漾濞槭全基因组微卫星分布特征

摘 要：【目的】漾濞槭Acer yangbiense是世界濒危珍贵树种，研究其基因组中微卫星序列特征，为后期进行漾濞槭分子标记辅助育种，遗传多样性和遗传结构分析奠定基础和提供理论参考。【方法】基于测序获得的漾濞槭基因组序列，利用MISA软件进行搜索筛选，分析其微卫星分布特征。【结果】漾濞槭全基因组大小为665.89 Mb，其中筛选出1～6碱基重复类型的微卫星342 227个，总长度为5 621 833 bp，相对丰度为513.94个/Mb，相对密度为8 442.59 bp/Mb，约占整个基因组序列的0.84%。在漾濞槭6种类型的微卫星中，数量最多的碱基类型为单碱基，占6种碱基类型总数的62.23%；其次是二碱基，占总数的27.87%；三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的数量依次减少。在各碱基重复单元中数量最多的分别为 T、AT、AAT、AAAT、TTTTA、ATGGGG；漾濞槭全基因组微卫星中，前15种优势重复单元为 T、A、AT、TA、CA、TG、C、G、AG、TC、AAT、GA、CT、TTA和ATT，其中重复单元A和T的数量最多，且远多于其他重复单元，表现出明显的A/T碱基优势。所有搜索得到的微卫星中，挂载到染色体上的微卫星数量约占微卫星总数的98.04%，长度约占微卫星总长的98.07%。其中2号染色体上分布的微卫星数量最多，约占所有染色体上微卫星总数的12.02%。【结论】漾濞槭全基因组具有丰富的微卫星序列信息，存在A碱基和T碱基偏好性。漾濞槭在12～20 bp长度范围内SSR数量最多，在漾濞槭基因组中存在大量具有潜在多态性的SSR序列，具有较高的开发应用价值。

关键词：漾濞槭；微卫星；基因组；分布特征

中图分类号：S792.35 文献标志码：A 文章编号：1673-923X（2024）12-0178-09

基金项目：“十四五”国家重点研发计划（2022YFD2200401）；国家自然科学基金项目（32001357）；江苏省面上基金项目（BK 20211139）。

Distribution characteristics of microsatellites in the whole genome of Acer yangbiense

SHI Wenxi1， MA Qiuyue2， CHEN Zixin1， LI Qianzhong2， LI Shuxian1， LI Shushun2， ZHU Changhong3， ZHU Lu2， YAN Kunyuan2， DU Yiming2

（1. The Southern Modern Forestry Collaborative Innovation Center， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， Jiangsu， China； 2. Institute of Leisure Agriculture， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， Jiangsu， China； 3. Xiangyang Forestry Science and Technology Extension Station， Xiangyang 441022， Hubei， China）

Abstract：【Objective】Acer yangbiense is an endangered and valuable tree species in the world. This paper studied the distribution characteristics of microsatellites in the whole genome of A. yangbiense， which laid the foundation and provided reference for further study on the genome characteristics of A. yangbiense， molecular marker-assisted breeding， genetic diversity and genetic structure analysis of A. yangbiense.【Method】Based on the genome sequence of A. yangbiense， the characteristics of microsatellite distribution were analysed by using MISA software.【Result】A total of 342 227 microsatellites with 1-6 repeat types were screened out from the 665.89 Mb genome sequence of A. yangbiense， with a total length of 5 621 833 bp， the relative abundance was 513.94 pieces/Mb and the relative density was 8 442.59 bp/Mb， accounting for about 0.84% of the whole genome sequences. Among the six types of microsatellites， the most abundant microsatellite was mononucleotide， which accounted for 62.23% of the total number of 1-6 repeat types， followed by dinucleotide， which accounted for 27.87% of the total. The number of trinucleotide to hexanucleotide decreased in sequence. The largest number of repeat units were T， AT， AAT， AAAT， TTTA and ATGGGG. In microsatellite copies， the top 15 dominant duplicates were T， A， AT， TA， CA， TG， C， G， AG， TC， AAT， GA， CT， TTA and ATT， among which the number of repeat units A and T were the highest， and they were far more than other repetitive units， showing a significant A/T base preference. The number of microsatellites attached to chromosomes reached 98.04% of the searched microsatellites， and the length reached 98.07% of the total length of microsatellites. The number of microsatellites on chromosome 2 was the largest， accounting for 12.02% of the total number of microsatellites on all chromosomes.【Conclusion】The abundant microsatellite sequence information was obtained in the whole genome of A. yangbiense， with A and T base preference. The results showed that the number of SSRs was the largest in the range of 12-20 bp. There were a large number of SSR sequences with potential polymorphism in the genome of A. yangbiense， which had high development and application value.

Keywords： Acer yangbiense； microsatellite； genome； distribution characteristics

微卫星（Microsatellite），也叫简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）[1]，通常由1～6个或更多核苷酸串联组成[2]，SSR长度大多数小于300 bp。普遍存在于真核生物和原核生物以及病毒基因组中[3-4]。微卫星具有易于检测、多态信息含量高、高效稳定、分布广泛等特点[5]，近些年在物种保护[6-7] 、种质资源评价[8]、种群遗传多样性研究[9]、亲缘关系鉴定[10]、物种鉴定[11]等方面的应用越来越广泛[12-13]。

在传统方法中SSR的鉴定需要构建基因组文库[14]，操作过程繁琐，耗费较大时间和经济成本，局限性较大[15]。随着基因测序技术发展，简化了全基因组SSR开发的过程，缩短了开发时间，降低了经济成本和人为因素的影响。现在许多物种的全基因组测序工作及应用均已开展[16]，使得利用全基因组开发SSR标记的应用也越来越广泛。

槭属内物种多为高大乔木，树干笔直，叶形多变，叶色丰富[17]，在北美—欧亚大陆间断分布。中国是槭属植物分布最为丰富的地区，《中国植物志》记录全球槭属植物共有129种，在中国范围内有99种。槭属植物树形和叶片具有较强的观赏性，在园林绿化中应用较为广泛，世界各地广泛引种栽植[18]。漾濞槭A. yangbiense是无患子科Sapindaceae槭属Acer植物，其树形高大，叶纸质，总状花序下垂，花期在4月，果期9月，具有较高的观赏价值、经济价值和科研保护价值。漾濞槭仅分布于中国云南省大理州漾濞彝族自治县境内，生长于海拔2 200～2 500 m的林地，于2018年被列为濒危树种，收录于《世界自然保护联盟物种红色名录》，是世界上稀有和濒危的物种之一。

目前国内外对于漾濞槭这一物种的研究相对较少，仅停留在保护繁殖阶段。对于漾濞槭遗传资源的保护重视程度不足。迄今为止，漾濞槭微卫星相关的研究尚未见报道。本研究根据已公布的漾濞槭全基因组序列，利用生物信息学软件对漾濞槭全基因组微卫星丰度及分布情况进行分析，旨在为漾濞槭遗传资源的保护与开发、漾濞槭分子标记辅助育种、遗传结构与遗传多样性研究奠定基础和提供参考[19]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

漾濞槭全基因组序列从NCBI数据库下载，并以FASTA格式保存，基因组大小为665.89 Mb，下载网址为 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/ taxonomy/1000413/。

1.2 基因组序列中SSR位点挖掘

利用软件MISA（Microsatellite identification tool，MISA）作为漾濞槭全基因组中的微卫星的搜索筛选工具。将单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基设置为软件筛选参数。重复类型的最小拷贝数分别设置为10、6、5、5、5、5。

1.3 统计与分析

分别统计漾濞槭基因组中6种微卫星的数量、总长度、平均长度、相对密度和丰度。使用Excel 2019软件和SPSS 26.0软件对所得数据进行相关统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 漾濞槭全基因组SSR位点发掘及各类型微卫星重复序列的分布特征

基于约665.89 Mb漾濞槭基因组测序数据对SSR位点进行查找，共识别出342 227个SSR位点，平均每1.95 kb碱基就会有一个SSR位点。基因组序列的总有效长度为5 621 833 bp，占基因组序列总长度的0.84%。漾濞槭基因组微卫星相对密度为8442.59 bp/Mb，相对丰度为513.94个/Mb。

漾濞槭各类型微卫星长度和数量均存在较大差异，数量最多的微卫星类型是单碱基重复类型和二碱基重复，二者之和约占漾濞槭全基因组微卫星总数的90.10%。其中，单碱基重复类型微卫星数量为212 962，约占漾濞槭全基因组微卫星总数的62.23%；二碱基类型微卫星数量为95 384个，约占漾濞槭微卫星总数的27.87%；三碱基、四碱基、六碱基和五碱基类型微卫星的数量依次减少，分别为22 925、6 238、2 430和2 288。微卫星序列长度分布情况及所占比例基本与微卫星数量分布情况相同，长度最长的是单碱基类型，总长度为3 050 231 bp，其次是二碱基类型，总长度为1 843 474 bp。相对丰度和相对密度也是微卫星分布特征研究中的重要指标，漾濞槭全基因组6种类型微卫星的相对丰度和相对密度均相差较大，其中相对密度最大的是单碱基类型微卫星，密度为4 580.70 bp/Mb，其相对丰度也最大，达319.82个/ Mb。相对密度最小的是五碱基类型，相对丰度最小的是六碱基类型（表1）。

2.2 漾濞槭微卫星中各重复类型数量分布情况

在漾濞槭数量最多、占比最大的单碱基重复类型中（表2），重复单元T的数目最多，100 562个，占47.22%；A重复单元和T重复单元的数目相差不大，为100 256个，比例为47.08%；可见A碱基和T碱基为单碱基重复类型中的优势基元。在二碱基重复类型中，重复单元为AT/TA的数目最多，其中，AT重复单元数量为32 989个，比例为34.59%；TA重复单元数量为30 215个，占二碱基重复序列总数目的31.68%。三碱基重复类型中，数量最多的重复单元为AAT/TTA，数量达6 407个，在三碱基序列总数量中所占比例为27.95%。重复单元为AAAT/TTTA的数目是四碱基重复类型中最多的，为2 159个，占四碱基重复序列总数量的34.61%。五碱基重复类型中，重复单元TTTTA/ AAAAT的重复数目最多，为231个，在五碱基重复序列总数中所占的比例为9.51%。在六碱基重复类型中，每种重复单元的数目均较少，占比也较少，其中数量最多的重复单元是ATGGGG，数量仅为73个，占六碱基重复序列总数目的3.19%，CCCCAT的数量次之，为65个。

漾濞槭基因组中，6种碱基类型均随着重复拷贝数的增加，微卫星数量逐渐递减，拷贝数超过300次的序列数量占漾濞槭基因组序列总数的97.42%，因此，对漾濞槭拷贝数超过300次的序列进行分析，有助于漾濞槭优势碱基的分析。拷贝数超过300次的序列有36种（表3），主要为单碱基、二碱基、三碱基和四碱基重复类型，总数是330 191个，占所搜索到的微卫星重复类型总数的96.48%，而五碱基重复和六碱基重复类型总数仅占3.52%。在漾濞槭基因组中，数量最多的前25个拷贝类型依次为T、A、AT、TA、CA、TG、C、G、AG、TC、AAT、GA、CT、TTA、ATT、GT、AC、TAT、AAAT、TTC、GAA、ATA 、 TCT、TTTA和AAG（图1）。

2.3 漾濞槭基因组各碱基重复类型重复次数的分布情况

漾濞槭基因组中各碱基重复类型微卫星的重复次数分布差异较大，重复次数最少的仅5次，重复次数最多的达到107次，且重复次数和SSR数量呈负相关（图2）。在漾濞槭6种碱基类型中，大多数微卫星数量集中分布在5～25次的范围中，在漾濞槭各碱基微卫星总数中所占比例大于95%。单碱基重复类型的重复次数范围最宽，重复次数在10～25次范围内的微卫星数量最多，为202 838个，在单碱基重复类型微卫星总数中所占比例达到95.25%，其中，重复次数为10次的SSR数量最多，为60 058个。二碱基重复类型的重复次数分布和单碱基重复类型的重复次数分布大体相似，大多数微卫星在6～25次范围内分布，在二碱基重复类型微卫星总数量中所占比例为96.95%，重复次数为6时，微卫星数量分布最多，为31 420个。从三碱基重复类型开始，重复次数分布范围逐渐变窄，不同重复次数的微卫星数量也不断减少。三碱基重复类型中，绝大多数微卫星重复次数均分布在5～15次，在三碱基重复类型微卫星总数量中所占比例达到99.43%。四碱基，五碱基和六碱基重复类型中，重复次数的分布范围十分相似，均集中分布在5～10次内，在各碱基类型微卫星总数中所占比例也相近，均达到99%以上，重复次数为5时，微卫星的数量均最多，分别为3 787、1 576和1 460个（图3）。

2.4 漾濞槭基因组微卫星长度分布及变异情况

漾濞槭基因组微卫星长度在10～318 bp，平均长度为32.10 bp，最长的可达318 bp，最短的为10 bp。长度为10～20 bp的微卫星数量最多，达到278 512个，占漾濞槭基因组微卫星总数的81.38%，其中长度为10～15 bp的数量为209 205个，占比为61.13%；长度为16～20 bp的数量为69 267个，占比为20.24%；大于60 bp的微卫星数量为58 817，占总数的17.19%。因此，漾濞槭基因组中微卫星的长度分布差异较大（图4）。

本研究对漾濞槭不同类型的微卫星长度变异情况进行了分析，结果显示：SSR序列长度变异程度最高的碱基重复类型为单碱基，共有69种类型；其次为二碱基重复，共59种类型；三碱基、六碱基、四碱基、五碱基重复的SSR序列长度类型依次减少，分别为22种、14种、10种和7种类型，变异程度也依次降低，变异程度最低的碱基重复类型为五碱基。此外，在6种重复类型中，微卫星重复区序列长度和微卫星数量呈负相关。

2.5 漾濞槭基因组微卫星在染色体上的分布

根据获得的漾濞槭全基因组序列信息搜索获得的微卫星中，一共拼接组装大小是5 621 833 bp，其中成功挂载到染色体长度为5 513 594 bp，约占总长的98.07%。在已成功挂载到染色体上的基因组序列中鉴别获得的微卫星数量为335 517个，约占所有微卫星总数的98.04%。6种类型微卫星在漾濞槭不同染色体数量分布见表4，由表4可知，分布在chr2号染色体上的微卫星数量是漾濞槭13条染色体中最多的，为40 343个，在所有染色体上微卫星总数中所占比例约为12.02%；其次是chr1号和chr3号染色体，微卫星数量分别为38 482和35 925个，二者数量差别不大；chr13号染色体上分布的微卫星数量是最少的，为19 704个。在漾濞槭13条染色体中，单碱基类型微卫星数量是最多的，二碱基、三碱基、四碱基的数量在13条染色体中依次下降，五碱基和六碱基微卫星数量相差不大，均为13条染色体中数量最少的。

3 讨 论

3.1 漾濞槭基因组优势碱基类型分析

由于过度开发，人为的环境污染，自然条件改变等，许多植物濒临灭绝，保护研究濒危植物的工作面临挑战。微卫星标记因其特性成为分析研究珍稀濒危物种的重要途径和重要依据。由现有研究可得，二碱基重复类型为自然界中大多数植物基因组的主要重复类型[20]，例如山柚子科Opiliaceae长蕊甜菜树Yunnanopilia longistaminata[21]、蔷薇科Rosaceae云南栘（木衣）Docynia delavay[22]等，这与本研究漾濞槭基因组中主要重复类型为单碱基重复类型的结论不同。本研究通过对漾濞槭全基因组序列分析微卫星特征分析发现在漾濞槭全基因组665 887 899 bp序列中，共筛选出6种微卫星重复类型的微卫星序列342 227个，总有效长度为5 621 833 bp，相对丰度为513.94个/Mb，相对密度为8 442.61 bp/Mb，约占漾濞槭全基因组序列的0.84%。在漾濞槭6种类型的微卫星中，数量最多的碱基类型为单碱基，占6种碱基类型总数的62.23%，其次是二碱基，占总数的27.87%，三碱基～六碱基的数量依次减少，数量最少的为六碱基类型，仅占微卫星总数的0.67%。同样，兰科Orchidaceae铁皮石斛Dendrobium officinale[23]、鼠李科Rhamnaceae枣Ziziphus jujuba[24]以及濒危植物桦木科Betulaceae天目铁木Ostrya rehderiana[25]、蝶形花科Papilionaceae黑黄檀Dalbergia fusca[26]等基因组中SSR序列也均以单碱基重复类型为主，这与本研究结论一致。自然界中，也有植物以六碱基为主要重复类型，如胡桃科Juglandaceae薄壳山核桃Carya illinoinensis[27]和木兰科Magnoliaceae望春玉兰Magnolia biondii[28]等。还有少部分植物以三碱基为主要重复类型，如松科Pinaceae白皮松Pinus bungeana[29]等。由此可见，不同科不同种之间，基因组的大小不同，碱基的组成含量不同，因此，优势的微卫星类型也不同。

3.2 漾濞槭基因组中优势重复单元碱基组成分析

在多数真核生物基因组中，微卫星都富含A和T碱基，且数量显著高于G和C碱基。整体来看，槭属基因组中SSR位点的重复基元组成以A/T碱基为主，在单碱基重复至六碱基重复中，数量最多重复基元类型都为A/T碱基构成。本研究漾濞槭全基因组微卫星中，前10种优势重复拷贝类别为T、A、AT、TA、TG、CA、G、C、AG和TC，其中，数量最多的碱基重复类型为T碱基和A碱基，说明漾濞槭SSR序列和多数真核生物一样，具有显著的A/T碱基偏好性。但有些植物如杨梅Myrica rubra、小麦Triticumaes tivum显著偏好G/C[30-31]。此前研究显示，双子叶植物SSR二碱基重复多以AG/CT类型为主，而三碱基重复以AAG/CTT类型为主，但本研究漾濞槭基因组SSR分布特征研究显示，在漾濞槭基因组中，AT/TA为绝对优势的二碱基重复类型，AAT/TTA为绝对优势的三碱基重复类型。但无患子科Sapindaceae龙眼Dimocarpus longan基因组SSR的研究显示，龙眼基因组中AG/CT，GAA/TTC分别是二碱基重复与三碱基重复的优势类型[32]。由此可见，即使同科之间，物种不同，优势重复单元也可能存在显著差异。

3.3 漾濞槭基因组中不同重复微卫星的长度分布及变异情况

SSR的重复序列长度也是影响SSR多样性的重要因素，整体来看，槭属植物基因组中包含SSR位点丰富，且分布密度较大。本研究对漾濞槭基因组SSR长度的统计分析可以看出，漾濞槭在12～20 bp长度范围内SSR数量最多。这与现有的其他槭属植物的基因组研究结果相同[33]。在漾濞槭基因组中，单碱基重复类型的长度变异程度最高，变异类型达69种，其次是二碱基重复类型，长度变异类型为59种，表明其获得（失去）重复单元的活跃程度高，变异程度较高，多态性丰富。此外，漾濞槭在长度较长的SSR序列中依然保持着较多的数量，这也与其核苷酸重复次数种类较多有关。植物基因的稳定性与微卫星重复序列的长度成反比，如果植物面临趋同选择压力，SSR将集中分布在较短的序列范围内[34-35]。由此可知，微卫星长度较短的单碱基和二碱基重复类型是对漾濞槭基因变异产生主要影响的微卫星类型。

以往研究表明，SSR长度是决定其多态性的重要因素[36]，本研究对漾濞槭基因组SSR长度分布的研究结果显示，SSR长度主要集中在10～20 bp，且SSR 长度与数量呈现负相关，这与槭属其他植物，如梣叶槭A.negundo、糖槭A.saccharum、梓叶槭A.catalpifolium等植物的研究结果类似。

在漾濞槭基因组SSR重复次数的统计中可以发现，单碱基至三碱基重复类型在漾濞槭基因组中都存在重复出现较多的类型，重复次数较多的SSR类型具有较高的多态性，表明在漾濞槭基因组中存在大量具有潜在多态性的SSR序列，具有较高的开发应用价值[37]。本文对漾濞槭全基因组微卫星分布特征进行研究分析，为SSR引物开发提供帮助，并为进一步研究漾濞槭全基因组特征，进行漾濞槭分子标记辅助育种，遗传多样性和遗传结构分析奠定基础和提供参考。但SSR标记在检测过程中可能出现基因带重叠，造成研究结果不准确等问题，因此未来SSR标记的开发还需要提升标记的检测速度和灵敏性，并进一步地研究与改进。

4 结 论

本研究基于漾濞槭全基因组序列挖掘微卫星位点，分析了漾濞槭全基因组微卫星的分布特征。漾濞槭全基因组大小为665.89 Mb，其中筛选出1～6碱基重复类型的微卫星342 227个，总长度为5 621 833 bp，相对丰度为513.94个/Mb，相对密度为8 442.59 bp/Mb，约占整个基因组序列的0.84%。二碱基重复类型为自然界中大多数植物基因组的主要重复类型，但在漾濞槭6种类型的微卫星中，数量最多的碱基类型为单碱基，占6种碱基类型总数的62.23%。漾濞槭SSR序列和多数真核生物一样，具有显著的A/T碱基偏好性。在漾濞槭基因组中，AT/TA为绝对优势的二碱基重复类型，AAT/TTA为绝对优势的三碱基重复类型，漾濞槭在12～20 bp长度范围内SSR数量最多，微卫星长度较短的单碱基和二碱基重复类型是对漾濞槭基因变异产生主要影响的微卫星类型，在漾濞槭基因组中存在大量具有潜在多态性的SSR序列，具有较高的开发应用价值。

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[本文编校：戴欧琳]