NEK6在卵巢癌中的表达及临床意义*

[摘" "要]" "目的：探讨永离有丝分裂基因A相关激酶6（never in mitosis gene A-related expressed kinase 6， NEK6）在卵巢癌组织中的表达水平，分析其表达与临床病理因素及预后之间的关系。方法：收集临床上卵巢癌患者的肿瘤及正常卵巢组织，用实时定量PCR（real-time quantitative PCR， RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western Blot）检测卵巢癌组织和正常卵巢组织中NEK6的表达情况，并用免疫组织化学的方法检测110例卵巢癌患者中NEK6的表达水平，分析其表达水平与年龄、病理类型、肿瘤分期、组织分级、转移之间的关系，用Kaplan-Meier生存分析法分析NEK6在卵巢癌中的表达水平与患者生存期之间的关系。结果：RT-qPCR、Western Blot及免疫组织化学结果均显示卵巢癌组织中的NEK6表达水平显著高于正常卵巢组织（均Plt;0.01）；NEK6在卵巢癌患者肿瘤组织中的表达水平与卵巢癌的组织分级（P=0.008）、转移（P=0.006）呈正相关；Kaplan-Meier分析显示NEK6高表达水平的患者总生存期显著低于NEK6低表达患者（Plt;0.01）。结论：NEK6在卵巢癌患者的肿瘤组织中高表达，并影响卵巢癌的转移，提示NEK6可能参与卵巢的发生发展，可以作为潜在的卵巢癌预后指标。

[关键词]" "卵巢癌；永离有丝分裂基因A相关激酶6；预后

[中图分类号]" "R737.31" " " " " " " "[文献标志码]" "A" " " " " " " "[文章编号]" "1674-7887（2024）03-0232-04

The expression and clinical significance of NEK6 in ovarian cancer*

GAO Sainan1**， ZHANG Yuquan1***， BIAN Tingting2， LIU Yifei2， SU Min1" " " " （1Department of Obstetrics and Gynecology， 2Department of Pathology， the Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001）

[Abstract]" "Objective： To detect the expression of never in mitosis gene A-related expressed kinase 6（NEK6） in ovarian cancer tissue， and to investigate the correlation between its expression and clinical-pathological parameters as well as prognosis. Methods： Collecting tumor and normal tissues from clinical ovarian cancer patients， the real-time quantitative PCR（RT-qPCR） and Western Blot assays were used to detect the expression of NEK6 in ovarian cancer and normal ovarian tissues， and immunohistochemistry was used to detect the expression of NEK6 in 110 ovarian cancer patients. The relationship analysis was performed between its expression and age， pathological type， tumor stage， tissue grading， and metastasis. Kaplan-Meier survival curve was used to analyze the relationship between NEK6 expression in ovarian cancer and patient survival. Results： RT-qPCR， Western Blot， and immunohistochemistry results all showed that NEK6 levels in the tissues of ovarian cancer were significant higher than those in normal ovarian tissues（all Plt;0.01）. The expression level of NEK6 was positively correlated with the tissue grading（P=0.008） and metastasis（P=0.006） of ovarian cancer. Kaplan-Meier analysis showed that patients with high expression of NEK6 had significantly lower overall survival than those with low expression（all Plt;0.01）. Conclusion： NEK6 was highly expressed in the tumor tissue of ovarian cancer patients and affects the metastasis of ovarian cancer， suggesting that NEK6 may be involved in the occurrence and development of the ovary and can serve as a potential prognostic indicator for ovarian cancer.

[Key words]" "ovarian cancer; never in mitosis gene A-related expressed kinase 6; prognosis

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，死亡率占各类妇科肿瘤的首位。因发现时多为晚期，故5年生存率仅为30%左右，对妇女生命造成严重威胁[1-3]。因此，发现卵巢癌早期诊断的生物学标志物和找到新的分子治疗靶标是攻克卵巢癌的首要任务，也是目前卵巢癌分子病理机制研究的热点。

已证实永离有丝分裂基因A相关激酶（never in mitosis geneA-related expressed kinase， NEK）家族在多种肿瘤中表达异常，如乳腺癌[4-5]、肺癌[6]、前列腺癌[7]、胰腺癌[8]、胃癌[9]、结直肠癌[10]、肝细胞癌[11]。然而，除了在乳腺癌[12]中进行了较深入的研究外，NEK家族促进其他恶性肿瘤（包括卵巢癌）生长的分子机制罕见报道。本研究旨在研究NEK6在卵巢癌患者肿瘤组织中的表达水平，并结合患者的临床病理特征及生存期等临床影响因素，分析与NEK6表达的相关性，从而揭示NEK6对卵巢癌的作用，为卵巢癌的发病机制提供新的研究思路。

1" "材料和方法

1.1" "临床资料" "收集2005年1月—2010年12月在南通大学附属医院妇科接受卵巢癌切除手术110例患者的肿瘤组织样本，年龄24～80岁，根据2013年国际妇产科联盟（Federation International of Gynecology and Obstetrics， FIGO）诊断标准进行临床分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期49例；浆液性癌76例，黏液性癌5例，子宫内膜样癌12例，透明细胞癌10例，其他类型癌7例；组织分级为Ⅰ/Ⅱ级76例，Ⅲ级34例。所有患者术前均未进行任何治疗包括手术、放疗、化疗、激素及免疫治疗。收集30例手术切除的新鲜冻存的卵巢癌及正常卵巢组织，进行实时定量PCR（real-time quantitative PCR， RT-qPCR）和Western Blot分析其NEK6的表达情况。组织经取材后立即置于无菌冻存管中，并于-80 ℃保存。术后每2～3个月电话随访患者1次。本研究经南通大学附属医院伦理委员会审核并批准（2022-L004）。

1.2" "主要试剂" "TRIzol®RNA提取试剂和One-Step SYBR Green RT-qPCR Kit购自美国Thermo Fisher Scientific公司；RIPA裂解液购自Beyotime公司；PCR引物购于Biomics公司；NEK6、GAPDH、HRP偶联IgG抗体均购自Proteintech公司。

1.3" "RT-qPCR" "将新鲜冻存组织置于冰上匀浆后，按操作说明书，用TRIzol®RNA提取试剂提取总RNA。用One-Step SYBR Green RT-qPCR Kit进行定量PCR反应，反应体系及反应条件参照以前的报道[13]进行。引物序列为：NEK6上游引物：5′-TCTTG-AAGCAACTGAACCA-3′；下游引物：5′-CCAACTC-CAGCACAATGT-3′。GAPDH上游引物：5′-GGAG-CGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTG-TTGTCATACTTCTCATGG-3′。实验结果用2-ΔΔCt法[14]进行表达水平分析。

1.4" "蛋白质印迹" "收集新鲜冰冻卵巢癌组织及相应的正常卵巢组织各约100 mg，用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，BCA试剂盒蛋白定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转膜到PVDF膜上，5%脱脂牛奶37 ℃封闭2 h，用NEK6抗体（1∶500稀释）或GAPDH抗体（1∶5 000稀释）在4 ℃孵育过夜。TBST洗涤1 min×3次，PVDF膜用HRP偶联 IgG（1∶5 000稀释）在37 ℃孵育1 h。经TBST洗涤5 min×3次，用ECL显影，蛋白印迹用Image J软件测定灰度值分析。

1.5" "免疫组织化学" "按以前的报道[13]制备组织芯片并将芯片进行烤片、脱蜡、水化、抗原修复等处理，封闭血清室温封闭2 h；用NEK6抗体（1∶50稀释）在4 ℃孵育过夜，经PBS洗涤后，用HRP标记的二抗室温孵育30 min，PBS冲洗3 min×3次，DAB显色后苏木精复染细胞核，自来水冲洗后并经脱水，中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。结果参照文献[13]进行分析。

1.6" "统计学方法" "所有实验均重复3次，各组数据均以x±s表示，用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。两组数据之间的差异比较用Student′s t检验，多组样本数据之间的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），NEK6表达高低与卵巢癌患者临床病理参数之间的相关性用χ2检验，用Kaplan-Meier法进行卵巢癌患者生存曲线绘制。检验水准取0.05。

2" "结" " " 果

2.1" "NEK6在卵巢癌及正常卵巢组织中的表达情况" "与正常卵巢组织相比，NEK6在卵巢癌组织中的mRNA和蛋白表达水平显著升高（Plt;0.05），见图1。

2.2" "卵巢癌患者肿瘤组织中NEK6的表达水平及与临床病理参数间的相关性" "免疫组织化学结果显示，NEK6主要在细胞质中呈阳性，在正常卵巢组织中表达较弱，在卵巢癌组织中低表达或高表达，见图2。NEK6高表达率为58.18%（64/110），低表达率为32.73%（36/110），见表1。NEK6在卵巢癌组织中的高表达水平与卵巢癌的组织分级（P=0.008）和转移（P=0.006）呈正相关，且组织分级越高或发生转移患者的肿瘤组织中NEK6的表达水平越高，与年龄、病理类型、FIGO分期无显著相关性（Pgt;0.05），见表1。

2.3" "NEK6的表达与卵巢癌患者预后的关系" "Kap-lan-Meier生存分析法结果显示，低表达NEK6的卵巢癌患者中位生存时间为61个月，高表达NEK6的卵巢癌患者为38.5个月，两者总生存期比较差异有统计学意义（Plt;0.01），见图3。

3" "讨" " " 论

卵巢癌以上皮性癌最多见，是女性生殖系统最致命的肿瘤。临床上治疗卵巢癌主要为手术、化疗、靶向治疗等，但复发率高，存活率低。近年来，癌症的基因检测和筛查越来越受到重视，在基因水平靶向治疗癌症也越来越受到好评。随着癌症基因治疗取得了多项突破性进展，肿瘤靶向治疗药物也受到临床医务工作者的青睐。因此，进一步挖掘卵巢癌的新型治疗靶点和生物标志物，对改善卵巢癌患者的预后至关重要。

NEK蛋白家族由11个成员组成，分别位于不同的细胞区域，参与细胞周期、细胞周期限制点、纤毛形成、衰老、端粒维持和化学抗性等细胞生物学过程[15]。NEK激酶在细胞周期的G1期表达较低，S期和G2期表达增加，细胞进入有丝分裂后表达减少。与其他细胞周期相比，NEK活性在S期和G2期达到高峰，并在G2/M期协助中心体分离。因此，NEK异常高表达可能会导致癌细胞的染色体不稳定性和非整倍体的产生。并且，NEK异常高表达可以激活多条致癌信号通路，使正常细胞通过获得增殖、侵袭和耐药能力而转化为癌细胞[16]。

NEK6是新近发现的一种能调节细胞周期，并对多种信号通路激酶和转录因子有重要调控作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于NEK家族的重要成员之一[17]。研究[18]发现NEK6在133例乳腺癌标本中的表达均高于正常组织，且NEK6的高表达与乳腺癌的组织学分级、肿瘤大小和TNM分期有关，且NEK6表达是乳腺癌预后的独立预测因子，提示其可能成为乳腺癌的潜在治疗靶点。

本研究显示NEK6在卵巢癌组织中蛋白和mRNA表达水平显著高于正常卵巢组织，且免疫组化也显示NEK6在卵巢癌组织中高表达率达58.18%。提示NEK6可能是卵巢癌促癌基因之一，可作为卵巢癌潜在的生物标志物，或成为卵巢癌诊断分子之一。通过进一步分析发现NEK6与卵巢癌患者的组织学分型、转移显著相关，且NEK6表达异常升高与患者生存期短显著相关，提示NEK6可能作为卵巢癌患者不良预后因子之一。本研究将进一步在细胞水平研究NEK6在卵巢癌细胞株中的表达情况，以及NEK6表达变化对卵巢癌细胞生长、转移、侵袭及凋亡等生物功能的影响。从而最终揭示NEK6在卵巢癌发生发展中的作用机制，为临床卵巢癌诊断和治疗提供新思路和新靶标点。

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[收稿日期] 2024-01-23