T/CI 004-2022《高麦黄酮小麦籽粒中游离态麦黄酮及总麦黄酮含量指标和测定方法》团体标准解读

摘 要：T/CI 004-2022《高麦黄酮小麦籽粒中游离态麦黄酮及总麦黄酮含量指标和测定方法》于2022年2月发布并正式实施。本标准的发布首次提出了高麦黄酮小麦品种（系）的游离态和总麦黄酮的含量指标并规范了简便准确的测定方法，这将有利于高麦黄酮小麦新品种开发和营养导向型农业的健康发展。为了更好地使相关人员正确理解和使用该团体标准，本文对编制背景、主要内容、测定方法的优势等进行了详尽介绍。

关键词：小麦，高麦黄酮，标准解读

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.08.026

0 引 言

《高麦黄酮小麦籽粒中游离态麦黄酮及总麦黄酮含量指标和测定方法》团体标准由中国国际科技促进会标准化工作委员会提出并归口，该标准是当前功能小麦育种领域的一项重要指标。该标准的发布首次确定了高麦黄酮小麦品种的游离及总麦黄酮含量指标并对其测定方法进行统一规范，这将有利于高麦黄酮小麦新品种开发和营养导向型农业的健康发展。

1 标准编制背景

小麦富含淀粉、蛋白质、脂肪、氨基酸以及多种微量元素，是人类和动物最主要的营养来源之一，小麦产业发展直接关系到世界粮食安全和社会稳定。小麦不仅仅为人类、动物活动提供能量来源，而且特殊用途类型的小麦具有一定的药用价值。特殊用途品种除了黑色小麦和糯小麦外，也包括高麦黄酮和富硒、富锌等特殊营养物质的品种。黄酮类物质包含游离态麦黄酮、其他黄酮苷元及糖苷衍生物，具有很强的抗氧化和清除自由基的能力，同时具有改善心血管疾病症状、抗菌抗炎、增强人体免疫力等多重功效。相关研究表明，含有较高麦黄酮小麦，其抗氧化能力能够降低心血管疾病发生的概率，因此，麦黄酮含量较高的小麦是非常重要的功能性品种。

近年来，国内外多个研究团队开展了高麦黄酮小麦的育种、鉴定技术研究，但通过广泛调研发现，国内外至今仍没有关于高麦黄酮小麦品种的游离态麦黄酮及总麦黄酮含量指标定义和规范，其检测方法也无统一标准。因此，本标准的制定，将首次提出高麦黄酮小麦的游离态麦黄酮及总麦黄酮含量指标，制定高效、准确且统一的测定标准，对服务育种家培育更优品质的高麦黄酮小麦新品种，满足人民群众对生活质量和健康水平的新需求，确保我国营养导向型农业的健康发展来说意义重大。

2 标准主要内容解读

2.1 术语及定义

游离态麦黄酮（Tricin， C17H14O7），又称麦黄酮、苜蓿素、小麦黄素，化学名称为5 ，7， 4 '-三羟基-3'，5'-二甲氧基黄酮。

总麦黄酮（Total wheat flavonoid），即小麦中黄酮类物质的总含量。

高麦黄酮小麦，定义为小麦生长发育过程自然产生和积累的游离态麦黄酮含量大于0.5 mg/kg（含）或者总麦黄酮含量大于1 g/kg（含）的小麦品种（系）（不含黑、紫、蓝等彩色小麦）。

2.2 标准适用范围

本标准规定了游离态麦黄酮、总麦黄酮和高麦黄酮小麦的术语、定义、范围，高麦黄酮小麦籽粒中麦黄酮含量指标的科学确定以及小麦籽粒及制品中游离态麦黄酮含量（高效液相色谱-串联质谱法）和总麦黄酮含量（分光光度比色法）的检测方法。

本文件适用于小麦籽粒中游离态麦黄酮及总麦黄酮含量的精确定量测定。企业在制定企业标准时可参照使用，相关机构在选育、审定和应用高黄酮小麦及其制品时可参照使用。

2.3 小麦籽粒中麦黄酮含量的测定方法（高效液相色谱-串联质谱法）

2.3.1 原理

试样用80%乙醇溶液提取，经离心浓缩后复溶，利用液相色谱串联质谱仪检测。根据麦黄酮的特定分子量和化学结构，通过离子碎片质谱图进行定性，同时使用麦黄酮标准品制定定量标准曲线，利用外标法精确定量。

2.3.2 样品准备步骤

小麦籽粒使用震动球磨仪（GRINDER GT200）磨碎，过1.0 m m筛，密封并标明标记。将试样置于-80℃冰箱保存。

称取100 mg试样（精确至0.01 mg）2 mL离心管中，加入1 mL 80%乙醇水溶液，在涡旋混合器上涡旋2 min，超声处理40 min，置于旋转混匀仪上混匀8 h，13000 r/min离心5 min，取全部上清液至另一干净离心管中，加入1 mL甲醇，超声40 min，13000 r/min离心5 min，合并两次上清液，在氮气吹干仪上常温吹干，加入100 μL甲醇复溶，0.22 μm滤膜过滤后供液相色谱串联质谱仪检测。

2.3.3 测定

液相色谱-串联质谱参考条件（按照GB/T 6041质谱分析方法通则和GB/T 16631-2008 高效液相色谱法通则操作）

a） 色谱柱：Hypersil Gold C18（美国 ThermoScientific 公司），3.5 μm，100 mm ×2.1 mm（内径）或相当者；

b） 流动相及梯度洗脱条件见表1；

c） 柱温：35 ℃；

d） 进样量：5 μL；

e） 电离源模式：电喷雾离子化；

f） 电离源极性：负离子模式；

g） 雾化气：氮气；

h） 离子喷雾电压：2500 V；

i） 雾化气温度：317 ℃；

j） 离子传输管温度：333 ℃；

k） 监测离子对及碰撞气能量见表2。

2.3.4 制作标准曲线

分别称取5.0 mg标准物质于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配得500 μg/mL的标准溶液（标准溶液避光-40℃保存，保存期为一年）。用甲醇稀释得到浓度为0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5μg/mL的系列溶液，0.22 μm滤膜过滤后供液相色谱串联质谱仪检测。以峰面积为纵坐标，麦黄酮浓度为横坐标绘制标准曲线。

2.3.5 结果计算和表述

液相色谱-串联质谱测定采用标准曲线法定量，标准曲线法定量结果按公式（1）计算：

式中：X i—试样中被测组分含量，mg/kg；c i—从标准曲线上得到的被测组分溶液浓度，μg/mL；V—样品溶液定容体积，mL；m —样品溶液所代表试样的重量，g。

结果保留三位有效数字，绝对差值不得超过平均数的5%。

2.4 总黄酮含量的测定方法 （分光光度比色法）

2.4.1 原理

试样用80%乙醇溶液提取后，溶于乙醇的黄酮类物质与铝离子显色剂结合，形成有色物质，在510nm波长附近产生最大吸收，一定浓度范围内，吸光度与总黄酮含量成正比，通过与标准曲线比对获得总黄酮含量。

2.4.2 样品准备步骤

小麦籽粒使用震动球磨仪磨碎，密封并标明标记。将试样置于-80 ℃冰箱保存。

称取1.0 g试样（精确至0.01 g）于15 mL离心管中，加入10 mL 60%乙醇溶液，混匀，超声处理60min，期间每20 min摇匀溶液一次，9500 r/min离心10min，将上清液转移至25 mL容量瓶，加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，加入10%硝酸铝溶液0.5 mL，加4%氢氧化钠溶液4 mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀后放置15 min，以不加样品液为空白，摇匀后用5cm的比色皿，在510 nm处测定吸光度。

2.4.3 制作标准曲线

称量13.2 mg芦丁，用60%乙醇定容到25 mL容量瓶作为标准溶液储备液。

准确吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL芦丁标准溶液，放入10 mL容量瓶内（写明标记），分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL的60%乙醇溶液；再加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.5 mL，放置6 min后；加入4%氢氧化钠溶液4.0 mL，加60%乙醇定容，摇匀后，放置15 min；以不加芦丁对照品溶液为空白，采用分光光度法在510 nm波长处测定吸光度，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

2.4.4 结果计算和表述

总黄酮含量（干基）按芦丁质量分数计，按公式（2）进行计算：

式中：ω—总黄酮含量，g/kg；m —由标准曲线上查得样品溶液中芦丁质量，mg；W—样品的质量，g；d —稀释比例。

结果保留三位有效数字，绝对差值不得超过平均数的5%。

3 确定高麦黄酮小麦品种中的游离麦黄酮及总麦黄酮含量

关于小麦中游离态麦黄酮含量的测定，仅2009年赵善仓[1]等人采用超高效液相色谱串联质谱法测定了14个小麦品种（系）籽粒中游离态麦黄酮含量，发现游离态麦黄酮含量最高的品种为黑小麦76，达379 μg/kg，最低的品种为VICTO，仅含有47.1 μg/kg，且品种间游离态麦黄酮含量存在极显著差异。

本团队使用上述液相色谱-质谱联用方法对四十余种常见小麦品种的游离态麦黄酮含量进行了精确定量检测，结果表明，这些小麦籽粒中游离态麦黄酮含量最低的品种仅为50.33 μg/kg，最高的品种为577.48 μg/kg，进一步确认了不同品种间游离态麦黄酮含量的差异性。

而本文件主要研究材料“山农 101”（区试号：山农黄酮麦 1 号）于2020 年通过山东省农作物品种审定委员会审定（鲁审麦 20206035），是国内审定的第一个高黄酮小麦新品种。经山东省农科院农业质量标准与检测技术研究所以芦丁比色法测定，其总麦黄酮含量1.013 g/kg，是普通小麦平均含量的3.5～5倍。

综合考虑国内外小麦品种（含育种资源）中的麦黄酮含量范围，同时也照顾到实际农业生产上种植高麦黄酮小麦品种产量、抗性及农艺性状的要求，本标准认为，将游离麦黄酮含量高于0.5 mg/kg（含）或者总麦黄酮含量高于1 g/kg（含）的小麦品种（系）定义为高麦黄酮小麦品种（系）是合适的。

4 测定方法优势

关于游离态麦黄酮含量的测定目前已有一些报道，如赵善仓[1]、Estiarte[2]、凌俊红[3]、Tian[4]以及Meng[5]等人均采用高效液相色谱（HPLC）法分别测定了竹叶、大麦芽、小麦叶片和小麦籽粒中的游离态麦黄酮含量。而国内关于游离态麦黄酮的检测标准只有一个广西地方标准DB45/T 1177-2015《山银花中苜蓿素的测定 高效液相色谱法》，其中涉及的检测方法耗时较长（25分钟/样品），且单纯采用的是液相方法，难于应用于小麦籽粒复杂基质中微量游离态麦黄酮的精确定性定量。国外方面，欧盟、英国和美国则没有查询到关于麦黄酮的任何检测标准。

本标准建立了一种精确检测小麦籽粒中游离态麦黄酮含量的液相色谱串联质谱检测方法。该方法基于2009年田纪春课题的方法进行改造，利用三重四极杆高效液相质谱法进行定量检测，并针对小麦籽粒进行了提取方法优化改进，大大简化检测步骤，提高了检测的灵敏度和准确性，单位样品检测耗时小于10分钟。

关于总麦黄酮的检测已有众多报道[6 ]，同时有三个已经执行的标准（GB/T 20574-2006、NY/T1295-2007、DB34/T 2743-2016）列出了蜂胶、荞麦和槐米中总麦黄酮的检测方法，小麦及其制品中的总麦黄酮尚未有现行标准。

本标准建立了一种检测小麦籽粒及其制品中总麦黄酮含量的分光光度比色法方法，根据小麦及其制品的特性对现行标准方法进行优化改进。

目前，本单位已经使用标准品建立标准曲线，并已经进行了上百个实际样品的检测和定量分析，验证了方法的可行性和稳定性。

5 结 语

麦黄酮是小麦籽粒中重要的抗氧化剂和生理活性物质，可降低环加氧酶活性的，具有扩张血管、抗菌消炎、增强人体免疫力等多重功效。日常饮食中摄入的黄酮类化合物能够减少心脏病等疾病的发病率。食用高麦黄酮小麦能够提高人们自身的免疫力和患者治愈率，减少心脏病等疾病的发病率[7]，对个人和社会来说都是最经济有效的方法。

近年来，膳食不良成为我国导致死亡的第一大因素，因此，全球农业发展研究的热点聚焦于探寻农业、营养、健康的关系。随着《主要农作物品种审定标准》（国品审〔2017〕1号）的发布，我国的农作物育种导向也发生了重大变化，营养导向型农业和功能作物品种迎来了前所未有的发展机遇。本标准的制定，首次提出了高麦黄酮小麦品种（系）的含量指标，并使其检测方法具有明确的依据。通过标准的解读，可使小麦育种、种植、检测行业相关单位和机构更好地理解标准中内容的确定依据，为标准的顺利实施和有效推广奠定基础。

参考文献

[1]赵善仓，赵领军，谷小红，等.超高效液相色谱串联质谱法测定小麦籽粒中麦黄酮[J].分析化学，2009 37（6）：873-876.

[2]ESTIARTE M， PENUELAS J， KIMBALL B A， et al. Freeair CO2 e nrichment o f wheat： leaf f lavonoid c oncentration throughout the growth cycle[J]. Physiologia plantarum，1999， 105（3）： 423-433.

[3]凌俊红，王楠，任玉珍，等. HPLC法测定大麦芽中麦黄酮[J].中草药，2005（11）：1632-1634.

[4]田向军，邱宗波，刘晓，等.增强UV-B辐射对小麦叶片黄酮类化合物日变化的影响[J].环境科学学报，2007（3）：516-521.

[5]MENG Y， KRZYSIAK A J， DURAKO M J， et al. Flavones and f lavone glycosides from Halophila johnsonii[J].Phytochemistry， 2008， 69（14）： 2603-2608.

[6]胥倩，苗永辉，刘振，等.特殊颜色谷物研究进展和小麦相关新品种创制[J].粮油食品科技， 2021，29（2）：41-49.

[7]田纪春，胥倩.功能性小麦品种的概念、类别和发展前景[J].粮油食品科技，2021，29（2）：1-8.

作者简介

刘振，硕士，工程师，主要研究方向为代谢组学在小麦育种

中的应用。

（责任编辑：张瑞洋）

基金项目：本文受山东省科学技术厅省级人才工程项目“泰山产业专家计划”（项目编号：NO. tscy20221172）资助。