巨桉脱水素基因EgrDHN家族鉴定及表达模式分析

摘 要：【目的】深入挖掘巨桉Eucalyptus grandis脱水素基因EgrDHN家族成员并探讨其应对逆境胁迫的表达模式，从中筛选具有抗逆功能的EgrDHN基因对于培育桉树抗逆新品种具有重要意义。【方法】以巨桉全基因组数据为参考，利用生物信息学筛选鉴定得到巨桉EgrDHN基因家族成员，对其进行生物信息学分析，具体包括进化树分析、蛋白序列比对、启动子序列中顺式作用元件预测等；并基于生物信息学分析结果，采用RT-qPCR测定方法，对EgrDHN基因家族成员在低温、高盐和ABA胁迫处理下的表达模式及其组织表达特异性进行了分析。【结果】从巨桉基因组中共鉴定出EgrDHN家族9个成员，将其命名为EgrDHN1～EgrDHN9，分布于5条染色体上，根据蛋白质保守序列的特点可分为KnS、SKn和YnSKn 3种类型。系统进化树显示植物DHN家族成员可分为4个进化枝，其中第Ⅳ进化枝包含巨桉EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9，但不包含任何毛果杨Populus trichocarpa DHN同源基因（PtrDHNs），两者存在明显差异。启动子元件预测分析发现巨桉EgrDHN启动子中含有低温响应（Low-temperature response， LTR）元件，MYB、MYC等与抗逆性相关以及植物激素响应类顺式作用元件。组织特异性表达分析发现EgrDHN家族成员在根、成熟叶片、子叶中表达量较高，其中EgrDHN2在成熟叶片中表达量最高。非生物逆境胁迫下经RT-qPCR检测发现EgrDHN家族成员中，EgrDHN1在高盐胁迫下表达量下调，在低温和ABA胁迫时上调，而其他成员在低温、高盐、ABA胁迫下均表现为上调，其中低温条件下以EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4响应最为明显。【结论】大部分EgrDHNs基因参与逆境胁迫响应，且除EgrDHN1在盐胁迫下的表达量下降外其他成员在逆境胁迫下的表达量均上升。

关键词：巨桉；脱水素；非生物胁迫；表达分析

中图分类号：S718.43 文献标志码：A 文章编号：1673-923X（2024）12-0166-12

基金项目：广西重点研发计划揭榜制科技项目（桂科JB22035001）；广西科技基地和人才专项（桂科AD23026337）。

Identification and expression pattern analysis of EgrDHN gene family in Eucalyptus grandis

SU Guofen1， LI Dahua2， WANG Pan1， ZHOU Liao2， HU Hao1， DENG Haiqun2， CHEN Xin1， FENG Mingkai2， GENG Xianchen1， WANG Yi1， XU Zengfu1

（1.a. College of Forestry；b. State Forestry and Grassland Administration Key Laboratory of Fast-Growing Timber Breeding in South China， Guangxi University， Nanning 530004， Guangxi， China； 2. State-owned Dongmen Forest Farm， Chongzuo 532108， Guangxi， China）

Abstract：【Objective】It is of great significance to explore the expression patterns of DHN gene family members in E. grandis and to screen the EgrDHN genes with stress resistance function for breeding new varieties of Eucalyptus.【Method】Based on the whole genome data of E. grandis， the EgrDHN gene family members were screened and identified by bioinformatics analysis， including phylogenetic tree analysis， protein sequence alignment， and promoter cis-acting element prediction.【Result】A total of 9 members of the DHN family were identified from the genome of E. grandis and named EgrDHN1-9， which were distributed on five chromosomes. The EgrDHN1-9 were divided into three types of KnS， SKn， and YnSKn， based on the conserved characteristics of their sequences. The phylogenetic tree showed that the plant DHN family could be divided into four evolutionary branches， among which the IV evolutionary branch contained EgrDHN7/8/9， but did not contain any P. trichocarpa DHN homologs （PtrDHN）， suggesting EgrDHNs and PtrDHN were significantly different from each other. Further analysis revealed that the promoters of EgrDHN mainly contained stress-responsive elements such as low-temperature response （LTR）， and the cisacting elements of stress-resistance related MYB， MYC and phytohormone-responsive genes. Tissue specific expression analysis found EgrDHN family members were highly expressed in roots， mature leaves， and cotyledons， with EgrDHN2 having the highest expression in mature leaves. RT-qPCR analysis revealed that the expression of EgrDHN1 in EgrDHN family members was down-regulated under high salt stress and up-regulated under low temperature and ABA stress， but the expression of other members were up-regulated under low temperature， high salt and ABA stress. Among them， EgrDHN2/3/4 showed the most obvious response at low temperature.【Conclusion】Most of EgrDHN genes are involved in stress response， and all members except EgrDHN1 are down-regulated under salt stress and may play a positive regulatory role.

Keywords： Eucalyptus grandis； dehydrin； abiotic stress； expression analysis

桉树Eucalyptus spp.是我国南方重要的速生用材树种，我国桉树人工林面积有450多万hm2，主要分布于广西、广东、福建、云南、海南等南方气温较高的10个省区，年产木材超过3 000万m3，超全国木材总产量的1/3[1]。然而，桉树的发展受限于逆境胁迫，如病虫害等生物逆境胁迫极大影响桉树的速生丰产[2]，低温等非生物逆境胁迫是限制桉树栽培区域的主要因素之一。解析桉树对逆境胁迫抗性的生理和分子机制不仅对推广种植具有很好的应用价值，而且对培育桉树抗逆优良新品种、增加我国的木材产量、保障我国木材安全具有重要的意义。在桉树的抗寒研究方面，美国ArborGen公司[3]对桉树抗寒研究现状进行了总结，并指出挖掘新的抗寒基因以及对常用抗寒基因的应用是桉树抗寒育种的重要方向。如将冈尼桉Eucalyptus gunnii的两个转录因子EguCBF1a/b在冷敏感型尾巨桉E. urophylla×E. grandis（clone 201）中过表达，发现过表达桉树耐霜冻能力增强[4]。随后对过表达尾巨桉株系的木质部样品做进一步研究，结果显示转基因植株的木质部特征与那些长期暴露于低温环境的桉树木质部特征类似，表明在低温胁迫下CBF对于林木发育和木材材性具有重要调控作用，因为木材材性的重塑是植物面对寒冷胁迫的适应策略的一部分[5]。除响应低温胁迫外，过表达CBF还可以提高植物抵抗干旱和盐胁迫的能力，如对35S：DREB1Ab（DREB1A/CBF3）和rd29A：DREB1Aa（DREB1A/ CBF3）转基因烟草进行1 ℃ 10 d、25 ℃ 2 d的低温处理及干旱2周的胁迫处理，结果显示转基因烟草较对照更耐低温和干旱胁迫[6]。另外，codA是熟知的耐盐基因，导入codA显著提高了赤桉E. camaldulensis的耐干旱和盐胁迫的能力[7-8]。

脱水素（Dehydrin， DHN）属于植物胚胎发生后期丰富（Late embryogenesis abundant， LEA）蛋白，参与多种逆境胁迫响应，该蛋白中含有Y、S、K 3个保守基序，其中Y-motif多处于DHN蛋白的N端，该基序可能具有类似分子伴侣的功能，可以帮助蛋白质正确加工折叠以抵抗逆境胁迫[9-10]。S-motif由多个丝氨酸残基串联而成，可被酪蛋白激酶2磷酸化，并在信号肽的引导下进入细胞核[11]。K-motif通常位于DHN蛋白的C端，通过形成两亲性α-螺旋与膜结合进入细胞膜，以维持逆境胁迫下细胞膜的稳定性，从而提高植物的抗逆能力[12]。据报道，在拟南芥Arabidopsis thaliana中同时超量表达脱水素基因AtRAB18（At5g66400）、AtCOR47（At1g20440）和AtERD10（At1g20450）、AtXERO2（At3g50970）显著提高植物的抗寒能力[13， 14]。在水稻Oryza sativa中过表达OsDHN1使水稻植株的抗寒和耐盐性显著增强[15]。拟南芥中过表达仙人掌Opuntia diuemii DHN1基因也提高了拟南芥对4 ℃低温的耐受性[16]。此外，在拟南芥中过表达亮果桉E. nitens的EniDHN2基因增强拟南芥耐寒性，可见桉树DHN基因家族具有改良植物抵抗低温寒害的潜在应用价值[17-18]。

除了提高抗寒能力以外，DHN基因家族成员还能在一些生物及非生物逆境胁迫下响应表达，如疫霉病诱导栎树Quercus spp.的脱水素类似蛋白基因的表达[19]，在大肠杆菌Escherichia coli中过表达拟南芥AtERD10基因会抑制细菌生长[20]。在拟南芥中过表达毛果杨P. trichocarpa的PtrDHN3基因，在100 mmol/L NaCl溶液处理4周龄纯合植株的试验中发现转基因植株的H2O2和O2-积累量少于野生型，表明转基因拟南芥耐盐性增强[21]。在辣椒Capsicum annuum中过表达CaDHN4基因，经过4 ℃冷处理3 d和250 mmol/L NaCl处理下转基因植株展现较低的MDA含量和电解质，转基因植株耐冷和耐盐性增强[22]。类似地，在水稻Oryza sativa中异源表达JcDHN2可增强水稻植株对水分胁迫的耐受性[23]。

巨桉E. grandis作为我国主要造林杂交树种尾巨桉和巨尾桉E. grandis×E. urophylla的亲本，其具有生长迅速的特性，但其耐寒性较弱，致使其杂交桉树种推广受限[24]。因此，通过鉴定巨桉EgrDHN基因家族成员，并分析其不同胁迫如低温、高盐、ABA处理下的表达模式，从中筛选出与非生物胁迫抗性调控相关的DHN基因，既可以为研究这类基因的功能提供参考依据，也可为通过分子育种技术提高巨桉及其杂交种的抗逆性提供优质的候选基因。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本试验所用巨桉种子由广西壮族自治区国有东门林场（广西崇左市扶绥县新宁镇）提供。萌发后的幼苗种植于广西大学林学院植物培养室，培养条件参数设置：温度28 ℃，光照20 000 lx，光周期16 h光照/8 h黑暗。

1.2 引 物

利用在线网站https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/index.cgi设计引物，并在上海生工生物有限公司与南宁擎科生物有限公司合成引物。引物母液浓度为10 μmol/L，反应终浓度为0.2 μmol/L。所用引物序列信息详见表1。

1.3 巨桉EgrDHN基因家族成员鉴定及理化性质分析

巨桉的参考基因组信息、基因编码序列和蛋白序列从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取。

利用已报道的拟南芥A. thaliana、毛果杨P. trichocarpa、水稻O. sativa的DHN基因家族成员蛋白序列作为查询序列[15，25-26]，利用Tbtool软件[27]比对巨桉的蛋白数据库（E≤10-6），同时利用Hmmer网站（http：//hmmer.org/）的隐马尔可夫模型PF00257比对巨桉蛋白库数据，对以上两种方法鉴定到的蛋白序列取并集，以并集内的蛋白序列作为巨桉EgrDHN家族成员。

将筛选得到的EgrDHN家族成员蛋白序列提交至 ExPASY（https：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸长度（LEN）；利用巨桉基因组GFF注释文件获取巨桉EgrDHN家族成员在染色体中的定位信息，NCBI在线网址获取外显子数量及ORF长度；通过Plant-mPLoc（http：//www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）预测EgrDHN家族成员蛋白的亚细胞定位[28]。

1.4 巨桉EgrDHN生物信息学分析

根据拟南芥、毛果杨、水稻和巨桉的DHN基因家族编码的蛋白序列，利用Mega5.0软件进行多序列比对，基于多序列比对结果采取邻接法（Neighbor-joining）建树，bootstrap参数设置为 1 000，其他参数默认，再将文件提交至Itol在线网站（https：//itol.embl.de/itol.cgi）进行美化。

巨桉EgrDHN家族成员蛋白序列比对使用Snapgene软件的Muscle功能进行。

选取EgrDHNs基因序列的起始位点上游1 600 bp，提交至Plant CARE网站（http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件预测，得出的结果采用Excel软件进行整理，最后使用Tbtools和GraphPad Prism软件绘图。

1.5 巨桉EgrDHN基因家族表达模式分析

选取移栽后1月龄且长势一致的巨桉幼苗，提取根、茎、叶、腋芽、顶芽和子叶的RNA，并反转录后进行荧光定量PCR测定EgrDHN基因家族成员的表达模式。为消除生物钟因素的影响，选择同一时间进行以下3种处理的取样。

低温处理：选取移栽后3月龄且长势一致的巨桉幼苗，放置4 ℃培养箱内，取样时间依次为处理后的0、3、6、12、24和72 h。

NaCl处理：选取移栽后1月龄且长势一致的巨桉幼苗，用浓度为150 mmol/L NaCl溶液进行土壤浇灌处理，取样时间依次为处理后的0、3、6、12和24 h。

ABA处理：选取移栽后1月龄且长势一致的巨桉幼苗，向叶片喷施浓度为100 μmol/L的ABA，取样时间依次为处理后的0、3、6、12和24 h。

总RNA提取采用OMEGA的RNA提取试剂盒，cDNA第一链合成采用cDNA单链合成试剂盒（HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit），荧光定量PCR使用步骤按照SYBR Green染料法qPCR Mix说明书进行。每个处理均设置3个生物学重复。

1.6 数据整理

使用Excel 2010软件整理实验数据，采用IBM SPSS Statistics（Version 20）SPSS 20进行方差分析和差异显著性分析，差异显著设置为P<0.05，标准误差反映样本均值对总体均值的偏离程度。采用GraphPad Prism 6软件进行作图。

在测定基因表达量的实验中，以EgrActin7基因作为内参基因，用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1 巨桉EgrDHN基因家族成员鉴定及系统进化分析

通过多重序列比对以及隐马尔可夫模型预测，从巨桉基因组中鉴定出9个DHN基因成员，这些基因随机分布于巨桉11条染色体中的1号、2号、6号、9号和10号染色体上（表2）。其中9号染色体上含有4个成员、6号染色体两个成员，1、2、10号染色体各一个成员。对9个成员的蛋白质进行亚细胞定位预测，发现EgrDHN5/7/8/9定位于细胞质中，其余5个成员定位于细胞核内。

系统进化树显示拟南芥、水稻、毛果杨P. trichocarpa和巨桉的DHN基因家族编码的蛋白序列被分为5类（图1），其中Ⅰ类进化枝中包括水稻和拟南芥各1个成员、巨桉2个及毛果杨8个成员。Ⅱ类进化枝中包括巨桉EgrDHN3/4/6成员，毛果杨仅有PtrDHN3。Ⅲ类进化枝中包括拟南芥2个成员，毛果杨和巨桉分别包括2个、1个成员，且三个成员进化距离较近。在Ⅳ类进化枝中，包括巨桉3个成员，分别是EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9，还包含拟南芥2个成员以及水稻6个成员，但没有毛果杨PtrDHN。在所有分支中，Ⅴ类成员量最少，仅包括拟南芥的一个成员At3g50970。

2.2 巨桉EgrDHN家族成员蛋白质序列比对

DHN家族通常含有Y、S、K三类保守基序，位于DHN蛋白质C端的K-motif通常与植物抵抗低温等逆境相关[17]。巨桉EgrDHNs蛋白序列比对结果表明，EgrDHN1、EgrDHN2属于KnS型，其仅含有一个K-motif，位于氨基酸序列的中段。EgrDHN3、EgrDHN4、EgrDHN6为SKn型，均含有两个K-motif，其中一个K-motif位于C端。EgrDHN5、EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9属于YnSKn型（图2），它们同样含有2个K-motif，其中EgrDHN5含有3个Y-motif，EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9只含有2个Y-motif，蛋白类型的分类结果与系统进化基本相符（图2）。

2.3 启动子顺式作用元件分析

为探究EgrDHNs表达特性，对EgrDHNs起始密码子上游1 600 bp启动子中的顺式作用元件进行预测，发现多处包含胁迫响应、激素响应类元件（图3）。

对胁迫相关顺式作用元件进行分析（图3-A、B），发现EgrDHN基因家族主要包含STRE、LTR、MBS、TC-rich repeats、O2-site、MYC、MYB、GC-motif、DRE core和ARE等10种类型顺式作用元件。其中EgrDHN2/6/8的启动子中含有响应低温的LTR元件（low temperatureresponsive element，LTR），EgrDHN4/8启动子中含有缺氧特异性诱导元件GC-motif。大部分EgrDHNs基因的启动子中含有厌氧诱导相关元件ARE（anaerobic induction element），以及MYB、MYC等抗逆性相关顺式作用元件。

对激素响应元件进行分析（图3-C、D）发现，EgrDHNs启动子中主要存在脱落酸响应元件（ABRE）、生长素响应元件（AuxRR-core、TGA）、水杨酸响应元件（TCA、SARE）、茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif）、赤霉素响应元件（GARE-motif），每个成员的启动子中都至少含有两种上述响应元件，其中以脱落酸响应元件ABRE数量最多。

2.4 巨桉EgrDHNs在各组织器官中的表达特征

为了研究巨桉EgrDHNs的组织表达特异性，利用实时荧光定量PCR检测了9个EgrDHN家族成员在巨桉幼苗的根、茎、叶、顶芽、腋芽、子叶6个组织器官中的表达水平。结果显示EgrDHN1、EgrDHN3、EgrDHN4、EgrDHN5、EgrDHN6、EgrDHN7主要在根中表达；EgrDHN2在各器官中均有表达，在叶中表达最高；EgrDHN3在子叶和茎中低丰度表达，在腋芽中表达量最低；EgrDHN6主要在根中表达，子叶和茎中表达量最低；EgrDHN8、EgrDHN9主要在子叶中表达（图4）。

2.5 逆境胁迫下巨桉EgrDHNs的表达分析

在启动子元件预测中发现EgrDHN家族成员的启动子中含有与低温胁迫响应元件LTR、脱落酸响应元件ABA、干旱响应元件DRE core等相关元件，其中LTR元件与抵抗低温寒害相关，ABA则参与多种逆境胁迫响应，DRE core元件通过抵抗植物脱水而使植物免受损伤，为检测EgrDHNs成员对低温、ABA、高盐胁迫下的响应程度，对巨桉分别进行如下三种胁迫处理。

首先，在4 ℃下对巨桉幼苗分别进行不同时间的低温处理，然后收集叶片进行RT-qPCR检测。结果发现EgrDHN1、EgrDHN6、EgrDHN7在低温处理0～24 h内表达量很低，在48 h时达到最高表达量，随后在72 h时表达量减弱。EgrDHN2的表达量在处理48 h时达到最高，处理72 h时略微降低。EgrDHN3和EgrDHN4在处理24 h时表达量最高，随后降低。EgrDHN5处理后表达量下降，在48 h时才开始上升，72 h时表达量达最大值。EgrDHN8在处理0～12 h期间表达量极低，24 h时表达量开始上升，在48 h时达到最大后又开始下降。EgrDHN9在处理的第6 h时开始上升，12 h时达最大，随后也开始下降。上述结果说明EgrDHN基因家族成员均能受低温诱导表达，尽管仅有EgrDHN2/6/8启动子中含有LTR元件，但可能通过MYB、MYC等其他元件响应低温诱导（图5）。

其次，使用150 mmol/L NaCl溶液对巨桉幼苗灌根处理不同时间后对叶片进行取样，通过RTqPCR测定EgrDHNs的表达模式。表达结果显示，EgrDHN1在处理后3～24 h表达量下降。EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4、EgrDHN7在处理的第6 h时才上升至最大，但随后在12 h和24 h下降。EgrDHN6、EgrDHN8、EgrDHN9在处理的第3 h时表达量上升到最大值，随后在6～24 h表达量均较低。EgrDHN5在处理后3 h表达量升高至最大，随后下降（图6）。上述结果表明，巨桉EgrDHN基因家族中除EgrDHN1不受盐胁迫诱导表达，其余成员均可响应盐胁迫诱导表达。

最后，使用100 μmol/L ABA对巨桉幼苗叶片喷施处理不同时间后对叶片进行取样，通过RT-qPCR测定EgrDHNs表达模式。结果表明，EgrDHN1、EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4、EgrDHN6、EgrDHN9在处理第6 h时表达量上升且达到最大值；EgrDHN5、EgrDHN8在第3 h时上升，随后下降；EgrDHN7处理后表达量开始上升，至12 h时上升到最大值，随后下降（图7）。上述结果表明，所有巨桉EgrDHNs基因均能响应ABA诱导。

3 讨 论

巨桉作为全球9大主栽桉树种之一，在热带及亚热带地区引种非常成功[29]，因其生长迅速、干形通直饱满而作为最主要的人工用材林树种之一，对其抗逆性研究有助于进一步推广种植。本研究从巨桉中鉴定了9个EgrDHN家族成员，这与大多数物种的DHN基因家族成员数量相近。目前，在毛果杨[26]、拟南芥[25]、水稻[15]、猕猴桃[30]、苹果[31]、葡萄[32]、梨树[33]、蓝桉[34， 35]和冈尼桉[36]等物种均发现脱水素与抗逆性相关，但在巨桉中尚未针对脱水素基因家族展开系统性研究。

本研究发现巨桉EgrDHN家族与毛果杨、拟南芥均存在较大差异，功能可能不保守。首先，Ⅰ类进化枝中巨桉仅有EgrDHN1、EgrDHN2两个成员，拟南芥和水稻均只含一个成员，毛果杨则有8个成员，且8个成员中Kn型占5/8，在其他植物中Kn型多与低温、ABA等有关，直接响应冷驯化过程[18，37]，同时，拟南芥At1g54410具有防止重金属胁迫造成植物生理损害的功能[38]，巨桉EgrDHN1、EgrDHN2基因编码蛋白与上述基因的编码蛋白进化关系较近，可能具有抵抗冷害功能，但是否具有抵御重金属胁迫的功能还有待于研究。其次，Ⅱ类进化枝中所有成员均为SKn型，其中仅含毛果杨PtrDHN3一个成员，先前研究发现不同杨树中只有一个SKn型DHN基因，且能够响应多种逆境[39-40]，在拟南芥中异源表达毛果杨PtrDHN3增强拟南芥耐盐性。本研究发现毛果杨PtrDHN3与巨桉EgrDHN3、EgrDHN4处于同一分支，因此推测巨桉中EgrDHN3、EgrDHN4基因具有类似的抗逆功能，但是否存在功能冗余还有待于进一步研究。

巨桉大部分EgrDHNs成员在根系中表达量较高（图4），可能与根系水分吸收功能相关。脱水素在根部表达能够有效抑制根系水分吸收失调导致的植物细胞损害[41]。EgrDHN6在根、叶、腋芽部位组成型高表达，在子叶和茎中低表达，说明其可能不受早期发育过程调控，而EgrDHN8、EgrDHN9在子叶中高表达，推测其可能在早期发育中发挥作用。与其他成员不同的是EgrDHN2在所有组织部位中均高表达，尤其是叶片中表达量最高，这与水稻OsDHN2表达结果一致[42]，预测其在整个植株发育过程均发挥功能。在所有基因家族成员中没有发现在茎中特异性表达的成员，分析可能是因为植物茎为木质结构，负责输送营养，对脱水胁迫不敏感。

巨桉EgrDHN家族成员参与调控抗逆的方式具有独特性。先前文献报道，YnSKn型响应高盐和干旱胁迫，Kn型、SKn型、KnS型响应低温胁迫[25]，这与本实验结果有轻微差别。在本试验中除YnSKn型响应高盐表达外，KnS型EgrDHN2也响应表达，但KnS型EgrDHN1受胁迫后反而下调，在低温胁迫下YnSKn型也会响应表达（图5～6）。在低温、高盐、外源ABA处理下，除了EgrDHN1在高盐胁迫下会下调，其他巨桉EgrDHNs基因均能被诱导表达，尤为明显的是EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4。在启动子顺式作用元件预测分析中（图3）发现仅EgrDHN2、EgrDHN6、EgrDHN8存在低温响应元件LTR，说明除LTR外还存在其他响应低温胁迫的元件。此外，在EgrDHNs启动子元件中发现大部分成员均含有ABA的响应元件ABRE，通过外源ABA处理巨桉幼苗后EgrDHN基因家族也均能响应表达，其中EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4响应程度较高，但在调控元件预测中EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9含ABRE数量较多，说明除ABRE外可能还会通过其他途径来响应外源ABA的处理。

4 结 论

本研究从巨桉全基因组数据库中共鉴定出9个EgrDHN家族成员，依据其在染色体中的定位依次命名为EgrDHN1～EgrDHN9。蛋白质序列比对表明巨桉EgrDNHs各成员之间结构域比较保守，根据Y、S、K保守结构域片段的数量及位置可将其分为KnS、SKn和YnSKn三种类型。此外，结合顺式作用元件分析及低温、ABA以及NaCl胁迫处理后的表达分析，发现该家族成员多数响应低温、ABA以及NaCl胁迫，其中EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4的响应尤为敏感，这3个基因可能在调控巨桉抗逆性方面发挥重要作用。本研究结果为后续深入探究桉树EgrDHNs基因功能及通过基因工程改良桉树的性状提供候选基因。

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[本文编校：戴欧琳]