奶酪摄入量与骨关节炎关联性的双样本孟德尔研究

Associations of cheese intake with osteoarthritis：a Mendelian randomization study

Abstract" Objective：Using Mendelian randomization method，explore the causal relationship between cheese intake and the risk of osteoarthritis.Methods：Data from gene-wide association studies were used for analysis.The exposure factor was cheese intake，and the outcome variable was osteoarthritis.Mendelian randomization（MR） analysis was performed by IVW method，MR-Egger method and weighted median，and pleiotropy test，heterogeneity test and sensitivity analysis were performed.Results：The results of IVW and weighted median showed that cheese intake was a protective factor for osteoarthritis，and there was a negative causal association between them（Plt;0.05）.The MR-Egger regression showed no statistically significant association between cheese intake and osteoarthritis（P=0.335）.The results were tested for no heterogeneity or pleiotropy，and sensitivity analyses did not identify SNPs that significantly changed the overall causal relationship.Conclusion：Cheese intake is causally related to osteoarthritis.

Keywords" cheese intake； osteoarthritis； Mendelian randomization

摘要" 目的：采用孟德尔随机化的方法，探讨奶酪摄入量与骨关节炎发生风险的关联性。方法：采用全基因组关联分析数据进行研究，暴露因素为奶酪摄入量，结局变量为骨关节炎。采用逆方差加权法（IVW）法、加权中位数法、MR⁃Egger法进行孟德尔随机化分析，并进行多效性分析、异质性检验、敏感性分析。结果：IVW法和加权中位数法结果显示，奶酪摄入量为骨关节炎发病的保护因素，二者之间存在负向因果关联（Plt;0.05）。MR⁃Egger回归结果显示，奶酪摄入量与骨关节炎发病关联无统计学意义（P=0.335）。研究结果经检验不存在异质性和多效性，敏感性分析未发现导致总体因果关系发生显著变化的单核苷酸多态性位点。结论：奶酪摄入量与骨关节炎发生风险存在因果关系。

关键词" 奶酪摄入量；骨关节炎；孟德尔随机化

doi：10.12102/j.issn.1009-6493.2024.19.006

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节炎症、疼痛、软骨退化为主要病变的慢性退化性关节疾病[1]，是全球导致骨关节疼痛、残疾的主要原因之一[2]。随着骨关节炎的慢性、长期发展，病人出现的关节疼痛、僵硬、肿胀等症状，可能会影响病人的身体和心理健康，为病人带来高额的经济负担[3]，降低其生活质量[4]。既往研究表明，奶酪作为一种发酵的全脂乳制品，其摄入量与2型糖尿病[5]、缺血性心脏病[6]、高血压[7]等发病呈负相关。同样，Denissen等[8]纳入3 451名荷兰人的观察性研究发现，奶酪摄入量的增加与膝关节骨关节炎的发生呈负相关，但由于该研究为观察性研究，样本量较小，且可能存在选择偏倚，需要慎重解释结果。与此相反，一项纳入2 481名美国人群的前瞻性研究结果显示，高奶酪摄入的女性可能会增加骨关节炎进展[9]，这些结果的差异可能是由于其他乳制品摄入或饮食结构不同带来的影响。同时，既往研究缺乏涉及奶酪摄入量与骨关节炎的随机对照试验研究，二者的关联性仍存在一定的质疑与争议。孟德尔随机化研究是流行病学中广泛用于评估暴露因素与临床疾病之间潜在因果关系的重要方法，其以遗传变异为工具[10]，以大样本的全基因组关联分析（genome⁃wide association study，GWAS）中的单核苷酸多态性位点（single nucleotide polymorphism，SNP）为基础[11]，由于等位基因随机分配到个体中是在疾病发生之前，可使混杂因素的影响达到最小化[12]，减少因果估计值的偏倚。因此，本研究通过孟德尔随机化的方法，探讨奶酪摄入量与骨关节炎发生风险的潜在关联性，以期为奶酪摄入量与骨关节炎之间发生、发展的关联性提供理论依据。

1" 资料与方法

1.1 研究设计

本研究以GWAS中的SNP为基础，采用双样本孟德尔随机化分析方法，评估奶酪摄入量与骨关节炎之间的关联性和因果关系，并采用敏感性分析对结果的可靠性进行了检验。本研究中孟德尔随机化结果的有效性涉及3个关键假设：1）SNP与奶酪摄入量密切相关；2）SNP与已知的“暴露⁃结局”关联的混杂因素不相关；3）SNP仅通过奶酪摄入量影响骨关节炎，不与骨关节炎直接相关。具体流程见图1。

1.2 资料来源

本研究中的暴露因素为奶酪摄入量，通过公开数据库获得数据，其数据来源于英国生物银行（UKBB），该数据库中统计的样本量已超过50万人。本研究通过MR⁃Base平台获取了英国生物样本库中关于奶酪摄入量（ID：UKB⁃B⁃1 489）的数据，研究对象包括451 486例欧洲人群，SNP数量为9 851 867个。此外，骨关节炎（ID：ebi⁃a⁃GCST005811）的数据来自IEU OpenGWAS project数据库，研究对象包括63 556例欧洲人群病例和50 898例对照，SNP数量为15 870 475个。本研究所涉及的数据均来源于公共数据库，因此不涉及伦理审查问题。

1.3 工具变量

首先，考虑到孟德尔随机化的第1个关键假设，即SNP必须与奶酪摄入量密切相关，在全基因组水平上筛选了与骨关节炎显著相关的SNP（Plt;5×10-8，R2lt;0.001，window=10 000 kb）。其次，为了满足孟德尔随机化第2个关键假设，即SNP与已知的“暴露⁃结局”关联的混杂因素不相关，选择在Phenoscanner数据库中查询，以确保筛选后的SNP与已知的混杂因素不相关。最后，采用异质性检验剔除具有显著异质性的SNP，得到与骨关节炎显著相关的SNP作为本研究的工具变量。同时，为了判断选择的工具变量是否存在弱工具变量偏倚，需要进行F统计量的计算评估，计算公式[12]为F=R2（N-2）/（1-R2），N为暴露因素GWAS的样本量，R2为工具变量解释暴露因素变异的程度，其详细计算公式如下，R2=[2×EAF×（1-EAF）×beta2]/[2×EAF×（1-EAF）×beta2+2×EAF×（1-EAF）×N×SE（beta）2]，EAF为效应等位基因频率，beta为SNP对骨关节炎的效应值，SE（beta）为遗传效应的标准误差，若Fgt;10则说明存在弱工具变量偏倚的可能性较小[13]。

1.4 孟德尔随机化分析

采用逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）、加权中位数法（weighted median）、MR⁃Egger回归法（MR⁃Egger regression）进行双样本的孟德尔随机化研究分析。如果所有的遗传变异都满足工具变量假设，此时IVW法是因果效应的适当估计，可用作主要分析结果[14]。但是IVW法存在一定多效性偏倚的影响，因此，需要进行敏感性检验来判断结果的有效性。使用加权中位数法分析时，当工具变量对遗传变异贡献权重超过50%时，分析具有可信性[15]。当工具变量与结局的直接效应独立于工具变量与暴露因素的关联效应（instrument strength independent of direct effect，InSIDE）的假设满足时，MR⁃Egger法可作为强效的评价工具，产生的非零截距可以用于评价多效性[16]。对于3种孟德尔随机化的统计值，本研究选取IVW法为主要结果。

1.5 敏感性分析

采用Cochran Q检验、MR⁃Egger法、留一法（leave⁃one⁃out）检验工具变量间是否存在异质性，评估结果的敏感性。Cochran Q检验可用于判断所选工具变量间是否存在异质性。MR⁃Egger法参考截距项，作为是否存在水平多效性的依据，当截距接近零时，所得结果和IVW法相似；若截距项与零间隔较大，则表明工具变量间有存在水平多效性的可能[17]。留一法指逐一剔除单个SNP并计算剩余SNP的合并效应，用于判断结局是否受到单个SNP不成比例的影响[18]。

2" 结果

2.1 工具变量的筛选及弱工具变量偏倚的判断

最终筛选出62个与奶酪摄入量有关的SNP作为工具变量，所选SNP互相独立且显著相关（R2lt;0.001，Plt;5×10-8）。同时，经计算所选SNP的F值均gt;10，表明不存在弱工具变量偏倚，结果较可靠。

2.2 双样本孟德尔随机化分析结果

通过双样本孟德尔随机化得出所选SNP对骨关节炎的影响，IVW法结果显示，奶酪摄入量为骨关节炎发病的保护因素，二者之间存在负向因果关联，奶酪摄入量的增加可减少骨关节炎的发病风险（β=-0.560，SE=0.146，Plt;0.001）。加权中位数法结果与之相似（β=-0.468，SE=0.191，P=0.014）。MR⁃Egger回归结果显示，奶酪摄入量与骨关节炎发病关联无统计学意义（β=-0.594，SE=0.611，P=0.335）。详见图2。各种孟德尔随机化分析方法得到的因果效应方向见图3。

2.3 敏感性分析

2.3.1 水平多效性检验

使用MR⁃Egger法的截距项进行评估，P=0.955，表明工具变量之间不存在水平多效性，所选工具变量是可靠的。

2.3.2 异质性检验

Cochran Q检验结果显示，P=0.061，表明所选工具变量间不存在异质性。同时，所选的SNP的漏斗图显示，该研究的因果效应分布是基本对称的，不存在偏倚，见图4。

2.3.3 留一法敏感性分析

使用留一法敏感性分析法对结果进行分析，逐个剔除所选SNP并观察对总体因果关系的影响，结果显示，未发现导致总体因果关系发生显著变化的SNP位点，见图5。

3" 讨论

本研究采用了双样本孟德尔随机化研究，对奶酪摄入量与骨关节炎发生风险之间的因果关系进行了系统、全面的评估，结果显示，在欧洲人群中，奶酪摄入量与骨关节炎发生风险之间呈负相关，奶酪摄入是骨关节炎的保护因素。

本研究与既往观察性研究的结果是一致的，即奶酪摄入的增加能降低膝关节骨关节炎的发生风险。例如，Denissen等[8]纳入3 010名40～75岁的欧洲群体，探讨乳制品消费与膝关节骨关节炎发生、发展的关系，结果显示二者之间存在负相关关系。然而，Kaçar等[19]纳入655名土耳其人进行横断面研究，结果表明，牛奶可降低骨关节炎的发生率，但奶酪摄入与骨关节炎间未发现关联，这可能与研究对象与欧洲人群奶酪摄入量及种类具有一定的差异，且研究并未纠正潜在的重要混杂因素有关。综上所述，奶酪摄入量与骨关节炎存在某种关联。本研究通过孟德尔随机化方法证明增加奶酪摄入可降低骨关节炎风险。既往研究表明，奶酪中的益生菌能降低炎症、提高免疫力等[20]。同时，奶酪中含有丰富蛋白质，包括酪蛋白和乳铁蛋白等[21]，这些蛋白质对减轻炎症具有正向作用[22]。因此，奶酪对骨关节炎的影响不仅仅是单一成分的作用，而是多种有益成分的共同作用。孟德尔随机化具有独有的特征，包括显著的因果相关性、混杂因素的干预少、能直接观察暴露因素、不具有反向因果关系、研究设计更接近于随机分配等[23]，使本研究结果免于混杂因素或其他偏倚的影响，代表奶酪摄入量与骨关节炎之间具有关联性。同时，本研究采用3种统计方法进行孟德尔随机化分析，2种方法的结果趋于一致，因此推断结果较稳定。同时，本研究也存在一定的局限性。首先，尽管本研究经多效性检验未发现多效性效应的证据，同样在敏感性分析中显示有类似的结果，但在孟德尔随机化研究中，很难完全排除潜在多效性影响；其次，本研究涉及的遗传数据仅包括欧洲人群，这可能影响研究结果向其他种族、国家人群的推广，毕竟奶酪的成分中含有乳糖，亚洲东部人群对乳糖的代谢能力与欧洲人群间存在一定的差异[24]；最后，本研究的数据仅关注了奶酪摄入量，未注意其他饮食的摄入，也不清楚摄入奶酪的类型及持续时间，使研究具有一定的局限性。

4" 小结

综上所述，本研究采用双样本孟德尔随机化方法分析发现，奶酪摄入量与骨关节炎发生风险之间存在因果负相关。奶酪的摄入可能会为未来骨关节炎的预防和管理开辟新的途径。

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