基于液相色谱-质谱联用技术的重组人生长激素低丰度产品相关物质结构表征

摘要 重组人生长激素（Recombinant human growth hormone， rhGH）是一种采用基因工程技术在大肠杆菌中表达的蛋白质药物，广泛用于治疗儿童及成人生长激素缺乏症等多种疾病。在rhGH 药物工艺开发与生产过程中，可能产生多种产品相关物质，对药物质量构成潜在影响。因此，对rhGH 主成分及产品相关物质进行深入的结构表征和合理的质量控制对保障药品质量具有重要意义。《欧洲药典》收录了用于rhGH 产品相关物质质量控制的反相高效液相色谱方法，以及高丰度色谱峰的结构鉴定信息，但对于低丰度产品相关物质的结构分析并没有详细记载。本研究采用反相高效色谱与液相色谱-质谱联用技术，成功分离并鉴定了rhGH 产品中的3 种低丰度产品相关物质。研究结果表明， rhGH 低丰度产品相关物质普遍含有多种修饰或罕见修饰，包括N99 和N149 双位点脱酰胺、N 端缺失两个氨基酸同时N149 脱酰胺、Q122 脱酰胺、N 端氨基甲酰化和N 端丁二酰化，其中首次在rhGH 中发现N 端丁二酰化修饰。本研究对rhGH 产品相关物质进行了深入表征，为rhGH 药物的研发和工艺改进提供了依据。

关键词 重组人生长激素；结构表征；产品相关物质；翻译后修饰；液相色谱-质谱联用

生长激素（Growth hormone， GH）是一种由人脑垂体前叶分泌的蛋白质激素，可与生长激素受体结合，诱导胰岛素样生长因子1（Insulin-like growth factor， IGF-1）分泌，从而促进人体骨骼的生长发育。1958 年， Raben 等[1]首次从人脑垂体中提取人生长激素（Human growth hormone， hGH），用于治疗生长激素缺乏症；1982 年，基因重组人生长激素（Recombinant human growth hormone， rhGH）获批用于生长激素缺乏症的临床治疗，主要适应症为内源性生长激素缺乏引起的儿童矮小症[2]。自此，研究者开始对rhGH进行了广泛的研究和应用探索。近年来， rhGH 在促进脂肪分解和肌肉再生[3]、神经保护[4]、烧烫伤[5]、辅助生殖[6]和肝组织再生[3]等领域的作用也被逐步发掘。截至2023 年， rhGH 在全球范围内的临床应用历史已超过40 年，获批的适应症达十余种。

随着生物技术的发展和进步， rhGH 的表达系统和生产工艺也经历多次迭代改进[7]，天然GH 分子无糖基化修饰，因此，绝大部分生产商选择原核表达系统对rhGH 进行规模化生产。在原核表达系统中，分泌型大肠杆菌表达技术借助特殊设计的信号肽将目标蛋白引导至周质腔，使其以可溶形式表达，有助于维持天然构象并避免被胞内蛋白酶降解。

人用药品技术要求国际协调理事会（The international council for harmonisation of technicalrequirements for pharmaceuticals for human Use， ICH） Q6b[8]指导原则中，将杂质分为产品相关物质（Product-related substances）、产品相关杂质（Product-related impurities）以及工艺相关杂质（Process-relatedimpurities），其中，产品相关物质与药物主成分的活性是可比的，但某些理化性质与主成分存在差异。产品相关物质的形成主要来自生产、运输和储存等过程。翻译后修饰作用[9-12]是产生产品相关物质的最常见原因，包括蛋白质氧化[13]、脱酰胺[14]、氨基甲酰化[15]、聚合[16]和降解[17]等；此外，一级序列的改变，如信号肽的不完全（或过度）切除[18]和氨基酸突变[19]等也会导致产品相关物质的形成。产品相关物质的存在会影响药物的分子量[20]和分子结构[21]等性质，从而影响药物的安全性[22]和有效性[16，23-24]，因此，对其进行准确的表征和严格质控十分必要。

《欧洲药典》[25]中收录了rhGH 的产品相关物质检测方法，但主要记录了部分高丰度产品相关物质的结构信息，对低丰度产品相关物质的研究尚显不足。尽管如此，在生物药的国际贸易中，《欧洲药典》所收录的方法仍是对rhGH 产品相关物质进行鉴定分析及实施质量控制的关键依据。

本研究采用色谱和质谱技术，对rhGH 原液中的产品相关物质进行分离、富集和结构鉴定[26-27]，旨在全面表征《欧洲药典》所列产品相关物质检测图谱中的低丰度组分。同时，制备了rhGH N 端丁二酰化修饰的样品，可作为产品相关物质监控的参考物质，在rhGH 的生产工艺改进、安全性与有效性评价及产品质量提升等方面具有重要的参考意义。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Triple TOF 6600 型超高效液相色谱-串联高分辨质谱仪（美国AB SCIEX 公司）；Micro 17R 高速冷冻离心机（美国Thermo 公司）；DS-11 分光光度计（美国Denovix 公司）；E2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）。NUCLEOSIL1000-7 C18 分析柱（250 mm × 4.6 mm， 7 μm， 美国Fisher 公司）；Acquity UPLCBEH C4 分析柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美国Waters 公司）；Acquity UPLC BEH C18 分析柱（100 mm ×2.1 mm， 1.7 μm， 美国Waters 公司）；超滤离心管（截留分子量10 kDa，美国Millipore 公司）。

NaH2PO4、Na2HPO4、（NH4）2SO4、HClO4 和丁二酸酐（国药集团化学试剂有限公司）；胰蛋白酶（Trypsin，美国Promega 公司）；三氟乙酸（质谱级，日本Wako 公司）；HCl（中国北京化工厂）；三羟甲基氨基甲烷（Tris，中国惠世试剂公司）；H3PO4 和异丙醇（色谱级，美国TEDIA 公司）；三（2-羧乙基）膦（TCEP，美国Sigma 公司）；乙腈（质谱级， Fluka 公司）。rhGH 注射液由长春金赛药业有限责任公司提供（标示含量为每瓶30 IU/10 mg/3 mL，批号：201706029）。

1.2 实验方法

1.2.1 产品相关物质的富集与定位

采用《欧洲药典》收录的反相高效液相色谱（Reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）方法进行分析[25]。采用E2695型高效液相色谱仪，配备NUCLEOSIL1000-7 C18 分析柱（250 mm ×4.6 mm， 7 μm）。流动相A 为NaH2PO4-HClO4 溶液（称取82.6 g Na2HPO4 和34.5 g NaH2PO4·2H2O，溶于2950 mL 色谱水中，加入25 mL HClO4 及2000 mL 乙腈，以超纯水定容至5000 mL）。流动相B 为80%乙腈溶液。梯度洗脱程序：0～60 min， 23%～28% B；60～61 min， 28%～23% B；61～72 min， 23% B。流速：1.0 mL/min， 柱温：室温；紫外检测器波长：215 nm。根据色谱峰的分离情况，对各个组分进行收集，合并相同馏分后进行超滤浓缩，终浓度控制为1.0 mg/mL。对浓缩后的馏分采用色谱分离所述的反相色谱方法进行定位分析，色谱设备、条件、色谱柱、流动相组成及梯度洗脱程序与前述相同。

1.2.2 产品相关物质解析

采用联用ExionLC 超高效液相色谱仪的Triple TOF 6600 高分辨质谱仪进行完整分子量分析。色谱柱选择Acquity UPLC BEH C4 柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）， 流动相A 为0.1%甲酸， B 相为0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脱程序：0～1 min， 5% B；1～3.5 min， 15%～60% B；3.5～4.5 min， 60%～90% B；4.5～6.0 min，90% B；6.0～6.5 min， 90%～15% B；6.5～9.0 min， 15% B。流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：220 nm；用超纯水将样品稀释至0.1 mg/mL， 进样4 μL；自动进样器温度设置为2～8 ℃。质谱主要参数如下：采用正离子模式分析，扫描范围m/z 400～2500；气帘气流速35 psi （1 psi = 6.89 kPa）；辅助气流速50 psi；离子源温度550 ℃；离子源电压5500 V；累加时间0.25 s；碰撞电压20 V；去簇电压120 V。取2 μL 待测样品进行液相色谱-质谱联用（Liquid chromatography-mass spectrometry， LC-MS）分析。

质量肽图检测设备与前述相同，色谱柱采用Acquity UPLC BEH C18 柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）。流动相A 为0.05%三氟乙酸，流动相B 为0.05%三氟乙酸-乙腈。梯度洗脱程序：0～3 min， 0～15% B；3～15 min， 15%～25% B；15～25 min， 25%～50% B；25～30 min， 50%～80% B；30～30.1 min， 80%～0% B；30.1～35 min， 0% B。流速：0.5 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：220 nm；进样量：20 μL。质谱分析采用正离子模式扫描，一级质谱（MS1）的扫描范围为m/z 100～1800。气帘气流速：35 psi；辅助气流速：50 psi；雾化气温度：550 ℃；累加时间：0.25 s；离子源电压：5500 V；碰撞电压：10 V；去簇电压：80 V。二级质谱（MS2）的扫描范围为m/z 50～1800，碰撞电压设定为“Rolling CE”，其它参数与一级质谱参数相同。

质谱数据采集采用Analyst 软件（1.7.3 版本，美国AB Sciex 公司），数据分析采用BioPharma View 软件（2.0 版本）和PeakView 软件（2.2 版本）（美国AB Sciex 公司）。

1.2.3 rhGH N端丁二酰化样品的制备

依据参考文献[28]的方法制备N 端具有丁二酰化修饰的rhGH 产品相关物质。取rhGH 加入丁二酸酐溶液（44∶1， m/m），置于冰水浴中孵育2 h，即得丁二酰化修饰产品相关物质。将上述丁二酰化杂质同样采用《欧洲药典》[25]中的RP-HPLC 方法进行分离，收集洗脱时间为42.8 min 的色谱峰，为rhGH 的N 端丁二酰化修饰的产品相关物质。收集到的蛋白采用与其它收集的产品相关物质相同的方法进行色谱峰时间定位，确认产品相关物质的洗脱时间一致。

2 结果与讨论

本研究开发了一套基于《欧洲药典》[25]方法的rhGH 低丰度产品相关物质的收集、鉴定与验证工作流程（图1）。首先，对rhGH 中的各产品相关物质色谱峰进行收集，按照保留时间顺序分别命名为EPV1至EP-V5、EP-M、EP-V6、EP-V7 和EP-V8。对收集的组分进行浓缩处理，并采用相同的方法进行色谱峰定位和纯度分析（图2），最终，通过LC-MS 对产品相关物质进行了结构鉴定分析。本研究首次在rhGH 产品相关物质中发现了N 端丁二酰化修饰组分，并采用化学方法制备了与此组分相同的N 端丁二酰化修饰rhGH 产品相关物质，通过色谱峰定位及质谱检测证实了此组分与制备的rhGH 产品相关物质组分一致。

2.1 产品相关物质的色谱定位和纯度分析

本研究采用的rhGH 的产品相关物质的总峰面积为8.36%（图3），符合《欧洲药典》[25]对总产品相关物质峰面积不得超过10%的规定；同时，各个产品相关物质的相对保留比均在规定范围内（表1）。为确保各组分在处理过程中的结构稳定性，采用《欧洲药典》[25]收录的rhGH 产品相关物质反相色谱检测方法进行了组分的富集与纯化，并采用相同的方法进行色谱定位。如图2 所示，收集的各产品相关物质馏分的主要成分与目标色谱峰的保留时间一致。通过计算峰面积得出各馏分中目标峰的纯度分别为：EP-V2 为92%， EP-V3 为85%， EP-V6 为100%，均满足后续组分鉴定的需求。

2.2 产品相关物质的结构解析

对8 个馏分样品进行了完整分子量和质量肽图的检测，并利用BioPharma View 软件（2.0 版本）与PeakView 软件（2.2 版本）对获得的数据进行分析，以确认已知组分并对未知组分进行结构表征。结果表明， EP-V1、EP-V4、EP-V5、EP-V7 和EP-V8 的结构与《欧洲药典》[25]收录的产品相关物质成分一致（见电子版文后支持信息表S1）。对于EP-V2、EP-V3 和EP-V6 色谱峰的结构，由于目前缺乏相关文献报道，本研究将对其进行深入探讨。

根据rhGH 的结构序列信息，其理论完整分子量应为22124.0 Da，经LC-MS 检测得到的EP-M 分子量为22123.8 Da（图4），与理论分子量高度一致。EP-V2 产品相关物质的分子量信号为22125.1 Da，比EP-M 略高1.3 Da，初步推测可能发生了脱酰胺修饰（+1.0 Da）。对于EP-V3产品相关物质，测得的分子量有两种，一种比EP-M 低242.5 Da，另一种比EP-M 高1 Da。推测前者可能是由于片段缺失，而后者可能是脱酰胺修饰（+1.0 Da）。EP-V6产品相关物质可能含有3 种成分，分别比主峰高1.6、44.7和101.1 Da，初步推测这可能与脱酰胺（+1.0 Da）、氨基甲酰化（+43.0 Da）和丁二酰化（+100.0 Da）3 种翻译后修饰有关[18]。

对上述样品进行了基于胰蛋白酶的质量肽图差异分析（图5）。通过对比差异色谱峰的一级和二级质谱数据（见电子版文后支持信息表S1），对各产品相关物质进行进一步表征。

对EP-V2 产品相关物质进行了质谱分析。通过对EP-M 和EP-V2 肽图样品的色谱峰进行对比发现，在保留时间6.42 和17.31 min 处有显著差异（图5），这些差异来源于T15 肽段（FDTNSHNDDALLK）和T10 肽段（SVFANSLVYGASDSNVYDLLK）的变异。进一步分析二级质谱图发现， EP-V2 的T15 肽段在N149 位发生了脱酰胺修饰，这可由b5～b11 离子的+1.0 Da 的质量偏移所证实（见电子版文后支持信息图S1A）。同理， T10 肽段在N99 位也出现脱酰胺修饰（见电子版文后支持信息图S1B）。分子量分析结果表明EP-V2 的N99 位和N149 位均发生了脱酰胺修饰。

比较EP-M 与EP-V3 的质量肽图（图5）可见，在4.67 和6.42 min 处具有显著差异，这些差异来源于T1 肽段（FPTIPLSR）和T15 肽段（FDTNSHNDDALLK）的变异。通过详细比对T15 肽段的二级质谱图（见电子版文后支持信息图S2）可确认EP-V3 中的N149 位发生了脱酰胺修饰。此外， EP-V3 的T1 肽段的质谱数据显示，其N 端缺失了苯丙氨酸（F）和脯氨酸（P）两个氨基酸残基，这与母离子质量减少244.1 Da 和二级质谱图中y1～y6 离子的一致性相符。因此，可以确定EP-V3 的主要组分是N149 位脱酰胺修饰，同时伴有N 端F 和P 两个氨基酸的缺失。

对EP-V6 的结构进行了质谱解析。EP-M 和EP-V6 的色谱峰（图5）在保留时间15.68、13.07 和13.88 min 处存在差异，这些差异与T11 肽段（DLEEGIQTLMGR）和T1 肽段（FPTIPLSR）的变异相关。分析差异色谱峰的MS2 谱图，推测T11 肽段的差异来源于Q122 位发生脱酰胺修饰（见电子版文后支持信息图S3A）；T1 肽段的MS2 分析结果表明， EP-V6 的N 端氨基酸发生了氨基甲酰化和丁二酰化修饰（见电子版文后支持信息图S3B 和S3C）。特别地， N 端发生的丁二酰化修饰为首次发现的rhGH 的产品相关物质，因此对该产品相关物质进行了进一步的研究和验证。

2.3 N端丁二酰化修饰rhGH的制备与确证

为了进一步确认EP-V6 成分N 端丁二酰化修饰rhGH 产品相关物质结果的准确性，同时为该产品相关物质的活性研究提供基础数据，通过制备N 端具有丁二酰化修饰的rhGH 产品相关物质进行对比验证。将rhGH 与丁二酸酐在低温下进行孵育，采用与rhGH 产品相关物质相同的色谱方法进行分离、收集及质谱分析，结果显示，制备的修饰蛋白的分子量为22223.9 Da（图6A），与理论值相符。此外，RP-HPLC 检测结果显示，制备得到的N 端丁二酰化修饰rhGH 的色谱峰保留时间与EP-V6 完全吻合（图6B）。综上，本研究最终实现了对欧洲药典中rhGH 相关蛋白的全部鉴定（表2），为未来产品质量的提升奠定了基础。

3 结论

采用《欧洲药典》中的RP-HPLC 结合LC-MS 方法，对rhGH 原液中的产品相关物质进行了表征分析。除已报道的产品相关物质EP-V1、EP-V4、EP-V5、EP-V7 和EP-V8 外，发现了未报道的低丰度产品相关物质EP-V2、EP-V3 及EP-V6，并证实EP-V2 中包含rhGH 发生N99、N149 位脱酰胺修饰的产物，EP-V3 中含有rhGH 发生了N 端缺失FP 和N149 脱酰胺2 种修饰产物，而EP-V6 中含有rhGH 发生Q122 脱酰胺、N 端氨基甲酰化和N 端丁二酰化3 种修饰产物。值得注意的是， N 端丁二酰化在rhGH 产品相关物质中首次被发现。本研究实现了对《欧洲药典》中RP-HPLC 方法分离的rhGH 药物产品相关物质的完全鉴定，加深了对rhGH 药物的认识，同时也为相关产品质量升级和安全性研究奠定了基础。

References

[1] RABEN M S. J. Clin. Endocrinol. Metab. ， 1958， 18（8）： 901-903.

[2] LEVITSKY L L， EDIDIN D V， BENVENISTE R. Pediatr. Res. ， 1982， 15（12）： 1545.

[3] I′HORTET A C D， ZERRAD-SAADI A， PRIP-BUUS C， FAUVEAU V， HELMY N， ZIOL M， VONS C， BILLOT K， BAUDV， GILGENKRANTZ H， GUIDOTTI J E. Endocrinology， 2014， 155（7）： 2545-2554.

[4] ARCE V M， DEVESA P， DEVESA J. Neurosci. Res. ， 2013， 76（4）： 179-186.

[5] CHEN Heng-Xia. Jinagsu Med. J. ， 2005， 31（7）： 529.

陈衡霞. 江苏医药， 2005， 31（7）： 529.

[6] CHANG C W， SUNG Y W， HSUEH Y W， CHEN Y Y， HO M， HSU H C， YANG T C， LIN W C， CHANG H M. Front.Endocrinol. ， 2022， 13： 1040503.

[7] WATERS M J， HOANG H N， FAIRLIE D P， PELEKANOS R A， BROWN R J. J. Mol. Endocrinol. ， 2006， 36（1）： 1-7.

[8] Q6B-1999. Specifications： Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use.

[9] LIU Jing-Hui， LIU Yu-Lin， LIU Chen， XU Xiao-Ming， YANG Hong-Yu， LI Li. Chin. J. Biol. ， 2015， 28（11）： 1153-1156.

刘景会， 刘玉林， 刘晨， 徐晓明， 杨红育， 李利. 中国生物制品学杂志. 2015， 28（11）： 1153-1156.

[10] WALSH G. Drug Discovery Today， 2010， 15（17-18）： 773-780.

[11] MAO Y， KLEINBERG A， LI N. Anal. Chem. ， 2020， 92（14）： 9682-9690.

[12] YANG Jing-Bo， HE Cheng-Yan， LU Ri-Feng， LIU Ning. Chin. J. Anal. Chem. ， 2022， 50（10）： 1465-1472.

杨静波， 何成彦， 卢日峰， 刘宁. 分析化学， 2022， 50（10）： 1465-1472.

[13] HEPNER F， CSASZAR E， ROITINGER E， POLLAK A， LUBEC G. Proteomics， 2006， 6（3）： 775-784.

[14] TESHIMA G， JOHN T. STULTSG， LING V， DAVIS E C. Am. J. Biochem. Mol. Biol. ， 1991， 266（21）： 13544-13547.

[15] NOWICKI C， SANTOMÉ J A. Int. J. Peptide Protein Res. ， 1981， 18（9）： 52-60.

[16] MEYER R M， ALESHKEVICH S， BERGER L， NERKAMP J， SCHELER S， FRIESS W. Int. J. Pharm. ， 2022， 621：121760.

[17] BATTERSBY J E， HANCOCK W S， CANOVA E， OESWEIN J， O′ONNOR B. Int. J. Peptide Protein Res. ， 1994， 44（3）：215-222.

[18] LIU H L， REN W C， ZONG L， ZHANG J L， WANG Y W. Anal. Biochem. ， 2019， 564： 1-12.

[19] HEPNER F， CSZASAR E， ROITINGER E， LUBEC G. Proteome Sci. ， 2005， 3（1）： 1.

[20] BECK A， CIANFÉRANI S， DORSSELAER A V. Anal. Chem. ， 2012， 84（11）： 4637-4646.

[21] YAN Y， WE H， FU Y， JUSUF S， ZENG M， LUDWIG R， KRYSTEK S R， CHEN G D， TAO L， DAS T K. Anal. Chem. ，2016， 88（4）： 2041-2050.

[22] EON-DUVAL A， BROLY H， GLEIXNER R. Biotechnol. Prog. ， 2012， 28（3）： 608-622.

[23] KONTERMANN R E. Curr. Opin. Biotechnol. ， 2011， 22（6）： 868-876.

[24] ROOPENIAN D C， AKILESH S. Nat. Rev. Immunol. ， 2007， 7（9）： 715-725.

[25] Commission Medicines European Council for the Quality of. Ph. Eur.10.0. Somatropin solution for injection. ED.： European Medicines Quality Authority， 2020： 3621-3622.

[26] GELLERFORS P， PAVLU B， AXELSSON K， NYHLéN C， JOHANSSON S. Acta Paediatr. Scand. ， 1990， S370： 93-100.

[27] LU Jun-Jie， LI Jing， CHEN Ying， LI Yi， ZHANG Wei， ZHANG Hui， LYU Ping， QIN Xi-Yue， GAO Xiang-Dong， LIANG Cheng-Gang. Chin. J. Pharm. Anal. ， 2022， 42（1）： 41-50.

陆俊杰， 李晶， 陈莹， 李懿， 张伟， 张慧， 吕萍， 秦希月， 高向东， 梁成罡. 药物分析杂志， 2022， 42（1）： 41-50.

[28] ZHAO Y， MA C Y， YUEN S N， HILLIPS D L. J. Agric. Food Chem. ， 2004， 54（7）： 1815-1823.