生物炭输入对脐橙园酸性土壤固氮细菌群落结构的影响

摘 要：广西柑橘园酸性土壤分布广泛、氮转化具有特殊性，生物炭常用于该区土壤改良，然而生物炭输入对该土壤固氮微生物群落的影响尚不清楚。该研究以广西脐橙园酸性土壤固氮细菌群落为研究对象，通过高通量测序及生信分析发现该土壤中的固氮菌群落覆盖8门15纲28目39科50属的微生物。变形菌门在生物炭处理后相对丰度增加，OTU数目、Ace指数、Chao指数在生物炭输入量5%的组最高，但各组间差异不显著。PcoA分析显示生物炭输入显著改变土壤固氮细菌群落结构，且变化程度与生物炭输入量有关。土壤pH、NH4+-N含量、矿化率是影响脐橙园酸性土壤固氮细菌群落结构的主要环境因子，固氮细菌不同种群对环境因子的响应并不一致。

关键词：脐橙；生物炭；nifH；固氮菌群落；多样性

中图分类号：S666 文献标志码：A 文章编号：2096-9902（2024）19-0018-04

Abstract： Biochar is commonly used for soil amendment in citrus orchards across Guangxi， where acidic soils are prevalent and nitrogen transformation is characterized by its specificity. However， the impact of biochar application on the microbial communities involved in nitrogen fixation remains unclear. This study focused on the microbial communities of nitrogen-fixing bacteria in the acidic soils of navel orange orchards in Guangxi. Through high-throughput sequencing and bioinformatics analysis， it was found that the nitrogen-fixing microbial community in these soils encompasses 50 genera within 39 families， 28 orders， 15 classes， and 8 phyla. The relative abundance of Proteobacteria increased following biochar treatment， and the highest OTU numbers， Ace index， and Chao index were observed in the group with a 5% biochar input， although differences in diversity indices among groups were not significant. PcoA and NMDS analyses demonstrated that biochar application significantly altered the structure of the soil nitrogen-fixing bacterial community， with the degree of change being related to the amount of biochar added. Soil pH， NH4+-N content， and mineralization rate were identified as the main environmental factors influencing the structure of the nitrogen-fixing bacterial community in the acidic soils of navel orange orchards， with different populations of nitrogen-fixing bacteria responding differently to environmental factors.

Keywords： navel orange; biochar; nifH; nitrogen-fixing microbial community; diversity

脐橙在我国种植面积大，存在氮肥用量大和土壤酸化问题。生物炭可以通过改变参与氮转化过程的土壤微生物的数量和结构来改变土壤氮循环[1]。在酸性土壤中，生物炭能提升土壤肥力、脐橙产量和品质[2]。固氮菌是可以将空气中的氮气（N2）转化为活性氮的土壤微生物，其固氮作用是土壤氮循环的重要组成部分，有助于土壤中植物有效氮的积累，最大程度地减少农业无机氮肥的使用[3]。然而，生物炭输入对脐橙园土壤微生物固氮过程的影响目前仍不清楚。本研究以广西脐橙园酸性土壤为研究对象，系统研究不同量生物炭输入条件下土壤固氮菌群落结构和多样性的差异特征及与环境因子的关系。为脐橙园酸化土壤改良及驱动机制提供参考，为深入了解和调控脐橙园酸性土壤固氮菌群落提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 土壤与生物炭准备

试验用土壤采集于广西壮族自治区贺州市富川县。在脐橙树滴水线4个方向分别采集0～20 cm 土壤并混匀。去除树根和石头后过2 mm土壤筛，用于土壤培育。生物炭购自河南弘之源净水材料有限公司。该生物炭为黑色粉末状，pH约8.35，有机碳771.90 g·kg-1，全氮1.50 g·kg-1。

1.2 土壤培育试验

土壤培育设5个处理，生物炭添加量分别为0（CK），1%（B1），2%（B2），5%（B3），10%（B4）。各处理3次重复。称取相当于25 g干土的土壤/土壤-生物炭混合物置于培养瓶中，用去离子水调整培养土含水量为80%WHC。每瓶用带6针孔封口膜封口静置，于27 ℃生化培养箱中黑暗培养28 d，每2 d称重法补充水分。

1.3 测定方法

1.3.1 土壤参数的测定

在0、7、14、28 d取土样置于-80 ℃保存，用于测定土壤理化参数及nifH基因多样性。其中，土壤和生物炭的pH、有机碳、全氮、铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）委托广西西大检测有限公司测定。通过 DNeasy Power Soil 土壤DNA提取试剂盒（QIAGEN，美国）、提取土壤DNA。气相色谱仪（Agilent7890B，美国）测定培养瓶中N2O的浓度计算N2O排放速率。

1.3.2 nifH基因高通量测序

土壤微生物总DNA提取后，使用nifH基因引物（nifH-F：5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′和nifH-R：5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′）进行PCR 扩增，NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建库，MiseqPE300平台测序。测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学注释，在各个分类水平上采用Shannon、Chao、Coverage和Ace指数对固氮菌群落结构多样性进行分析。

1.4 数据处理

高通量测序结果通过上海美吉生物医药科技有限公司生信云平台提供的软件完成。

2 结果

2.1 生物炭输入对固氮菌群落组成的影响

nifH基因高通量测序所得有效序列按最小样本序列抽平后共划分OTU 2 425条，注释结果显示该脐橙园酸性土壤含有nifH基因的固氮菌群落共有8门15纲28目39科50属（图1）。在门水平上，norank_d__Bacteria在生物炭输入组中高于对照组，unclassified_d__Unclassified和Firmicutes在生物炭输入量为1%、2%、5%的组中高于对照组。属水平TOP5的优势属包括细菌门未分类属（unclassified_k__norank_d__Bacteria）、α-变形菌纲未分类属（unclassified_c__Alphaproteobacteria）、根瘤菌目未分类属（unclassified_o__Rhizobiales）、变形菌门未分类属（unclassified_p__Proteobacteria）和γ-变形菌纲未分类属（unclassified_c__Gammaproteobacteria）。其中，unclassified_p__Proteobacteria和unclassified_c__Gammaproteobacteria随着生物炭输入量增加呈双峰增长趋势，生物炭输入量为5%时相对丰度最低，各组间差异显著。

2.2 生物炭输入对固氮菌群落α多样性的影响

生物炭输入土壤并培育28 d后，对照组（afterCK）土壤固氮细菌OTU数量最低，生物炭输入量为2%（afterB2）时OTU数量最高。生物炭处理前后共有固氮细菌OUT数量为277条，生物炭输入不同处理组特有的固氮细菌OTU数量由多到少排序为B2（207）、B4（167）、B1（157）、B3（153）、CK（101）。生物炭输入后引起了不同种类土壤固氮细菌相对丰度的变化。生物炭输入不同处理组间土壤固氮细菌α多样性指数反应了各组间OTU的丰富度和均匀度（图2）。培育后输入量为2%的afterB2组固氮细菌OTU丰富度和均匀度都较高，α多样性最大，但组间差异不显著。

2.3 生物炭输入对固氮细菌群落β多样性的影响

主坐标分析（PCoA）表明生物炭输入量超过5%后，固氮细菌群落结构变化较大，土壤培育前后固氮细菌群落发生了一定的变化，组间差异均极显著，表明生物炭输入改变了脐橙园酸性土壤固氮细菌群落结构，且变化程度与生物炭输入量有关（图3（a））。

2.4 固氮细菌群落结构与环境因子的关系

固氮细菌群落结构与土壤环境因子的冗余分析（RDA）结果（图3（b））表明，RDA1和RDA2分别解释固氮菌群落变异的49.58%和11.18%，共解释总变异的60.76%。土壤pH、NH4+-N含量、矿化率与土壤固氮菌群落排列正相关，NO3--N含量、N2O排放速率、硝化率与土壤固氮菌群落结构负相关。其中，pH是影响脐橙园酸性土壤固氮细菌群落结构的最主要环境因子（pH=0.016）。固氮细菌不同种群对环境因子的响应并不一致，具有各自的生态位。

3 讨论

变形菌门的相对丰度在一定程度上反映土壤有机质等养分含量的多少，且在pH较高的土壤中生长较好[4]。本研究中变形菌门相对丰度以生物炭输入量为5%的处理最高，可能与土壤有机碳含量及pH较高有关。固氮细菌不同分类水平对环境因子的响应并不一致，同门不同属细菌具有各自的生态位。本研究发现2%生物炭处理时，土壤培育后固氮细菌的OTU数量和多样性指数最高。这可能表明存在一个最优的生物炭输入量，能够最大化促进固氮细菌的多样性。本结果表明冗余分析能够有效地解释脐橙园酸性土壤固氮细菌群落大部分的变异（60.76%），揭示了土壤环境因子对固氮菌群落结构的影响，并发现土壤pH是影响固氮细菌群落结构的最主要环境因子之一，是微生物活性和多样性的关键调控因素。生物炭输入提高了脐橙园酸性土壤pH，增加了属水平根瘤菌、α-变形菌、慢生根瘤菌相对丰度。

氮素形态也是影响固氮细菌群落结构的重要因素，研究发现NH4+-N与固氮细菌群落结构正相关，而NO3--N与之负相关，这种情况可能是因为高浓度的NO3--N对某些固氮细菌具有毒性，或者是因为硝化过程增加了土壤中的氧气浓度，从而抑制了厌氧或微氧环境中某些固氮细菌的活性。

总之，生物炭输入显著改变了脐橙园酸性土壤固氮细菌群落结构，且变化程度与生物炭输入量有关。土壤固氮细菌群落的结构和功能受到多种土壤环境因子的综合影响，不同种群对环境因子的响应各不相同[5]。这种多样性和复杂性是固氮细菌群落适应环境变化、维持生态系统功能的关键因素。了解这种复杂的相互作用对于预测和调控环境变化对固氮过程的影响、制定有效的土壤管理策略以促进固氮和提高农业生产力至关重要。

4 结论

该土壤中的固氮菌群落覆盖了8门15纲28目39科50属的微生物。变形菌门在生物炭处理后相对丰度增加，但各组间差异不显著。生物炭输入显著改变了土壤固氮细菌群落结构，土壤pH、NH4+-N含量、矿化率是影响脐橙园酸性土壤固氮细菌群落结构的主要环境因子。

参考文献：

[1] XIAO Z， RASMANN S， YUE L， et al. The effect of biochar amendment on N-cycling genes in soils： A meta-analysis[J].The Science of the total environment，2019（696）：133984.

[2] 蒋惠，郭雁君，张小凤，等.生物炭对砂糖桔叶果和土壤理化性状的影响[J].生态环境学报，2017，26（12）：2057-2063.

[3] 谢祖彬，张燕辉，王慧.稻田生物固氮研究进展及方向[J].土壤学报，2020，57（3）：540-546.

[4] ZHANG Y， CONG J， LU H， et al. An integrated study to analyze soil microbial community structure and metabolic potential in two forest types[J]. PloS one，2014，9（4）：e93773.

[5] SEPP S K， VASAR M， DAVISON J， et al. Global diversity and distribution of nitrogen-fixing bacteria in the soil[J]. Frontiers in plant science，2023（14）：1100235.