丁酸钠与索拉非尼可能通过YAP 诱导铁死亡协同抑制肝癌细胞增殖

摘要：目的 探讨丁酸钠（NaB）联合索拉非尼（Sora）是否协同诱导铁死亡抑制肝癌细胞增殖及其机制。方法 CCK8、平板克隆实验和倒置光学显微镜观察探讨NaB或（和）Sora 对HepG2 肝癌细胞增殖活性的影响；GSH法和C11-BODIPY 581/591 检测NaB或（和）Sora是否诱导HepG2细胞发生铁死亡；公共数据库TCGA分析肝癌组织与正常组织中YAP基因表达差异；Westernblotting检测NaB或（和）Sora对HepG2细胞中YAP蛋白表达及其磷酸化水平的影响。结果 CCK8结果显示，2 mmol/L NaB联合Sora可显著降低HepG2肝癌细胞对Sora的IC50 （Plt;0.001），联合指数法证实Sora与NaB联合具有协同作用（CIlt;1），铁死亡抑制剂（Fer-1）和YAP激活剂（XMU）则可逆转NaB联合Sora对HepG2细胞的增殖抑制作用（Plt;0.001、Plt;0.001）；平板克隆实验结果显示，相较NaB或Sora单独处理，NaB联合Sora可显著抑制HepG2细胞克隆球形成（Plt;0.01，Plt;0.01）；形态学观察结果显示，NaB或Sora单独处理均可使HepG2细胞分散，形态皱缩且数量减少，而两者联合处理可加剧这一现象；GSH法和C11-BODIPY581/591检测结果显示，较NaB或Sora单独处理，NaB联合Sora可进一步降低细胞内GSH水平（Plt;0.001，Plt;0.05）和脂质ROS水平（Plt;0.05，Plt;0.01），Fer-1和XMU可逆转NaB联合Sora对HepG2细胞内GSH水平的下调作用（Plt;0.001，Plt;0.01）和脂质ROS水平的上调作用（Plt;0.01，Plt;0.05）；TCGA分析结果显示，肝癌组织与正常组织相比YAP mRNA高表达（Plt;0.001）；Westernblotting 结果显示，较NaB或Sora 单独处理，NaB联合Sora 进一步下调HepG2 细胞YAP蛋白表达水平（Plt;0.05，Plt;0.05），上调YAP蛋白磷酸化水平（Plt;0.05，Plt;0.01）。结论 NaB联合Sora可能通过抑制YAP诱导铁死亡，进而协同抑制肝癌细胞增殖。

关键词：丁酸钠；索拉非尼；肝癌；铁死亡；YAP；细胞增殖

全球有超过900万人被诊断为原发性肝癌，是6大最常诊断的癌症之一，也是癌症相关死亡的第4 大原因［1］，严重危害我国乃至世界人民的生命健康［2］。索拉非尼（Sora）是第1 个用于晚期肝癌一线治疗的靶向药物，但由于其耐药性、副作用大和总体疗效有限［3］，临床上迫切需要寻找有效的联合疗法以改善其治疗效果。丁酸钠（NaB）是膳食纤维在肠道菌群作用下分解产生的一种短链脂肪酸，具有广泛的生物活性，现已被用于研究治疗多种疾病如炎症性肠病、非酒精性脂肪肝［4］。NaB作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可以促进抗癌基因表达，从而抑制肿瘤细胞增殖［5， 6］，还能通过调控铁死亡相关基因来发挥抗癌效果［7］。

铁死亡是一种铁依赖性的新型细胞死亡方式，不同于细胞凋亡、自噬和坏死，其特征为还原型谷胱甘肽（GSH）的减少和脂质ROS的大量积累［8］。Sora 的抗癌活性依赖于通过抑制谷氨酸/胱氨酸逆转运蛋白（SLC7A11）的活性来诱导铁死亡［9］。课题组前期研究表明，NaB也可通过诱导铁死亡的方式抑制结直肠癌和肝癌细胞的增殖［7， 10］。由于Sora 和NaB都能靶向肝癌细胞铁死亡，我们推测两者可能通过协同诱导铁死亡来抑制肝癌细胞增殖。然而，目前关于Sora 与NaB联合用药的报道极少，Yu等［11］发现NaB可减轻LM3肝癌细胞有氧糖酵解，进而增强Sora 的敏感性。但有关Sora联合NaB是否协同抑制HepG2肝癌细胞增殖以及是否协同诱导铁死亡尚未有研究。此外，有研究报道，促进Yes 相关蛋白（YAP）介导的铁死亡可提高肝癌对Sora敏感性，这进一步揭示了本研究的意义［12］。

YAP是Hippo信号通路的最终效应分子，参与肿瘤发生和组织再生等多种生理病理过程［13］。近年来的研究表明，YAP蛋白的高表达是各种癌症化疗产生耐药性的重要因素［14，15］。同时，YAP及其磷酸化水平通过调节参与维持细胞内ROS和脂质过氧化平衡的基因表达来调节铁死亡［16］。目前，有关YAP在Sora 联合NaB抑制肝癌细胞中的作用尚未见报道。本研究旨在研究Sora联合NaB是否通过协同诱导铁死亡抑制HepG2肝癌细胞增殖，并初步探讨YAP对两者联合诱导铁死亡的影响及机制，为肝癌的治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 细胞与试剂

人肝癌细胞系HepG2 细胞（中科院上海生物细胞库）；NaB、二甲基亚砜（DMSO）、结晶紫（Sigma）；Sora、GSH检测试剂盒（北京索莱宝）；DMEM培养基、胰酶（Gibco）、胎牛血清（大连美仑）；CCK8（Targetmol）；铁死亡抑制剂（Fer-1）（Glpbio）；YAP 激活剂（XMU，上海陶术）；GAPDH、羊抗兔、羊抗鼠（北京锐抗）；C11-BODIPY 581/591（CAYMAN CHEMICAL）。

1.2 细胞培养

使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞进行后续细胞实验。

1.3 CCK8法

将对数生长期的细胞以5000/孔的密度接种至96孔板，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中过夜培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的（0.5、1、2、4、8、16 μmol/L）Sora或（和）2 mmol/L NaB处理24 h。随后弃去培养基，加入10 μL CCK8 溶液和100 μL完全培养基，孵育1h后在450 nm波长处测定吸光度，计算细胞活力。细胞活力（%）=［A450（样品）-A450（空白）］/［A450（对照）-A450（空白）］×100%。

1.4 平板克隆实验

对数生长期的HepG2 细胞在NaB或（和）Sora 或（和）Fer-1处理24 h后，胰酶消化并重悬。以2000/孔的密度接种于新的6 孔板，隔2～4 d 换液，待绝大多数单个克隆的细胞数超过50个时终止培养，弃培养基，并用PBS溶液清洗2 次。每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30 min，再用PBS清洗2次。最后，用0.1%结晶紫染色15 min，流水清洗，自然晾干后拍照，并通过ImageJ软件进行克隆球计数。

1.5 GSH检测

对数生长期的HepG2 细胞在NaB或（和）Sora 或（和）Fer-1处理24 h后，胰酶消化后用PBS清洗2次，收集细胞并按GSH试剂盒说明，用3倍体积的试剂一重悬混匀，冻融3 次后以8000 g/min 离心10 min，收集上清液用于后续测定。在412 nm波长处用酶标仪测定空白样及不同浓度标准样品的吸光度，绘制标准曲线并测定各组样品的GSH浓度。

1.6 脂质ROS检测

对数生长期的HepG2 细胞在NaB或（和）Sora 或（和）Fer-1处理24 h后，弃培养基，用HBSS清洗2次，加入无血清DMEM培养基和C11-BODIPY 581/591工作液（按说明书配制），置避光孵育30 min后弃上清，再次用HBSS清洗2 次后加入HBSS，用荧光显微镜观察红色（还原型）和绿色（氧化型）荧光强度。还原型：Ex=561 nm，Em=600～630 nm；氧化型：Ex=488 nm，Em=510～550 nm。使用Image J软件进行荧光定量，相对平均荧光强度=该区域绿色荧光强度总和/该区域红色荧光强度总和。

1.7 Western blotting实验

处理后的各组HepG2 细胞用预冷PBS 清洗2 次，加入适量RIPA裂解液，冰上静置15 min后离心收集蛋白并定量，加入5×buffer 煮沸10 min。配制10% 的SDS-PAGE凝胶。样品上样、电泳、转膜，5%牛奶封闭2 h后孵育一抗，4 ℃过夜。TBST洗涤3次后加入二抗，室温孵育2 h，再次用TBST洗涤3次后用ECL化学发光法显影。通过ImageJ软件分析条带灰度值。

1.8 统计学方法

数据分析使用SPSS 26.0 和Graph Pad Prism 8.0。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，Plt;0.05为差异有统计学意义。在中位剂量效应分析中使用Compusyn软件计算联合指数（CI）。

2 结 果

2.1 NaB增强Sora对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用

CCK8 结果显示，1 μmol/L Sora 与2 mmol/L NaB联合处理24 h 可显著抑制HepG2 细胞增殖（Plt;0.001，图1A）。相比单独使用Sora，联合处理将Sora的IC50从12.88±0.90 μmol/L 显著降低至2.83±0.10 μmol/L（Plt;0.001，图1A）。中位剂量效应分析表明，联合处理的CI值均小于1（图1A），NaB与Sora联合具有协同作用。在后续实验中，选用2 mmol/L NaB和4 μmol/L Sora，联合处理的抑制率达（52.84±3.59）%（图1A），CI值低至0.58（图1A）。平板克隆实验结果显示，与对照组相比，NaB或Sora单独处理均可抑制HepG2细胞的克隆形成能力（Plt;0.01，Plt;0.05，图1B），联合处理进一步显著抑制HepG2 细胞的克隆形成能力（Plt;0.01，Plt;0.01，图1B）。倒置光学显微镜观察显示，与对照组相比，单独处理的细胞呈分散，皱缩形态且数量减少，而联合处理加剧了这些现象（图1 C）。

2.2 NaB联合Sora对HepG2肝癌细胞铁死亡的影响

CCK8 结果显示，铁死亡抑制剂Fer-1 可逆转NaB联合Sora 对HepG2 细胞的增殖抑制作用（Plt;0.001，图2A）。GSH水平检测结果显示，与对照组相比，NaB或Sora单独处理可降低HepG2细胞的GSH水平（Plt;0.05，Plt;0.001，图2B），联合处理则进一步降低GSH 水平（Plt;0.001，Plt;0.05，图2B），且此降低效应可被Fer-1恢复（Plt;0.001，图2B）。脂质ROS荧光结果显示，与对照组相比，NaB或Sora 单独处理可增加HepG2 细胞的脂质ROS水平（Plt;0.01，Plt;0.05，图2C），而较单独NaB或Sora 组，联合处理组进一步显著增加细胞内脂质ROS 水平（Plt;0.05，Plt;0.01，图2C），且此效应也可被Fer-1恢复（Plt;0.01，图2C）。

2.3 YAP在肝癌组织中高表达

TCGA公共数据库分析结果显示，与正常肝脏组织相比，肝癌组织中YAP mRNA 水平表达更高（Plt;0.001，图3）。

2.4 NaB 联合Sora 对HepG2 肝癌细胞内的YAP 和p-YAP表达的影响

Western blotting结果显示，与对照组相比，NaB可下调HepG2细胞中的YAP蛋白表达水平（Plt;0.01，图4A、B），并上调p-YAP蛋白表达水平（Plt;0.05，图4A、B）。同样，Sora下调YAP蛋白表达水平（Plt;0.05，图4A、B），并上调p-YAP蛋白表达水平（Plt;0.05，图4A、B）。相比单独NaB或Sora处理，联合处理显著降低YAP蛋白表达水平（Plt;0.05，Plt;0.05，图4A、B），同时显著增加p-YAP蛋白水平（Plt;0.05，Plt;0.01，图4A、B）。

2.5 激活YAP逆转NaB联合Sora对HepG2肝癌细胞增殖和铁死亡的影响

CCK8 结果显示，预处理3 μmol/L XMU后，NaB联合Sora 对HepG2 细胞的增殖抑制作用被部分逆转（Plt;0.001，图5A）。GSH检测结果显示，XMU可恢复联合处理引起的GSH水平下降（Plt;0.01，图5B）。脂质ROS荧光结果显示，与联合处理组相比，XMU预处理后联合处理组HepG2细胞的平均荧光强度显著降低（Plt;0.05，图5C）。

3 讨 论

近年来，生物活性物质联合化疗药物在肝癌治疗中的应用受到广泛关注。例如，槲皮素、白藜芦醇和姜黄素与Sora的联用均表现出显著增强的抗肝癌作用，能够有效抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡［17-19］。在本研究中，NaB与Sora 的联合应用展示了类似的协同效应，能更有效地抑制HepG2 肝癌细胞的增殖。不同的是，我们还研究了两者联合对铁死亡的影响。铁死亡作为治疗耐药性肿瘤的潜在靶点，在NaB与Sora 协同效应中的作用尚未被研究。

铁死亡的经典通路中，SLC7A11 介导胱氨酸的摄取和谷氨酸的释放减少，从而导致GSH合成减少［20］。GSH作为重要的细胞内抗氧化剂，维持细胞的氧化还原稳态，其减少会破坏这种稳态并导致脂质ROS 积累［21］，最终诱导细胞的铁死亡。我们的研究结果显示，相较于单药处理，Sora 联合NaB可显著降低了HepG2细胞的GSH水平，并增加脂质ROS含量。在加入Fer-1后，这些效应得以逆转，同时联合处理导致的增殖抑制作用也被逆转。这些结果表明，Sora 联合NaB可通过协同诱导铁死亡的方式抑制HepG2细胞增殖。

在抵抗铁死亡过程中，YAP 蛋白发挥了重要作用［22］。与对Sora敏感的细胞相比，Sora耐药细胞中YAP表达水平更高，且对Sora诱导的铁死亡耐受性更强［12］。阻断YAP表达不仅可以有效诱导细胞的氧化损伤［23］，还可以使肝癌细胞重新获得对铁死亡的敏感性［24］。在本研究中，Sora 联合NaB可显著降低YAP蛋白的表达水平，并促进YAP磷酸化。正常情况下，磷酸化的YAP会在细胞质中被降解，而未被磷酸化的YAP会进入细胞核中发挥其转录调控活性，促进其下游的铁死亡负性调控分子如SLC7A11的基因表达，进而降低肝癌细胞铁死亡敏感性［12， 24］。我们推测Sora联合NaB可能通过共同降低YAP表达、促进其磷酸化来诱导肝癌细胞的铁死亡。然而，也有研究认为YAP具有相反的作用［25， 26］。

为进一步探索YAP在Sora联合NaB诱导肝癌细胞铁死亡中的机制，我们引入了YAP激活剂XMU。XMU选择性抑制YAP上游信号分子蛋白激酶Mst1/2，提高YAP的表达，抑制YAP磷酸化，从而增强其在细胞核内的转录调控作用［27， 28］。后续实验结果显示，XMU的加入有效逆转了Sora联合NaB对HepG2细胞铁死亡的影响。这些研究及实验结果提示，NaB和Sora 可能通过抑制YAP表达、促进其磷酸化来协同诱导肝癌细胞的铁死亡，进而抑制肝癌细胞增殖。

综上所述，NaB联合Sora可能通过调节YAP介导的铁死亡途径，从而协同抑制肝癌细胞的增殖，为开发更为有效的肝癌靶向治疗提供新的思路和依据。

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（编辑：余诗诗）

基金项目：国家自然科学基金（81773429）；广东省自然科学基金（2022A1515011631，2024A1515012175）