基于新型发夹核酸探针和G-四链体/血红素脱氧核酶的多功能生物传感器

摘要 以发夹核酸探针（HP）为识别元件，基于靶介导的DNA构象转换，构建了一种用于检测血红素和血红蛋白的荧光“turn-on”模式的生物传感器。以游离HP 为分子信标探针，供体与受体之间可发生高效荧光共振能量转移，导致荧光猝灭；当探针的富G序列在血红素诱导下形成稳定的G-四链体/血红素复合物时，供体与受体之间的距离拉大，荧光信号恢复。荧光法对血红素和血红蛋白的检出限分别为283 和109 pmol/L。进一步，基于G-四链体/血红素复合物的类过氧化物酶活性以及L-半胱氨酸对酶活性的抑制，实现了对L-半胱氨酸的可视化分析，检出限为3.6 μmol/L，低于细胞内半胱氨酸的正常水平（30～200 μmol/L）。这种多功能生物传感平台具有检测快速、简便和灵敏的优点，在生物分析、药物筛选和疾病诊断等领域具有潜在的应用价值。

关键词 G-四链体；脱氧核酶；血红素；血红蛋白；生物传感器

脱氧核酶（DNAzyme）是20 世纪90 年代发现的一类具有靶标识别能力和催化功能的单链DNA 分子。迄今为止，已发现十余种不同功能的DNAzyme。其中， 8-17 DNAzyme 是研究最多的脱氧核酶，与10-23 DNAzyme 都具有识别并切割RNA 的功能[1]；Cu2+依赖性DNAzyme 具有切割DNA 底物的功能[2]；E47 DNAzyme 可催化DNA 之间的连接反应[3]；G-四链体/血红素DNAzyme 具有类过氧化物酶活性，可催化底物显色或发光反应[4-5]；UV1C DNAzyme 具有类似光解酶的活性，可使胸腺嘧啶二聚体发生解聚[6]。在这些功能各异的DNAzymes 中， G-四链体/血红素DNAzyme 因具有良好的稳定性、较高的特异性和酶活性而备受关注。G-四链体是G-四链体/血红素DNAzyme 的关键组成部分，在K+或Na+诱导下，富含鸟嘌呤（Guanine， G）的DNA 序列可形成G-四链体结构，进而与血红素结合形成具有酶活性的G-四链体/血红素DNAzyme。其中， G-四链体是由多个G4 片层通过碱基之间的π-π堆积作用构成；G4片层可由富含串联重复G 序列的DNA 构成，根据DNA 链的长短不同，可形成分子内或分子间的G4 片层[7]。近年来， G-四链体/血红素DNAzyme 已在生物传感、生物成像和疾病诊疗等领域得到广泛研究和应用[8-11]。

血红素是一种天然的铁卟啉化合物，作为血红蛋白的辅基，对人体血液中氧气的运输具有重要作用。血红素也是肌红蛋白、细胞色素和过氧化物酶、过氧化氢酶等的辅基，参与细胞的电子传递和能量产生等多种生物化学反应。此外，血红素也是临床重要的补铁药物之一。因此，对血红素的准确定性和定量分析对疾病诊断与治疗、生物药物的研发等具有重要意义。目前，已报道了多种血红素的分析方法，包括分光光度法[12-13]、化学发光法[14]和电化学法[15]等。其中，荧光分光光度法灵敏度高、操作简便、检测时间短，已得到普遍认可和应用。目前，对血红素的荧光检测主要基于两种机制：利用血红素对发光纳米材料荧光的特异性猝灭机制，以及利用各种核酸探针与血红素之间的特异性结合机制。研究者分别报道了具有荧光发射特性的石墨相氮化碳纳米片[12]、碳纳米点[16]和金纳米团簇[17]，利用靶分子介导的荧光猝灭，实现了血红素的简便、快速检测，检出限分别为0.15、0.25 和0.43 nmol/L。这些方法特异性强、选择性高，但灵敏度尚显不足；另外，“turn-off”模式的荧光检测具有一定的局限性。与人工合成纳米材料相比， DNA 作为一种被广泛使用的纳米生物材料，具有可精确合成、稳定性好、容易标记等优点，而且DNAzyme具有较高的催化活性，可实现血红素的灵敏检测，因而在多个领域均显示出良好的实用性[13，18]。

血红蛋白（Hemoglobin， Hb）是生物体内红细胞的重要组成部分，主要负责氧气的携带和运输，血红素辅基是血红蛋白能够携氧的关键。血红蛋白浓度异常会导致某些疾病发生，例如贫血和白血病与血红蛋白浓度降低有关，而心血管病和糖尿病与糖化血红蛋白水平升高有关[19-22]，因此，对人体内血红蛋白浓度的监测具有重要意义。临床上使用最广泛的血红蛋白检测方法为比色法，需要将血红蛋白转变为稳定的血红蛋白衍生物再进行检测。近年报道的一些新方法，如电化学方法[23-24]、表面等离子体共振[25-26]和荧光法[27-30]等，具有较高的选择性、灵敏度和实用性。上述方法的不足之处在于不能直接对血红蛋白进行检测[30]，需要用蛋白酶水解释放出血红素辅基，增加了检测成本；而基于荧光猝灭机制的方法容易受到温度和pH 值等因素的影响[31-32]。因此，迫切需要开发响应快、准确度高、成本低、操作简便的血红蛋白检测新方法。

半胱氨酸（L-Cys）是一种重要的含巯基的氨基酸，参与多种含硫化合物的生物合成，与细胞内的新陈代谢过程密切相关。L-Cys 还参与蛋白质的折叠、半胱氨酸蛋白酶的催化以及生理信号的转导等过程。L-半胱氨酸水平异常会引起一系列生理疾病，如生长迟缓、毛发褪色、肝脏损伤、关节炎和阿尔茨海默病等[33-35]。因此，开发高效检测L-Cys 的新方法具有重要的临床意义。目前，用于检测L-半胱氨酸的方法主要有光谱法[36-37]、毛细管电泳法[38]、高效液相色谱法[39]和电化学发光法[40]等。然而，这些方法需要昂贵的设备，操作复杂，样品制备过程较繁琐，普适性不佳。近年来，研究者报道了多种具有类过氧化物酶活性的纳米材料，如碳纳米点[36]、金属@金属氧化物纳米笼[41]、金属氧化物填充聚吡咯纳米管[42]和氧化钴纳米管[38]等，为L-Cys的检测提供了新思路。

本研究利用富G 发夹核酸探针，构建了一种简便、快速和高灵敏的光学方法用于血红素和血红蛋白的检测。紫外-可见吸收光谱分析结果表明，此核酸探针与血红素之间发生了特异性相互作用。基于此，利用G-四链体/血红素DNAzyme 的类过氧化物酶活性，成功实现了L-Cys 的快速比色检测。