基于广泛靶向代谢组学解析不同树龄及栽培条件的野酿2号腺枝毛葡萄类黄酮差异

摘要：【目的】基于广泛靶向代谢组学分析不同树龄及栽培条件的野酿2号腺枝毛葡萄类黄酮差异代谢物情况，为提升葡萄及葡萄酒品质提供理论参考依据。【方法】以不同树龄及栽培条件（地域和架式）的野酿2号腺枝毛葡萄为试材，测定粒重、pH、可溶性固形物、可滴定酸含量及亮度值（L*）、红—绿色度值（a*）、黄—蓝色度值（b*），并利用超高效液相色谱—串联质谱仪对其成熟期葡萄果实进行广泛靶向代谢组学分析。【结果】不同树龄及栽培条件的野酿2号腺枝毛葡萄理化指标之间存在不同程度的差异，栽培地域对葡萄果实理化指标影响较大，栽种于相思湖葡萄示范基地的果实成熟度更好，但果粒较小、果皮颜色较浅；栽培架式及树龄对葡萄果实的粒重影响较小，对糖酸含量影响较大；同一地域采用篱架栽培的葡萄果实较棚架栽培成熟度更好，且树龄越大，果实成熟度越好。从不同树龄及栽培条件的成熟期葡萄果实中共鉴定出11类789种代谢物，其中黄酮类最多，为187种。12个样品中共存在271个差异代谢物，共聚为7个类群，黄酮类化合物在各亚类中占比最高，特别是第Ⅱ类群，占比高达59%，其次是第Ⅰ类群，占比为49%。利用差异代谢物能明确区分来自不同地域、架式和树龄的葡萄果实样品，其中地域样品间的差异最大，且黄酮类化合物是造成差异的最主要化合物。明阳双季葡萄示范基地栽培较相思湖葡萄示范基地栽培更利于杨梅素、槲皮素、表儿茶素及甲基花翠素等类黄酮化合物的积累，5年树龄较8年树龄更有利于促进山柰酚、儿茶素和花青素的积累，而棚架栽培较篱架栽培更利于黄烷-3-醇、花青素双糖苷和花葵素双糖苷的积累。可溶性固形物含量与黄酮醇中的槲皮素和杨梅素含量呈显著负相关，L*和a*均与杨梅素呈显著负相关。【结论】不同树龄及栽培条件的野酿2号腺枝毛葡萄果实类黄酮代谢物含量存在差异，其中地域影响最明显。

关键词：腺枝毛葡萄；野酿2号；广泛靶向代谢组学；树龄；栽培条件；差异代谢物；类黄酮化合物

中图分类号：S663.1文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）08-2262-15

Analysis of flavonoids differences in Vitis heyneanaRoem.etSchult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）Yeniang No.2 grape atdifferent vine ages and under different cultivation conditionsbased on widely targeted metabolome

XIE Lin-jun ZHANG Jin ZHOU Yong-mei WEI Rong-fu PANG Li-ting WU Dai-dong LI Hong-yan LIU Jin-biao ZHOU Si-hong2*，CHENG Guo1*

（1Grape and Wine Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China；2College of Agriculture，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】Based on widely targeted metabolome，the differential metabolites of flavonoids in Vitisheyneana Roem.et Schult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）Yeniang No.2 grape at different vine ages and under different cultivation conditions were studied，providing theoretical reference for improving grape and wine quality.【Method】Yeniang No.2 grapes at different vine ages and under different cultivation conditions（regions and trellis systems）were used as test materials to measure berry weight，pH，soluble solids，titratable acid content，brightness value（L*），red-green color value（a*），yellow-blue color value（b*）.Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spec-trometer was used for widely targeted metabolome of grape berries at maturity stage.【Result】There were varying degrees of differences in the physicochemical indicators of Yeniang No.2 grapes with diffe-rent vine ages and cultivation condi-tions.The regions had greater impact on the physicochemical indicators of grape fruits，and the fruits planted in the Xiang-sihu demonstration vineyard had better maturity，but with smaller berries and lighter skin color.The trellis systems and vine ages had slight impact on the berry weight of grapes，but had great impact on the sugar and acid content.Grapes grown on shed frame in the same region had better fruit maturity than those grown on hedgerow frame，and the older the vines，the better the berry maturity of the plants.A total of 789 metabolites belonging to 11 ca-tegories were identified from mature grape berries of different vine ages and cultivation conditions，among which flavonoids were the most abun-dant，accounting for 187 species.There were a total of 271 differential metabolites among 12 samples，which were clus-tered into 7 groups.Flavonoids compounds had the highest proportion among all subtypes，especially groupⅡ，which ac-counted for 59%，followed by groupⅠ，which accounted for 49%.Differential metabolites could be used to clearly distin-guish grape samples from different regions，trellis systems and vine ages，with the greatest diffe-rences between regional samples，and flavonoids were the main compounds that causing the differences.The cultivation of Mingyangdemonstra-tion vineyard was more conducive to the accumulation of flavonoids such as myricetin，quercetin，epicatechin and petuni-din than the cultivation of Xiangsihu demonstration vineyard.Compared with the 8-year-old vine，the 5-year-old vine pro-moted the accumulation of kaempferol，catechins and cyaniding，while the shed frame was more conducive to the accu-mulation offlavan-3-ol，cyanidin-3，5-O-diglucoside and pelargonidin-3，5-O-diglucoside than hedgerow frame.Thecorrela-tion analysis results showed that the content of soluble solids was significantly negatively correlated with the content of quercetin and myricetin in flavonols，and L*and a*were significantly negatively correlated with myricetin.【Conclusion】The contents of flavonoid metabolites of V.heyneana Roem.et Schult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）Yeniang No.2 grapes are different at different vine ages and under different cultivation conditions，and the influence of region is the most obvious.

Key words：Vitisheyneana Roem.et Schult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）；Yeniang No.2；widely targeted me-tabolome；vine ages；cultivation conditions；differential metabolites；flavonoids compound

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32360720）；Guangxi Natural Science Foundation（2024GXNSFAA010474）；Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021 YT125）；Science and Technology Development Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（2022JM76）

0引言

【研究意义】腺枝毛葡萄［Vitis heyneana Roem.et Schult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）］属真葡萄亚属东亚种群，被认为是毛葡萄（V.heyneana Roem.et Schult.）的一个变种，是喀斯特山区推广种植的致富果（刘崇怀等，2014；谢文远等，2021；郝俊光等，2024）。2022年广西境内毛葡萄栽培面积约6720ha，产值5.47亿元，毛葡萄栽培与加工产业对当地农民脱贫致富发挥了重要作用。广西毛葡萄种植面积位居世界首位，其中野酿2号的栽培面积最大，该品种具有独特的香气，氨基酸、维生素等多种营养物质含量丰富，同时花色苷及有机酸含量较高，是酿造毛葡萄酒的主要原料（赵明等，2018；管敬喜等，2020）。大量研究及生产实践表明，毛葡萄果实存在低糖高酸、单宁含量低等突出问题，导致加工成的葡萄酒存在酒体酸涩、粗硬、颜色不稳定等缺陷，成为产业高质量发展的瓶颈问题（李记明和贺普超，2003）。类黄酮化合物是葡萄和葡萄酒中重要的次生代谢物，包括黄酮醇、黄烷醇和花色苷，经由苯丙烷—类黄酮路径合成，这些化合物不仅能保护葡萄减轻病虫害伤害，还对葡萄果实的色泽、风味及营养价值起着决定性作用（Flamini et al.，2013；Gouotetal.，2019；任小丹等，2022）。在发酵过程中，类黄酮物质通过浸渍从葡萄果皮、种子进入葡萄酒，赋予红葡萄酒收敛性、色泽和风味，对提高酒体醇厚感与结构感，保持酒体颜色的稳定具有决定性作用（Bindon et al.，2017）。葡萄果实中类黄酮化合物越丰富，酿造的葡萄酒酒体越饱满、骨架感越强，增加葡萄果实中类黄酮化合物含量是提高葡萄酒品质及保健作用的关键（张付春，2022）。葡萄中类黄酮的形成与积累具有明显的品种、组织和时空特异性，且类黄酮的种类和含量也存在较大的差异（卢素文等，2021）。葡萄品种是决定果实特征和品质的重要因素，栽培地域、架式及树龄等均会对果实生长发育、风味物质代谢和品质特征形成产生影响（Longoetal.，2018；金宇宁，2023；王晓玥等，2023）。生产中，不同酿酒葡萄品种的栽培管理方式不同，研究不同品种的最佳栽培管理方式对提升果实和酒的品质具有重要意义。利用广泛靶向代谢组学（Widely targeted metabo-lome）技术分析不同树龄及栽培条件下野酿2号腺枝毛葡萄果实代谢物的差异，重点分析类黄酮化合物在各处理间差异化合物的代谢特征，为改进栽培措施和提升葡萄品质提供参考，对生产优质毛葡萄酒、增加毛葡萄产业附加值具有重要意义。【前人研究进展】葡萄果实中黄酮类化合物种类和含量由遗传因素决定，同时还受光照、温度、水分和栽培管理措施等条件的影响，这些因素共同调节果实中黄酮类化合物的代谢（Rienthetal.，2021）。众多学者围绕架式、生态条件及产地等开展了不同栽培方式对葡萄果实品质相关代谢物影响的研究，李舒婷等（2018）研究发现，相比露地栽培，避雨栽培赤霞珠葡萄果皮中类黄酮物质的种类无改变，总体上有利于黄酮醇类物质的积累，并促进了黄酮醇和黄烷醇甲基化比例提高。姚瑶（2020）研究了新疆4个不同产区的葡萄酒挥发性香气成分、非花色苷酚类物质、花色苷类物质及其在瓶储期内的品质变化，阐明不同产区的葡萄酒各有特色。Wang等（2021）研究表明，采用黑色土工布行间地膜覆盖降低了葡萄中花青素的含量，并抑制黄酮醇的积累，反映了小气候参数对黄酮类化合物积累的重要性。大量代谢产物在不同栽培方式之间的变化可通过代谢组学技术进行建立和表征。近年来，广泛靶向代谢组学技术在葡萄果实代谢产物检测领域应用较广（Koyama et al.，2012；金宇宁，2023），如丁亭亭等（2023）通过广泛靶向代谢组学分析了品丽珠葡萄转色中果皮代谢物，共检测出29类416种代谢物；朱羿博等（2024）研究发现不同刺葡萄品种果皮的代谢物质有较大差异，主要表现为类黄酮化合物含量的差异。本课题组前期利用广泛靶向代谢组技术研究了一年两收栽培模式下巨峰葡萄夏果和冬果代谢产物差异情况，两季果实中有551种代谢物存在差异，黄酮类化合物是两季果实生长发育阶段最重要的差异化合物，大部分黄酮类化合物在冬季葡萄中含量较高，尤其是黄酮醇和黄烷-3-醇（Cheng et al.，2023b）。另一方面，将广泛靶向代谢组学技术与其他组学或检测技术相结合，能深入挖掘葡萄果实风味化合物代谢调控机理。Ju等（2020）将广泛靶向代谢组学方法与实时荧光定量PCR检测相结合，深入挖掘刺葡萄品质相关化合物的代谢特征，结果发现刺葡萄富含糖苷结合挥发物（GBV），使葡萄酒具有更多的香气类型，如花香、果香等；高山4号和白玉葡萄的GBV浓度最高，揭示了葡萄中代谢产物与基因表达之间的密切关系。Cheng等（2023a）利用全基因组、广泛靶向代谢组和转录组联合解析腺枝葡萄酚类化合物代谢及调控特点，与同一地域种植的欧亚种相比，腺枝葡萄的阿魏酸和芪类物质的含量更高，这与腺枝葡萄中编码苯丙烷代谢途径上游酶的基因COMT和STSs高表达相关。Zhang等（2024）利用广泛靶向代谢组学技术和转录组测序分析2种化学保鲜剂对阳光玫瑰葡萄酚类化合物代谢的影响，结果发现，相比SO2处理，1-甲基环丙烯（1-MCP）处理明显降低了贮藏后期的芪类化合物、槲皮素、山柰酚和黄烷-3-醇的积累，且1-MCP能有效地抑制浆果脱落、乙烯/脱落酸（ABA）合成和信号转导途径相关基因表达。户金鸽等（2024）采用转录组和代谢组联合分析的方法研究不同地面覆盖方式下新郁葡萄果皮黄酮类化合物的代谢特征，园艺地布覆盖与黄酮合成相关富集途径主要集中在类黄酮生物合成，生草覆盖栽培则主要集中在次级代谢物和类黄酮生物合成，两者的总黄酮含量高于对照。【本研究切入点】野酿2号是两性花腺枝毛葡萄优良品种，具有耐旱、耐瘠、抗病力强等特点，同时能很好适应南方高温高湿的气候。目前关于野酿2号的研究主要集中于酿造工艺、香气分析及功能性成分挖掘等方面，未见利用广泛靶向代谢组学技术开展不同树龄及栽培条件野酿2号腺枝毛葡萄黄酮类代谢物差异分析的研究报道。【拟解决的关键问题】以不同树龄及栽培条件的野酿2号腺枝毛葡萄为试材，研究地域、架式及树龄对葡萄果实类黄酮代谢物的影响，以期了解野酿2号腺枝毛葡萄适宜的树龄及栽培条件，为生产上选择适合的栽培方式提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试品种为野酿2号［V.heyneana Roem.et Schult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）Yeniang No.2］，种植于广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所试验基地，包括相思湖葡萄示范基地（22°50′59″N，108°14′35″E）和明阳双季葡萄示范基地（22°36'39″N，108°13′51″E）。相思湖葡萄示范基地采用棚架栽培（图1-A），树龄8年，材料编号XS-PJ-8Y。明阳双季葡萄示范基地采用篱架栽培（图1-B），树龄5年，材料编号MY-LJ-5Y；棚架栽培，树龄5年，材料编号MY-PJ-5Y；棚架栽培，树龄8年，材料编号MY-PJ-8Y。树势中等，管理水平良好，田间土肥水管理与病虫害防治等同常规。

1.2采收期果实理化指标测定

在采收期选择树体生长状况相对一致的9株葡萄树作为采样株，每3株为1个生物学重复。每个生物学重复从9个葡萄植株中随机选取至少30穗上的300粒果。转运至实验室后，取150粒果（每个生物学重复的50粒）用于测定果粒重、pH、可溶性固形物含量、可滴定酸含量及色度值。可溶性固形物含量使用便携式手持折光仪（Atago PAL- 日本Atago公司）测定。pH采用pH计（INESA PHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司）测定。色度值采用手持色彩色差计（Konica Minolta CR-10，日本Konica Minolta公司）测定，用L*表示颜色的亮度值，a*表示红—绿色度值；b*表示黄—蓝色度值。可滴定酸含量采用氢氧化钠酸碱滴定法测定，以酒石酸计。剩余果实在液氮中快速冷冻，于-80°C保存，用于广泛靶向代谢组学分析。

1.3广泛靶向代谢组学分析

1.3.1样品提取采用真空冷冻干燥机（Scientz-100F，宁波新芝冻干设备股份有限公司）对冷冻葡萄样品进行冻干。干燥样品用研磨仪（MM400，德国莱驰公司）在30 Hz下研磨1.5 min。样品的提取过程参照Yang等（2020）的方法，称量每个样品的粉末100 mg，于1.2 mL 70%甲醇提取液中溶解，每30min涡旋1次，每次持续30 s，共涡旋6次，提取时间为4℃，24 h。转速12000 r/min离心10 min，分离上清液，用0.22μm孔径滤膜过滤样品，用于超高效液相色谱—串联质谱仪（UPLC-MS/MS）分析。

1.3.2色谱质谱采集条件样品提取物使用UPLC-MS/MS系统进行检测分析，其中UPLC为SHIMADZU Nexera X2；MS为Applied Biosystems 4500 QTRAP。1.3.2.1液相条件液相条件参考Yu等（2022）的报道。色谱柱：Agilent SB-C18（1.8µm，2.1 mm×100 mm）；流动相：A相为0.1%甲酸—水溶液，B相为0.1%甲酸—乙腈溶液；洗脱梯度：0～10 min，5%～95%B相；10～14 min，95%～5%B相；流速：0.35 mL/min；柱温：40℃，进样量4μL。

1.3.2.2质谱条件质谱条件参考Yang等（2020）的报道。电喷雾离子源（ESI）温度设为550℃，离子源气体I（GSI）、气体II（GSII）和帘气（CUR）分别设为50、60和25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在三重四级杆（QQQ）和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描采用MRM模式，并将碰撞气体（氮气）设为中等。通过进一步的去族电压（DP）和碰撞能（CE）进行扫描检测。

1.4统计分析

1.4.1主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）利用R中的统计函数prcomp进行PCA，初步了解12个葡萄样本之间的总体代谢差异。数据在无监督PCA前进行单位方差缩放。HCA结果以带树状图的热图形式显示。PCA和HCA均使用R软件Complex-Heatmap包绘制热图。

1.4.2差异代谢物分析对两两比较得到的差异显著代谢产物进行筛选，筛选条件为差异贡献度（VIP）≥ |log2 Fold Change|≥1。利用R包Metabo-AnalystR从正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）结果中提取VIP值，OPLS-DA结果还包含评分图和排列图。在OPLS-DA前对数据进行对数转换（log2）和均值处理。为了避免过拟合，对200个排列进行检验。

1.4.3差异代谢物KEGG代谢通路富集分析使用KEGG Compound数据库（http：//www.kegg.jp/kegg/compound/）对鉴定的代谢物进行注释，将所有注释的代谢物映射到KEGG Pathway数据库（http：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）。具有显著调节代谢物的途径被输入到MSEA中进行代谢物集富集分析，并使用超地理检验的P值确定显著性。

2结果与分析

2.1采收期果实理化指标分析

由表1可知，不同树龄及栽培条件的野酿2号腺枝毛葡萄理化指标之间存在不同程度的差异，与MY-PJ-5Y相比，MY-LJ-5Y中可溶性固形物和可滴定酸含量存在显著差异（P<0.05，下同），MY-LJ-5Y的可溶性固形物含量较高，为12.53%，可滴定酸含量较低，为9.83 g/L；与MY-PJ-5Y相比，MY-PJ-8Y除可滴定酸含量存在显著性差异外，其他理化指标之间无显著性差异（P>0.05，下同）。XS-PJ-8Y的粒重最低，为0.98 g，可滴定酸含量最低，为9.64 g/L，可溶性固形物含量最高，为16.17%；L*较高，a*、b*值均与MY-PJ-8Y无显著差异，表明XS-PJ-8Y果实果粒较小，颜色较浅，果实成熟度较好。综上所述，栽培地域对葡萄果实理化指标影响较大，栽种于相思湖葡萄示范基地的果实成熟度更好，但果粒较小、果皮颜色较浅。栽培架式及树龄对葡萄果实的粒重影响较小，对糖酸含量影响较大。同一地域采用篱架栽培的葡萄果实较棚架栽培成熟度更好，且树龄越大植株果实成熟度更好。

2.2代谢产物分析结果

野酿2号腺枝毛葡萄果实代谢产物分析结果如图2所示。共鉴定出11类789种代谢物，包括黄酮类187种、酚酸119种、脂类81种、氨基酸及其衍生物76种、有机酸49种、生物碱48种、核苷酸及其衍生物48种、萜类38种、鞣质20种、木脂素和香豆素17种，以及其他类106种，其中黄酮类化合物最多（图2-A）。为了分析不同树龄及栽培条件对野酿2号腺枝毛葡萄果实差异代谢产物的影响，分别对不同架式（MY-PJ-5Y vs MY-LJ-5Y）、不同树龄（MY-PJ-5Y vs MY-PJ-8Y）、不同地域（XS-PJ-8Y vs MY-PJ-8Y）样品进行代谢物差异分析（图2-B）。不同地域间的差异代谢物数量明显多于不同栽培架式间或不同树龄间的差异代谢物数量，而不同栽培架式与不同树龄的差异代谢物数量相近。棚架栽培与篱架栽培（MY-PJ-5Y vs MY-LJ-5Y）相比，上调的差异代谢物数量与下调的差异代谢物数量较相近；5年树龄与8年树龄（MY-PJ-5Y vs MY-PJ-8Y）相比，上调数量明显多于下调代谢物数量；相思湖葡萄示范基地与明阳双季葡萄示范基地（XS-PJ-8Y vs MY-PJ-8Y）相比，下调数量明显多于上调代谢物数量。

2.3差异代谢物比较分析结果

野酿2号腺枝毛葡萄果实差异代谢物比较分析结果（图3-A）显示，不同样本中所有代谢物的比较结果表明各处理间的代谢物存在一定差异。PCA结果（图3-B）显示，主成分1（PC1）可将XS-PJ-8Y与其他样本区分开来，说明不同栽培地域葡萄果实代谢物的差异大于不同树龄和架式（图3-B）。HCA结果（图3-C）显示，差异代谢物在第1层级分为2组，第1组为XS-PJ-8Y，第2组为MY-PJ-5Y、MY-LJ-5Y和MY-PJ-8Y；在第2层级，同一地域的处理间又明显区分为2组，MY-PJ-5Y为一组，MY-LJ-5Y与MY-PJ-8Y为另一组，与PCA结果较一致。

2.4差异代谢物K-means聚类分析结果

为了更清楚地分析不同树龄及栽培条件的葡萄果实代谢产物积累特征，对12个样品的271个差异代谢物进行K-means聚类分析，结果如图4所示。271个差异代谢物共聚为七大类群，Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ类群的133个代谢物含量在MY-PJ-5Y样本中较高（图4-A、图4-D和图4-G）。Ⅱ类群的32个代谢物含量在MY-PJ-8Y样本中较高（图4-B）。Ⅲ类群的34个代谢物含量在MY-LJ-5Y样本中较高（图4-C）。Ⅴ和Ⅵ类群的72个代谢物含量在XS-PJ-8Y样本中较高（图4-E和图4-F）。K-means聚类分析中每个子类的代谢物占比如图5所示。黄酮类化合物在各类群中占比最高，特别是在Ⅱ类群，占比高达59%，其次是Ⅰ类群，为49%。

2.5差异代谢物韦恩图分析结果

为了鉴定不同样本之间共有的和特有的差异代谢物，对不同样本的差异代谢物进行韦恩图分析，结果如图6-A所示。MY-PJ-5Y vs MY-LJ-5Y、MY-PJ-5Y vs MY-PJ-8Y和XS-PJ-8Y vs MY-PJ-8Y对比组分别检测到36、31和142种特异性差异代谢物。不同地域样本间存在的差异代谢物最多，与上述2.3中分析结果一致。3个对比组共有的差异性代谢物为11种，共5类，每一类型化合物占比如图6-B所示。黄酮类化合物的占比最高，为54.55%，其次是其他类，为18.18%，酚酸类、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物占比相同，均为9.09%。由此可知，黄酮类化合物是不同树龄及栽培条件野酿2号腺枝毛葡萄果实中最主要的差异代谢物。

2.6核心差异代谢物分析结果

为了找出不同树龄及栽培条件比较组间的核心差异代谢物，对|log2 Fold Change|的前10种差异代谢物进行排名，结果如图7所示。不同栽培架式（MY-PJ-5Y vs MY-LJ-5Y）与不同树龄（MY-PJ-5Y vs MY-PJ-8Y）具有相似的比较结果，上调和下调最明显的差异代谢物分别是顺丁烯二酰基－咖啡酰奎宁酸、L-γ-谷氨酰胺-L-亮氨酸，分别属于酚酸类、氨基酸及其衍生物。不同地域（XS-PJ-8Y vs MY-PJ-8Y）比较组中上调最明显的差异代谢物是顺丁烯二酰基－咖啡酰奎宁酸，其次是甘露三糖；下调最明显的差异代谢物是罗汉松脂酚-4'-O-葡萄糖苷（罗汉松树脂酚苷），属于木脂素和香豆素。MY-PJ-5Y vs MY-LJ-5Y上调和下调的差异代谢物还包括天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、乔松素-7-O-葡萄糖苷（乔松苷）和山柰酚-3-O-鼠李糖基（1→2）葡萄糖苷，均为黄酮类。MY-PJ-5Y vs MY-PJ-8Y中上调的前10种差异代谢物中有4种属于黄酮类，分别为飞燕草素-葡萄糖-阿拉伯糖、柠檬素-3，7-O-二葡萄糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、柠檬素-7-O-葡萄糖苷，下调的前10种差异代谢物中亦有4种属于黄酮类，分别是木犀草素-7-O-新橘皮糖苷（忍冬苷）、乔松素-7-O-葡萄糖苷（乔松苷）、山柰酚-3-O-鼠李糖基（1→2）葡萄糖苷和胡桃苷。XS-PJ-8Y vs MY-PJ-8Y中上调和下调的差异代谢物还包括牵牛花素-3-O-（6''-O-咖啡酰）葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷（芦丁）、异鼠李素-3-O-没食子酸酯和根皮素-4'-O-葡萄糖苷，均为黄酮类。

由上述可知，黄酮类化合物是造成处理组差异的主要原因，故对样本中65种差异代谢黄酮类化合物进行重点分析，结果如图8所示。65种差异代谢黄酮类化合物包括45种黄酮醇、9种黄烷-3-醇和11种花青素。MY-PJ-5Y中山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、西伯利亚落叶松黄酮-3-O-木糖苷、扁蓄苷（广寄生苷）、杨梅素-3-O-葡萄糖醛酸苷、异金丝桃苷、胡桃苷、桑色素等山柰酚、槲皮素的含量较高，同时儿茶素、表儿茶素等大多数黄烷-3-醇含量也较高，花翠素-3-O-（6''-O-阿魏酰）葡萄糖苷、花葵素-3，5-O-二葡萄糖苷、花青素-3，5-二-O-葡萄糖苷等花翠素单糖苷、花葵素双糖苷和花青素双糖苷的含量也有所增加。MY-LJ-5Y中花翠素-3-O-（6''-O-对香豆酰）葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-（6''-O-乙酰）葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷等花翠素的积累增加。MY-PJ-8Y中杨梅素-3-O-阿拉伯糖苷、槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-鼠李糖苷等杨梅素、槲皮素及异鼠李素的含量较高。同时表儿茶素、二甲花翠素-3-O-（6''-O-对香豆酰）葡萄糖苷、花翠素-葡萄糖-阿拉伯糖、甲基花翠素-3-O-（6''-O-咖啡酰）葡萄糖苷等花翠素、二甲花翠素、甲基花翠素的含量也较高。XS-PJ-8Y中没食子酰异鼠李素、异鼠李素-3-O-没食子酸酯、（+）-表儿茶素4'-O-β-D-葡萄糖苷、（+）-表儿茶素3'-O-B-D-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-（6''-O-对香豆酰）葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-（6''-O-乙酰）葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷等异鼠李素、表儿茶素、花翠素、二甲花翠素糖苷的含量较高。

2.7类黄酮化合物分类比较分析

类黄酮化合物是影响葡萄和葡萄酒品质的重要化合物，主要包括黄酮醇类、黄烷-3-醇和花色苷类（张付春，2022）。本研究选取了葡萄果实中10种具有代表性的类黄酮化合物，对不同树龄及栽培条件的野酿2号腺枝毛葡萄果实进行了分析。对于黄酮醇类，槲皮素（图9-A）、山柰酚（图9-B）和杨梅素（图9-C）3类黄酮醇含量在MY-PJ-5Y和MY-LJ-5Y之间无显著差异，MY-PJ-5Y与MY-PJ-8Y相比，山柰酚含量显著升高；XS-PJ-8Y与MY-PJ-8Y相比，杨梅素含量显著降低。对于黄烷-3-醇类，MY-PJ-5Y与MY-LJ-5Y相比，儿茶素（图9-E）和表儿茶素没食子酸酯（图9-G）含量显著升高，表儿茶素（图9-D）和表没食子儿茶素（图9-F）含量在二者间无显著差异。MY-PJ-5Y与MY-PJ-8Y相比，儿茶素含量显著升高。MY-PJ-8Y与XS-PJ-8Y相比，4种黄烷-3-醇类物质均无显著差异。对于花色苷类，仅MY-PJ-5Y与MY-PJ-8Y相比，花青素含量显著升高。综上所述，不同栽培架式腺枝毛葡萄果实主要是儿茶素和表儿茶素没食子酸酯含量存在显著差异，不同树龄主要是山柰酚、儿茶素和花青素含量存在显著差异，不同栽培地域主要是杨梅素含量存在显著差异。具体来说，相思湖葡萄示范基地种植的腺枝毛葡萄果实中杨梅素含量更低，5年树龄更有利于山柰酚、儿茶素和花青素的积累，而棚架栽培促进了儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的积累。

2.8类黄酮物质含量与理化指标的相关分析结果

为了明确不同树龄及栽培条件野酿2号腺枝毛葡萄果实类黄酮物质含量与理化指标的相关性，对10种类黄酮与7个理化指标进行相关分析，结果如图10所示。粒重与可溶性固形物含量呈显著负相关（P<0.05，下同），与a*呈极显著负相关（P<0.01），与杨梅素含量呈显著正相关。可溶性固形物含量与L*呈显著正相关，与槲皮素和杨梅素含量呈显著负相关。可滴定酸含量与pH呈极显著负相关（P<0.01），与表没食子儿茶素含量呈显著正相关。L*、a*与杨梅素含量呈显著负相关。槲皮素和山柰酚含量均与花青素含量呈显著正相关。儿茶素含量与表没食子儿茶素和表儿茶素没食子酸酯含量呈极显著正相关（P<0.0 P<0.001）。表没食子儿茶素含量与表儿茶素没食子酸酯含量呈极显著正相关（P<0.01）。

3讨论

广泛靶向代谢组学可实现高通量、高灵敏、覆盖广、定性准的代谢物检测及解析。相比传统的液相色谱－质谱联用技术，广泛靶向代谢组学技术可比较不同样本间代谢物的种类与丰度差异，且筛选出在不同组间具有重要生物学意义的显著差异代谢物，并可定性定量检测低丰度痕量级化合物（pM级别）（Chen et al.，2013）。近年来，广泛靶向代谢组学已应用于葡萄研究领域，如Lu等（2021）通过广泛靶向代谢组学研究发现，在不同着色类型的葡萄果皮和果肉中类黄酮代谢存在较大差异，花青素与其他分支类黄酮化合物的相对含量呈正相关。Yu等（2022）利用广泛靶向代谢组学技术从桂葡6号和马瑟兰2个酿酒葡萄品种中共检测到774种差异代谢物，其中57种差异代谢产物被鉴定为感染白粉菌后积累的关键代谢产物，葡萄果实的防御机制主要与苯丙烷类黄酮的代谢有关。Cheng等（2023b）利用广泛靶向代谢组学技术从冬夏两季的巨峰葡萄中检测到1062种差异代谢物，其中黄酮类化合物285种。本研究利用广泛靶向代谢组学技术从不同树龄及栽培条件的野酿2号腺枝毛葡萄果实中共检测出11类789种差异代谢物，其中黄酮类化合物最多，为187种；所有样品中共有271种差异代谢物，K-means聚类分析显示黄酮类化合物在各类群中占比最高，韦恩图结果显示3个对比组共有的差异性代谢物有5类共11种，其中黄酮类化合物的占比最高，为54.55%。上调幅度最大的物质为酚酸类的顺丁烯二酰基-咖啡酰奎宁酸，3个对比组中Fold Change较大的代谢物多为黄酮类。由此可见，黄酮类化合物是利用广泛靶向代谢组学技术检测到的最主要的次生代谢物，也是不同树龄及栽培条件的野酿2号腺枝毛葡萄果实中最主要的差异代谢物。黄酮是葡萄中含量最为丰富的一类次生代谢物，这些化合物不仅能保护葡萄免受紫外线、病虫害等伤害，还对葡萄的风味品质及营养价值起决定性作用（Vianello et al.，2013；Gouotetal.，2019）。

黄酮种类和含量除受遗传因素影响外，栽培条件包含栽培架式、树龄、气候及生长调节剂等均会影响葡萄果实中黄酮类化合物的生物合成（Rienth et al.，2021）。金宇宁（2021）以不同树龄的北冰红葡萄为材料，研究发现秋季和冬季采收的11年生北冰红葡萄果实中可溶性固形物和总糖含量均显著高于其他树龄，树龄较小的2年生和6年生北冰红葡萄果实中总酸含量较高。白世践等（2024）研究发现，低‘厂’字形栽培比高‘厂’字形栽培更有利于果实发育及提高果实品质，果皮总黄烷醇含量和总花色苷含量分别提高23.83%和5.80%。Zhang等（2024）对我国5个产地的葡萄和葡萄酒中94种花青素类化合物和78种非花青素类酚类化合物进行定性和定量，结果发现不同产地的代谢物多样性主要体现在类黄酮生物的合成途径上。由此可见，不同地域、架式和树龄会对葡萄果实的品质及黄酮类物质的代谢产生不同影响。本研究发现，不同树龄及栽培条件野酿2号腺枝毛葡萄果实理化指标存在差异，栽种于相思湖葡萄示范基地的果实果粒较小、颜色较浅，成熟度更好；同一地域内篱架栽培的葡萄果实较棚架栽培成熟度更好，而8年树龄较5年树龄植株果实成熟度更好。不同架式、树龄和地域果实样本对比组分别检测到36、31和142种特异性差异代谢物。王张钰等（2024）研究表明，风土因子对不同酿酒品种葡萄的影响存在差异，例如马瑟兰比赤霞珠更易在湿度高、降水量大的风土条件下积累黄烷醇类物质。由此可见，不同地域的土壤条件、气候环境是造成成熟期果实中代谢产物差异化积累的主要原因，且这种差异大于不同架式或树龄的比较结果。

在葡萄和葡萄酒中，类黄酮化合物主要包括三大类：黄酮醇、黄烷醇和花色苷。黄酮醇类和酚酸类作为辅色物质，对葡萄和葡萄酒的颜色和陈酿潜力产生重要影响；黄烷醇类在塑造葡萄酒体的风味结构上具有重要作用；花色苷类特性及含量对葡萄及葡萄酒的颜色至关重要（卢浩成等，2021）。刘笑宏（2017）研究不同架式对摩尔多瓦葡萄果实花色苷代谢的影响，结果表明，棚架果实果皮中13种花色苷单体含量显著高于篱架。本研究通过对不同架式野酿2号腺枝毛葡萄果实类黄酮化合物进行热图剖面分析，结果显示棚架较篱架更有利于花青素双糖苷和花葵素双糖苷的积累。可见，不同架式对葡萄果实代谢物含量有明显影响。姜文广等（2015）研究不同树龄对蛇龙珠葡萄果实品质的影响，结果显示，3年树龄促进了果实酚类物质积累；6年树龄果实酸度更低。本研究发现，5年树龄较8年树龄更利于山柰酚、儿茶素和花青素的积累，而8年树龄中果实可滴定酸含量较低。Koyama（2012）研究表明，较好的光照条件能保证黄烷醇类和黄酮醇物质的合成。本研究也发现，棚架较篱架栽培更有利于儿茶素和表儿茶素没食子酸酯等黄烷-3-醇的积累，这可能是由于棚架栽培具备更好的光照条件，与刘晓伟等（2021）研究结论相似。

红葡萄果实主要有二甲花翠素、甲基花翠素、甲基花青素、花翠素和花青素类花色苷，花色苷的稳定性与其成分组成有较强的相关性（赵旭等，2019）。研究表明，葡萄和葡萄酒的着色程度与甲基化花色苷占比具有正相关性，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷在葡萄果皮成色中发挥重要作用（杨晓慧等，2017；李雨陶等，2024）。李雨陶等（2024）研究发现，富含丰富花翠素类花色苷，尤其是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的马瑟兰、赤霞珠和西拉葡萄果皮颜色较深，其作为原料的葡萄酒颜色也较深。本研究通过分析不同栽培地域野酿2号腺枝毛葡萄果实类黄酮化合物含量差异，发现MY-PJ-8Y的花翠素、二甲花翠素和甲基花翠素含量明显较高，XS-PJ-8Y的花翠素和二甲花翠素含量较高，二者相比可知，MY-PJ-8Y葡萄果实易着色，颜色较深，与MY-PJ-8Y葡萄果实的L*值较XS-PJ-8Y显著较低相互印证，表明明阳双季葡萄示范基地的野酿2号腺枝毛葡萄果实颜色较深。基础理化指标与各类黄酮物质含量等指标存在相关性，可溶性固形物含量与黄酮醇中的槲皮素和杨梅素含量呈显著负相关，推测其与葡萄果实成熟过程中初生和次生代谢产物积累的时段不同有关。黄酮醇和黄烷醇等酚类物质作为常见的辅色素，其含量和辅色效应呈正相关（Gordillo etal.，2012）。杨梅素作为葡萄果实中主要的黄酮醇，对保证葡萄酒颜色稳定性发挥着重要作用（赵旭等，2019）。本研究中L*、a*与杨梅素呈显著负相关，表明杨梅素含量低的果实色度浅，但红色色调强。XS-PJ-8Y葡萄中杨梅素含量最低，L*和a*值均较大。

野酿2号是广西重要的酿酒葡萄品种，通过栽培架式、树龄及地域的选择能改变葡萄果实黄酮类化合物的组成和含量，进而提升葡萄浆果品质，但对其酿造的葡萄酒品质的影响尚不明确，在今后的研究中，将开展不同栽培模式对野酿2号葡萄酒品质方面的研究，为提升广西原生葡萄酒品质，促进广西葡萄酒产业高质量发展提供理论参考。

4结论

黄酮类化合物对葡萄品质的形成具有重要的作用，通过合理选择架式、树龄及地域可获得高品质的野酿2号葡萄果实。不同树龄及栽培条件的野酿2号腺枝毛葡萄类黄酮化合物种类一致，但含量存在差异。相思湖葡萄示范基地篱架栽培和选择较大树龄有利于葡萄果实成熟度的提升，明阳双季葡萄示范基地栽培更利于杨梅素、槲皮素、表儿茶素及甲基花翠素的积累。棚架栽培较篱架栽培更有利于花青素双糖苷、花葵素双糖苷和黄烷-3-醇的积累。低树龄更有助于山柰酚、儿茶素和花青素的合成。

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（责任编辑陈燕）