酸菌生物量的影响。13株乳酸菌菌株在不同温度条件下的生物量变化见表3。

由表3可知，在不同温度条件下，乳酸菌菌株的生长能力存在差异，在15 ℃条件下，所有乳酸菌的生物量均较低，此时13株乳酸菌的平均生物量为0.05 g/50 mL，随着温度不断升高，乳酸菌的生物量开始有一定提升。当温度为35 ℃时，13株乳酸菌的平均生物量为0.615 g/50 mL。当温度低于20 ℃时，13株乳酸菌生长速率均较缓慢，分离所获得的大部分乳酸菌在35 ℃条件下均能正常生长。菌株7，8，10，12的生物量在30 ℃时最高，相比于其他菌株，生长所需要的最适温度也偏低，因此判断菌株7，8，10，12适用于西藏牦牛肉发酵。

由图1可知，当培养时间为0～12 h时，4株乳酸菌生长缓慢，主要是因为将乳酸菌接种到新环境中，需要一定的时间来适应新环境，所以其生长速度缓慢。当培养时间为16～32 h时，4株乳酸菌快速生长。当培养时间大于36 h时，乳酸菌的生长进入平缓阶段，说明此时乳酸菌的出生率和死亡率相等。

2.1.3 菌株的耐NaCl测试

食盐在肉制品发酵过程中有着不可替代的作用。高浓度的食盐在制作发酵制品时能够有效地防止腐败微生物生长，同时在保证发酵制品品质的基础上也能有效延长发酵制品的货架期。所以，研究乳酸菌在盐溶液中的生长能力尤为重要。4株乳酸菌在NaCl溶液中的生物量见图2。

由图2可知，随着培养基中NaCl浓度的不断增加，菌株的生长能力逐渐减弱，说明NaCl浓度对乳酸菌存在一定程度的抑制作用。当NaCl浓度为0%时，4株菌株的乳酸菌生长较快，生物量为1.3～2 g/50 mL，当NaCl浓度为20%时，乳酸菌的状态较差，生长速度较缓慢，生物量为0.1～0.4 g/50 mL。随着NaCl浓度的提升，4株菌株中的生物量虽然不断减少，但生物量减缓的速度变慢。

2.1.4 不同NaNO2浓度对菌株生长能力的影响

在制作发酵食品时，为了改善风味和延长货架期，通常会添加一些亚硝酸盐。在发酵肉制品中，亚硝酸盐与肉中的肌红蛋白反应，形成亚硝基肌红蛋白。随着发酵时间的增加，发酵肉中也会产生亚硝酸盐，从而影响乳酸菌的耐受性。4株乳酸菌受NaNO2浓度的影响见图3。

由图3可知，随着培养基中NaNO2浓度的持续增加，4株菌株的生物量不断下降。当没有添加NaNO2时，4株菌株的生长情况良好，生物量为0.8～1.1 g/50 mL。当NaNO2浓度升高至5 mg/mL时，乳酸菌的生物量开始降低，此时生物量为0.8～0.95 g/50 mL；当NaNO2浓度为15 mg/mL时，乳酸菌的生物量相对较低，为0.5～0.62 g/50 mL。随着NaNO2浓度的不断增加，4株菌株的生长速率均不断下降，但下降速度较缓慢，说明这4株菌株对NaNO2溶液的耐受性较高。

2.1.5 菌株产酸能力测定

在牦牛肉发酵过程中，pH值是检验发酵食品是否成熟的重要指标，肉在发酵过程中会产生酸性物质，使得pH值逐渐降低。所以，本研究对4株菌株的产酸能力进行测定，见图4。

由图4可知，当4株乳酸菌培养2 d后，培养基中的pH值为4～5，表明4株乳酸菌菌株的产酸能力较强，可以用于制作发酵剂。

2.1.6 基于16S rDNA序列对菌株进行鉴定

采用分子生物学手段对4株菌株进行鉴定，见图5。

由图5可知，菌株7和菌株8为乳酸球菌（Lactococcus garvieae），菌株10和菌株12为清酒乳酸杆菌（Lactobacillus sakei）。

2.2 低温复合发酵剂的混合应用研究

2.2.1 单因素试验

不同菌株之间会产生拮抗作用和协同作用，就发酵剂而言，菌种的比例非常重要，直接决定发酵牦牛肉的品质。将本研究分离获得的10号菌株清酒乳酸杆菌（Lactobacillus sakei）与从北京微生物所种质资源库购买的德巴利氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）进行混合接种，研究不同比例的菌种对发酵牦牛肉品质的影响。

由图6可知，当清酒乳酸杆菌和德巴利氏酵母菌的比例为2∶3时，发酵牦牛肉的感官评分最高。

接种量直接影响发酵牦牛肉的品质和货架期，因此，菌种的接种量非常重要，本研究分析了不同接种量对牦牛肉品质的影响，结果见图7。

由图7可知，随着接种量的增加，发酵牦牛肉的感官评分先升高后降低。当接种量为1%时，发酵牦牛肉的感官评分最高，为90分。

发酵温度会对发酵剂产生影响，温度过低或者过高均会影响清酒乳酸杆菌和德巴利氏酵母菌的活性，从而影响发酵牦牛肉的品质。所以，在生产发酵牦牛肉过程中，合适的发酵温度能够最大限度提高牦牛肉产能。不同发酵温度对牦牛肉感官评分和pH值的影响见图8。

由图8可知，随着发酵温度的升高，发酵牦牛肉的pH值和感官评分先升高后降低。当发酵温度为30 ℃时，牦牛肉的感官评分最高，为80分，pH值为5.6。

发酵时间也是影响牦牛肉品质的关键因素，若发酵时间过短，会导致发酵牦牛肉未能充分释放功能性成分；若时间过长，可能会引发杂菌滋生，影响其品质。不同发酵时间对发酵牦牛肉品质的影响见图9。

由图9可知，随着发酵时间的不断增加，发酵牦牛肉的感官评分先升高后降低，pH值不断降低。当发酵时间为18 h时，发酵牦牛肉的感官评分最高，为93分，此时发酵牦牛肉的pH值为5.6。若发酵时间过短，牦牛肉中并未形成完整的风味物质；发酵时间若过长，使得牦牛肉中积累的酸性物质过多，从而影响牦牛肉中的风味物质，导致其感官评分下降。

2.2.2 正交试验

在单因素试验的基础上，对发酵牦牛肉的加工工艺进行优化，发酵牦牛肉正交试验结果见表4。

由表4可知，对比4个因素（接种比例、接种量、发酵时间和发酵温度）对发酵牦牛肉品质的影响，接种比例、接种量、发酵时间和发酵温度4个因素的R值分别为3.9，7.2，1.5，6.9，说明接种量对发酵牦牛肉的品质影响最大，而发酵时间对发酵牦牛肉的品质影响最小。对比9组试验，第3组发酵牦牛肉的感官评分最高，感官评分为95.8分，此时发酵牦牛肉的加工工艺为接种量1.5%、清酒乳酸杆菌与德巴利氏酵母菌比例1∶3、发酵温度33 ℃和发酵时间24 h。

3 小结

我国西藏地区牦牛肉资源丰富，牦牛肉中富含营养物质，但由于交通运输不便，发酵将是未来很长一段时间内牦牛肉加工的主要加工方法之一[14]。

发酵牦牛肉是西藏地区的特色食品，具有独特的风味，能够长时间贮藏。以前的发酵牦牛肉主要通过家庭小作坊式加工处理，采用晾晒方式，发酵牦牛肉的生产周期较长且效率较低，贮藏后期容易发生霉变现象[15]。本研究基于此，先对传统发酵牦牛肉中的乳酸菌菌株进行分离，同时对分离菌株的生物学特性进行研究，发现牦牛肉中适合在西藏地区发酵的菌株共有4株，其中菌株7和菌株8为乳酸球菌（Lactococcus garvieae），菌株10和菌株12为清酒乳酸杆菌（Lactobacillus sakei）。

利用分离到的菌株10清酒乳酸杆菌结合从北京微生物所种质资源库购买的菌株德巴利氏酵母菌，对牦牛肉加工工艺进行研究和优化，研究结果表明，发酵牦牛肉的最佳加工工艺为接种量1.5%、清酒乳酸杆菌与德巴利氏酵母菌比例1∶3、发酵温度33 ℃和发酵时间24 h。

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