叉角厉蝽毒液丝氨酸蛋白酶基因EfSP2克隆、表达及捕食功能分析

摘要：【目的】通过对叉角厉蝽[Eocanthecona fiurcellata（Wolf）]毒液丝氨酸蛋白酶（Serine protease，SP）基因E/SP2的克隆、序列分析、表达谱分析及RNA干扰（RNA interference，RNAi），解析EfSP2蛋白的功能，为ESP2基因的分子特征研究及功能注释提供科学依据。【方法】从叉角厉蝽唾液腺转录组中获得E/SP2基因序列，利用PCR技术扩增E/SP2基因完整开放阅读框（Open reading frame，ORF）序列，对其进行生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR方法分析EJSP2基因在叉角厉蝽不同发育阶段（卵、1～5龄若虫和雌雄成虫）唾液腺及雌成虫不同组织（马氏管、唾液腺、脂肪体、卵巢、中肠、头）中的表达情况；通过RNAi技术检测其对叉角厉蝽雌雄成虫存活及捕食的影响。【结果】克隆获得EfSP2基因ORF序列长861 bp，编码286个氨基酸；EfSP2氨基酸序列中具有1个完整的Tryp-SPc结构域，含有胰蛋白酶N末端保守的起始氨基酸序列（IVGG）;含有保守的SP三联体催化活性中心，属于丝氨酸蛋白酶家族的类胰蛋白酶亚家族；与稻绿蝽（Nezara viridula）SP同源性最高，氨基酸序列一致性为44.69%。EJSP2基因在叉角厉蝽雌雄成虫和唾液腺中有极高的表达量。注射dsEISP2能显著抑制靶标基因的表达（Plt;0.05，下同），且显著降低叉角厉蝽雌雄成虫的存活率和捕食量。【结论】成功克隆了叉角厉蝽毒液丝氨酸蛋白酶E/SP2基因。时空表达谱及RNAi结果表明，EfSP2可能是叉角厉蝽生长发育、捕食和消化过程中的重要蛋白之一。

关键词：叉角厉蝽；唾液腺；丝氨酸蛋白酶；基因克隆；表达模式；RNA干扰

中图分类号：S476.2文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）02-0489-10

Cloning，expression and predation function analysis of serine protease EfSP2 gene from Eocanthecona furcellata （Wolff）venom

ZHANG Man¹，LIU Bing-shun²，CHEN Xiao'，YUE Mao-ting'，ZHU Guo-yuan'，

TIAN Yong-ming'，NING Jing-yi'，QIN De-qiang'，WU Guo-xing'，GAO Xi¹（'College of Plant Protection，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China;²Lufeng Agricultural Technology ExtensionCenter，Chuxiong，Yunnan 651200，China）

Abstract：[Objective]The purpose of the study was to analyze the function of EfSP2 protein by cloning，sequence analysis，expression profile analysis and RNA interference（RNAi）of serine protease（SP）gene ESP2 from the venom of Eocanthecona fiurcellata（Wolff），and to provide ascientific basis for the molecular characterization and functional an-notation of the E/SP2 gene.【Method】The E/SP2 gene sequence was obtained from the salivary gland transcriptome of Efiuncellata.The complete open reading frame（ORF）sequence of the E/SP2 gene was amplified by PCR technology and analyzed by bioinformatics.Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression of E/SP2 gene in different developmental stages（eggs，1*-5 instar nymphs，male and female adults）salivary gland and different tissues（malpighian tube，salivary gland，fat body，ovary，gut，head）of female adults.At the same time，RNAi technology was used to detect its effects on the survival and predation of maleand female E.furcellata adults.【Result】The ORF sequence of E/SP2 gene obtained from cloning was 861 bp，encoding 286 amino acids.The amino acid sequence of EfSP2 con-tained acomplete Tryp-SPc domain and aconserved initial amino acid sequence（IVGG）at theN-terminus of trypsin.It contained aconserved SP triplet catalyticactivity center and belonged to the tryptase subfamily of the serine protease fami-ly.It had the highest homology with Nezara viridula SP，with an amino acid sequence identity of44.69%.The E/SP2 gene was highly expressed in male and female adults and salivary glands of E.furcellata.The injection of dsESP2 signifi-cantly inhibited the expression of target genes（Plt;0.05，the same below），and significantly reduced the survival rate and predation of male and female E.furcellata adults.【Conclusion】The Efucellata venom serine protease EfSP2 gene is suc-cessfully cloned.The spatiotemporal expression profile and RNAi results show that EfSP2 islikely to be one of the impor-tant proteins in the processesof growth，development，predation and digestionof E.furcellata

Key words：Eocantheconafiurcellata（Wolff）;salivary gland;serine protease;gene cloning;expression pattern;RNA interference

Foundation items：Yunnan Agricultural Basic Research Joint Special Project（202301BD070001-137，202101BD 070001-050）;Yunnan Young and Middle-aged Academic and Technical Leaders Reserve Talents Project（202205AC 160077）;Yunnan Tobacco Company Science and Technology Plan Project（2023530000241012）

0引言

【研究意义】叉角厉蝽[Eocanthecona furcellata （Wolff）]隶属于半翅目（Hemiptera）蝽科（Pentatomi-dae）益蝽亚科（Asopinae），是一种具有良好捕食能力的天敌昆虫，对多种重要的农业害虫具有较好的防控效果（Wen et al.，2017;张曼等，2022），尤其对鳞翅目害虫有较强的控害能力（赵航等，2022），在生物防治方面极具应用潜力。捕食性节肢动物的唾液已被确定为毒素、过敏原及抗止血化合物的来源，包括些消化酶、蛋白质和肽类等。具有刺吸式口器的捕食性昆虫常依靠毒液毒素来捕食或麻痹猎物（Beak and Lee，2014）。有关捕食性昆虫毒液蛋白组分鉴定的研究报道了丝氨酸蛋白酶（Serine protease，SP）是捕食性昆虫毒液中普遍存在的蛋白组分（Beak and Lee，2014;Walkeret al.，2017，2018，2019;Rügen et al.，2021），在其捕食过程中伴随毒液的分泌通过口针释放到猎物体内，对自身的生长发育及猎物的捕食消化起重要作用。因此，深入研究捕食性昆虫叉角厉蝽唾液蛋白的生理功能不仅有利于揭示捕食者的捕食机制，同时也可为杀虫活性物质的开发提供新途径，对害虫绿色防控具有重要意义。【前人研究进展】捕食性蝽类具备灵活的刺吸式口器并伴随足和触角的配合与强大的消化酶系统，使得其可以有效捕食与自身体型接近或超过自身的猎物，以适应竞争激烈的捕食性生境（Cohen，1990）。饲养中发现，叉角厉蝽捕食行为与躅蝽（Arma chi-nensis）和黄带犀猎蝽（Betta macostoma）等捕食性蝽类的捕食行为类似（王燕等，2019;王亚楠等，2020），当搜寻到猎物后便会迅速发起进攻，直接将口针刺入猎物体内，同时分泌大量毒液释放到猎物体内导致猎物快速麻痹和死亡（Lemos et al.，2005;Azevedoet al.，2007），这种毒性主要由神经毒素和消化酶所导致（Walker et al.，2016）。昆虫中的丝氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白水解酶超家族，参与调控很多蛋白质水解级联反应，是大多数昆虫消化系统内重要的消化酶（刘巧英等，2016），同时在昆虫的免疫反应中也扮演着重要角色（初源，2017;唐琦等，2017）。根据蛋白结构域的不同，丝氨酸蛋白酶可分为单结构域和多结构域蛋白，其中单结构域蛋白主要发挥蛋白消化功能，多结构域蛋白多作用于各种生物过程中的分子识别（Ross et al.，2003;Veillard et al.，2016）。丝氨酸蛋白酶含有保守的S、H和D残基组成的催化三联体（Perona and Craik，1995;Pola-nowski and Wilusz，1996），在昆虫胚胎发育、信号转导、细胞分化、消化代谢和免疫防御反应中起重要作用（唐琦等，2017）。近年来，已有众多学者从许多昆虫中克隆得到多种丝氨酸蛋白酶基因，如烟草天蛾（Manduca sexta）卵中的多种丝氨酸蛋白酶参与黑化反应和抗菌肽合成，构成了烟草天蛾卵的先天性免疫系统（Gorman et al.，2004）;豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）丝氨酸蛋白酶ACYPI4531参与了豌豆蚜对细菌及真菌的免疫防御反应和酚氧化酶级联反应（王雯，2019）;茶尺蠖（Ectropis obliqua）丝氨酸蛋白酶基因EoSP1被成功克隆并说明该基因可响应茶尺蠖的饥饿反应（张新等，2019）;褐飞虱（Nilaparvata lugens）clip型的丝氨酸蛋白酶基因被成功克隆并证实其在褐飞虱的生长发育和免疫防御过程中发挥调控作用（邬伟等，2022）。天敌昆虫相关报道则相对较少，如寮黑瘤姬蜂（Coccygomimus laothoe）毒液中的丝氨酸蛋白酶能抑制寄主血淋巴黑化（Danneels et al.，2010）;丽蝇蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）毒液中的丝氨酸蛋白酶可诱导寄主草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的Sf21细胞凋亡（Formesyn et al.，2013）;管氏肿腿蜂（Sclerodermus guani）中的一个毒液丝氨酸蛋白酶基因被克隆并证实对寄主黄粉虫（Tenebrio molitor）蛹的体液免疫和细胞免疫具有调控作用（李丽芳，2016）。然而，有关捕食性昆虫中的丝氨酸蛋白酶相关功能还有待揭示。【本研究切入点】本课题组前期研究中发现叉角厉蝽丝氨酸蛋白酶基因E/SP2的转录水平较高（高平等，2021），推测其可能在叉角厉蝽的捕食过程中发挥作用，但有关E/SP2基因的相关研究迄今尚未见报道。【拟解决的关键问题】基于叉角厉蝽唾液腺转录组数据，通过PCR技术克隆E/SP2基因，并对其生物信息学和发育阶段及组织表达模式进行分析，通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术抑制该基因表达后检测其对叉角厉蝽存活及捕食的影响，以期为E/SP2基因的分子特征研究及功能注释提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试昆虫叉角厉蝽于2018年采集自云南省玉溪市元江县滨江大道小燕村，在实验室内于（27±1）℃、相对湿度60%～80%、光周期14L：10D的环境下用黄粉虫蛹饲养多代。

1.1.2主要试剂TRIzol试剂、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex Tag TMIⅡ（Tli RnaseH Plus）、E.coli DH5α Compe-tent Cells、pMD\"19-T Vector Cloning Kit、in vitro Transcription T7 Kit（for siRNA Synthesis）均购自宝生物工程（大连）有限公司；1.1×金牌Mix Ver.Trelief DNA Gel Extraction Kit、GoldenStar°T6 Super PCR Mix（1.1×）、IPTG、X-Gal、Amp*购自北京擎科生物科技有限公司，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2叉角厉蝽唾液腺RNA提取和cDNA合成取叉角厉蝽成虫（雄性：雌性=1：1）置于培养皿中，加入磷酸盐缓冲液（PBS），使用解剖镊和解剖针在日产Olympus双目立体解剖镜下解剖获得叉角厉蝽唾液腺，将其移至盛有200μL TRIzol试剂的1.5 mLRNase-free离心管中，每重复20个唾液腺（雄性：雌性=1：1），共3个重复。唾液腺充分研磨成匀浆后加入TRIzol至1mL用于RNA提取。提取的总RNA用Nano Drop 2000微量紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度，质量合格后进行下一步反应。去除基因组DNA反应体系10μL：5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，总RNA根据检测浓度定量至100ng～1μg，加无酶无菌水至10μL;反应条件：42℃2 min，4℃保存。反转录反应体系20μL：上述反应液10μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1μL，RT Primer Mix 1μL，5×PrimeScriot Buffer 4μL，无酶无菌水4μL;反应条件：37℃15 min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA置于-20℃保存备用。

1.3 EfSP2基因克隆

根据实验室前期从叉角厉蝽唾液腺转录组中获得具有完整开放阅读框（Open reading frame，ORF）的ESP2基因序列（高平等，2021），利用Primer Primer 5.0设计克隆引物；利用NCBI Primer-BLAST（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC=BlastHome）设计基因定量引物（表1）;以唾液腺cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系50μL：cDNA模板1μL，上、下游引物（10μmol/L）各2μL，1.1×金牌Mix Ver.45μL。扩增程序：98℃预变性2 min;98℃10s，58℃10s，72℃20 s，进行35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段通过凝胶回收试剂盒Trelief DNA Gel Extraction Kit回收，回收产物连接至pMD19-T Vector克隆载体并转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞，经培养箱菌液复苏后均匀涂抹在含有IPTG、X-Gal和Amp'的LB固体培养基上，再经蓝白斑筛选后挑选20个阳性克隆的单菌落在含有Amp*的LB液体培养基中37℃过夜培养，菌液PCR验证后，将阳性菌液送至北京擎科生物科技有限公司进行测序验证。

1.4 EfSP2基因的生物信息学分析

完成测序后，用DNAstar中的SeqMan拼接序列并用BiOXM与原序列比对，以确定序列的正确性，用BLAST（https：/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和DNAMAN进行氨基酸多序列比对，利用在线网站SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）预测信号肽、使用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）预测蛋白质的理论等电点、分子量和亲疏水性、NCBI（https：/www.ncbi.nlm nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测蛋白质结构域和保守位点、Cell-PLoc-2（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）预测蛋白质亚细胞定位，TMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）预测跨膜结构，运用MEGA 7.0中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树，采用Bootstrap法进行1000次循环检验。

1.5 EfSP2基因时空表达特征分析

分别收集叉角厉蝽不同发育阶段样本：卵50粒、1～3龄若虫唾液腺各40个、5龄若虫唾液腺及雌雄成虫唾液腺各20个；不同组织样本：来自10头3日龄雌成虫的唾液腺、头、脂肪体、卵巢、中肠和马氏管。每个样本3个重复。将解剖获得的各样本置于TRIzol试剂中，RNA提取和cDNA合成方法同1.2。使用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行实时荧光定量PCR，检测EfSP2基因在叉角厉蝽不同发育阶段和雌成虫不同组织中的表达特征。反应体系10.0μL：TB GreenPremix Ex TaqTM IⅡ5.0μL，cDNA模板1.0μL，上、下游引物（表1）各0.4μL，无酶无菌水3.2μL。扩增程序：95℃预变性30s;95℃5s，60℃30s，进行45个循环。每个样品3个生物学重复。内参基因选择E/RPL9，引物序列见表1。采用2-AAQ法分析基因相对表达量。

1.6 RNA干扰EfSP2基因后对叉角厉蝽存活及捕食的影响

为进一步研究EISP2基因在叉角厉蝽中的功能，对EfSP2基因进行RNAi试验。基于EfSP2和GFP基因的cDNA序列，利用Primer 5.0设计含T7启动子的特异性引物（表1），以克隆测序验证正确的EfSP2质粒和GFP质粒（购自北京擎科生物有限公司）为模板，使用GoldenStar T6 Super PCR Mix（1.1×）进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段通过凝胶回收试剂盒Trelief DNA Gel Extraction Kit对PCR产物进行纯化，纯化的DNA模板使用in vitro Transcription T7 Kit合成dsEfSP2和dsGFP，使用1%琼脂糖凝胶电泳评估dsRNA的完整性，并使用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计测量浓度，用无酶无菌水将dsRNA稀释至1000 ng/μL后置于-80℃条件下保存备用。

选择3日龄叉角厉蝽雌雄成虫进行RNAi试验，使用1μL的微量进样器在叉角厉蝽后胸与腹部节间膜最外侧部位缓慢注射1μL浓度为1000 ng/μL的dsRNA。注射后将叉角厉蝽转移至恒温培养箱中饲养，饲养条件为（27±1）℃，相对湿度60%～80%，光周期14L：10D。以注射dsEISP2的叉角厉蝽为试验组，注射dsGFP的叉角厉蝽为对照组，注射时每个时间点每组设10个重复，每个重复5头叉角厉蝽试虫，5头黄粉虫蛹供其取食，浸润的脱脂棉球提供水分。分别在注射后1、2、4和6 d解剖存活的叉角厉蝽收集唾液腺。解剖时每个时间点每组设3个重复，每个重复20个唾液腺用于检测叉角厉蝽唾液腺中ESP2基因的RNAi效果。

将5头黄粉虫蛹称重并记录，放置在培养皿中以供注射dsRNA的叉角厉蝽捕食，24 h后再次称重5头黄粉虫蛹并放入培养皿中，记录叉角厉蝽死亡数并计算叉角厉蝽每头每日捕食量，尔后再称重新鲜黄粉虫蛹后放入培养皿，共记录观察6 d，分析dsRNA对叉角厉蝽雌雄成虫的致死效果及对捕食量的影响，每处理10个重复，每个重复5头叉角厉蝽试虫。共进行3次注射试验，即每个时间每组共30个重复，至少15个重复的数据用于分析叉角厉蝽存活及捕食量。

1.7统计分析

试验数据采用Excel 2016进行处理，利用SPSS 25.0进行统计分析，不同处理之间基因表达的差异采用单因素方差分析，利用最小显著差数法（LSD）进行多重比较分析，RNAi效率及捕食量检测采用独立样本t检验法，显著性水平均为Plt;0.05。采用GraphPad Prism 8.0.2制图。

2结果与分析

2.1 EfSP2基因序列特征

从叉角厉蝽唾液腺克隆获得EfSP2的ORF序列，其编码区长861 bp，编码286个氨基酸，预测为亲水蛋白，理论分子量为31.42 kD，理论等电点为8.87。EfSP2氨基酸的N端有30个氨基酸残基的信号肽序列，有跨膜结构域，定位在细胞外。

EfSP2氨基酸序列有1个完整的Tryp-SPc结构域，含有胰蛋白酶N末端保守的起始氨基酸序列（IVGG），第44位的异亮氨酸残基I为剪切位点；第217位的天冬氨酸残基D，第244位的丝氨酸残基S和第246位的甘氨酸残基G是底物结合位点；与其他半翅目昆虫一样具有SP保守的三联体催化活性中心，组氨酸残基H、天冬氨酸残基D和丝氨酸残基S分别位于第42、90和186位（图1）。与其他半翅目昆虫构建系统发育进化树，结果显示，叉角厉蝽EfSP2与稻绿蝽（Nezara viridula）SP同源性最高，氨基酸序列一致性为44.69%（图2）。

2.2 EfSP2基因的时空表达特征

利用实时荧光定量PCR技术对EfSP2基因进行时空表达分析，结果显示，ESP2基因在叉角厉蝽各发育阶段均有表达，其中4～5龄若虫、雄成虫、雌成虫的表达量均显著高于其他发育阶段（Plt;0.05，下同），雌成虫的表达量最高，1龄若虫中几乎不表达（图3-A）。在雌成虫不同组织中，EfSP2基因在唾液腺中的表达量显著高于其他组织，其次是中肠，在脂肪体和卵巢中的表达量最低（图3-B）。

2.3 EfSP2基因的RNAi效应

检测结果（图4）显示，雌雄成虫注射dsEfSP2后不同时间，与注射dsGFP相比，注射dsEISP2后EfSP2基因的表达量均显著降低。其中，雌成虫注射后2～6 d表达量分别显著降低99.22%、99.89%和99.84%;雄成虫注射后1～6 d表达量分别显著降低95.16%、82.08%、99.96%和98.92%。总体来看，雌雄成虫目的基因干扰效率变化趋势一致，且在注射4和6 d后干扰效率最高。

2.4 RNAi后对叉角厉蝽存活率和捕食量的影响

对RNAi后叉角厉蝽的存活率进行统计，结果（图5-A和图5-B）显示，与对照相比，注射dsE/SP2基因后，叉角厉蝽雌雄成虫的存活率均显著下降，注射后第2 d存活率下降最快。注射dsGFP后叉角厉蝽雌成虫的平均生存时间为4.12±0.54 d，第4d的存活率为57.10%，注射dsEfSP2基因后叉角厉蝽雌成虫的平均生存时间为3.09±0.26 d，显著低于对照（x²=4.559，Plt;0.05），第3 d的存活率为40.00%。注射dsGFP基因后叉角厉蝽雄成虫的平均生存时间为4.53±0.55 d，第4d的存活率为84.60%，注射dsEfSP2基因后叉角厉蝽雄成虫的平均生存时间为2.75±0.27 d，显著低于对照（x²=9.212，Plt;0.05），第2 d的存活率为37.50%。

RNAi叉角厉蝽E/SP2基因表达后检测捕食量的变化，结果（图6-A和图6-B）显示，与注射dsGFP相比，注射dsEJSP2基因后，叉角厉蝽雌雄成虫的捕食量均显著低于对照，且一直保持较低水平。雌雄成虫均在注射5 d后捕食量最低，每头雌雄成虫的平均捕食量分别为1.27和1.28 mg。

3讨论

本研究通过叉角厉蝽唾液腺转录组数据和PCR技术克隆验证获得具有完整ORF的E/SP2基因序列。序列分析表明，该基因编码的氨基酸序列中存在信号肽序列，预示着其是分泌蛋白（Moreau and Asgari，2015）。氨基酸多序列比对发现EfSP2与其他半翅目昆虫的SPs氨基酸序列一样具有保守的三联体催化活性中心（组氨酸残基H、天冬氨酸残基D、丝氨酸残基S），说明ESP2基因为SP的成员。另外，EfSP2基因编码的氨基酸序列中有1个完整的Tryp-SPc结构域，在蛋白序列N端还含有保守氨基酸残基IVGG，属于丝氨酸蛋白酶家族中的类胰蛋白酶亚族。

昆虫中丝氨酸蛋白酶家族基因的表达谱呈现多样性，E/SP2基因在不同发育阶段和成虫不同组织中均有表达，但表达量存在差异。从不同发育阶段看，ESP2在4～5龄若虫和雌雄成虫中表达量最高，在卵、1～3龄若虫中表达量低，且在卵和1龄若虫中最低，可能与叉角厉蝽的捕食行为相关。据报道，叉角厉蝽捕食行为主要发生在若虫和成虫阶段，其中1龄若虫不捕食，仅靠吸食植物汁液即可完成发育，进入2龄后开始捕食，而且也有刺吸植物汁液的现象，随龄期的增长其植食性逐渐减弱，捕食性逐渐增强（姚明勇等，2019;张曼等，2022）。从成虫不同组织看，EfSP2在唾液腺中有极高的表达量，中肠次之，在脂肪体和卵巢中的表达量最低。唾液腺是昆虫产生唾液大分子物质尤其是唾液蛋白的重要消化器官（李飞等，2021），含有的蛋白质种类十分丰富，既有组织蛋白，也有分泌蛋白（马琳，2015;戚良轩等，2023）。捕食性蝽将唾液腺分泌的毒液通过口针注射到猎物体内迅速麻痹或杀死猎物，并利用其分泌的毒液蛋白对猎物中的营养物质进行体外消化后再由口针吸回，肠内消化（朱艳娟，2021;苏定义等，2023）。此外，中肠是昆虫摄取营养物质后的主要消化场所，因此结合前文所述，克隆得到的EfSP2蛋白属于分泌型毒液蛋白，且在叉角厉蝽若虫期2～5龄、雌雄成虫及在唾液腺和中肠中有较高的表达量，因此推测ESP2在叉角厉蝽的捕食和消化过程中至关重要。

近年来，已在众多昆虫中利用RNAi技术进行相关基因的功能解析，但不同种类的昆虫和不同的dsRNA递送方式对RNAi的敏感性差异很大（Belles，2010;Joga et al.，2016;许静静等，2022）。与喂食法和浸泡法相比，显微注射法可在一定程度上避免昆虫肠道上皮细胞、外部表皮等将一定量的dsRNA直接转运至靶标组织或血淋巴中，以达到高效率的RNAi效果（朱邦勤，2019）。本研究通过显微注射法将dsEfSP2注射入叉角厉蝽雌雄成虫体内，发现在注射dsEfSP2后1～6 d内雌雄成虫的干扰效率均较高，其中雌雄成虫被干扰后EISP2基因显著下调60.00%和80.00%以上，说明叉角厉蝽对RNAi显微注射法的敏感性好。在半翅目昆虫中，中黑盲蝽和褐飞虱对RNAi显微注射法也有较高的敏感性。通过显微注射法分别干扰中黑盲蝽中胰蛋白酶前体基因AsTryP和褐飞虱中丝氨酸蛋白酶基因NISCP4的表达后，与对照相比，目的基因表达水平分别显著下调65%以上和59%以上（朱邦勤，2019;邬伟等，2022）。本研究发现，当干扰ESP2基因表达后，叉角厉蝽雌雄成虫的存活率均显著下降，这一现象在豌豆蚜中也有发现，注射了dsSP后，豌豆蚜的存活率在8d内显著下降且更易感染病原菌（王雯，2019），证实ESP2基因参与了叉角厉蝽的生长发育过程。另一方面，EfSP2属于类胰蛋白酶亚族成员，类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在昆虫中参与多种生理生化过程，包括食物蛋白消化、激素活化、凝血、黑色素合成及抗微生物等免疫反应（葛钊宇等，2016;赵爱平，2017）。故而EJSP2基因可能也参与调节免疫生理。本研究检测了干扰E/SP2表达后叉角厉蝽的捕食量，发现1～6d内雌雄成虫的捕食量均显著下降。丝氨酸蛋白酶是昆虫主要蛋白质水解消化酶，其酶解产物是昆虫生存和繁殖所需营养的重要来源（Bao et al.，2014），ESP2对叉角厉蝽的捕食和消化至关重要，当被干扰表达后，必然会造成叉角厉蝽的消化系统紊乱，影响其捕食量。除消化功能外，丝氨酸蛋白酶还参与昆虫的血液凝固、免疫反应、信号转导、胚胎发育、细胞分化等作用（唐琦等，2017;赵爱平，2017），也有可能干扰ESP2基因的表达后，影响了叉角厉蝽的其他生理功能而造成其存活及捕食量显著降低，这些功能还有待进一步深入研究。而作为可分泌的毒液丝氨酸蛋白酶，EfSP2蛋白是否对猎物的生长发育、麻痹及免疫等方面存在影响，这将是本研究下一步的探索目标。

4结论

成功克隆了叉角厉蝽毒液丝氨酸蛋白酶E/SP2基因。时空表达谱及RNAi结果表明，EfSP2可能是叉角厉蝽生长发育、捕食和消化过程中的重要蛋白之一。

参考文献（References）：

初源.2017.丝氨酸蛋白酶SP1、SP13、SP105在亚洲玉米螟天然免疫反应中的功能及作用机制[D].北京：中国农业大学.[ChuY.2017.Functions and action mechanisms of serine proteaseSP¹、SP13 and SP105 in the innate immune"response in Ostrinia furnacatis（Guenée）[D].Beiing：China"Agricultural University.]

高平，廖贤斌，李丽芳，兰明先，赵航，陈斌，吴国星，高熹.2021.叉角厉蝽唾液腺转录组及差异分析[J].云南农业大学学报（自然科学），36（1）：29-38.[GaoP，LiaoXB，Li LF，Lan MX，Zhao H，Chen B，Wu GX，Gao X.2021.Transcriptome and difference analysis of Eocanthecona furcellata（Wolff）[J].Journal of Yunnan Agricultural Uni-versity（Natural Science），36（1）：29-38.]doi：10.12101/j.issn.1004-390X（n）.201011011.

葛钊宇，彭文学，李戎.2016.昆虫丝氨酸蛋白酶的分子特点及进化研究概况[J].南方农业，10（31）：47-50.[Ge ZY，Peng WX，Li R.2016.Molecular characteristics and evo-lutionary studies of insect serine proteases[J].South China Agriculture，10（31）：47-50.]doi：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.31.014.

李飞，易金玉，刘玉娣，侯茂林.2021.白背飞虱若虫和雄雌成虫唾液腺蛋白鉴定[J].昆虫学报，64（3）：281-301.[LiF，YiJY，Liu YD，Hou ML.2021.Identification of salivary gland proteins of nymphs and male and female adults of Sogatella furcifera（Hemiptera：Delphacidae）[J].Acta En-tomologica Sinica，64（3）：281-301.]doi：10.16380/j.kcxb 2021.03.001.

李丽芳.2016.管氏肿腿蜂毒液金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶基因的克隆与功能研究[D].昆明：西南林业大学.[Li LF.2016.Molecular cloning and functional characteriza tion of venouse metalloprotease and serine protease genes"of Scleroderma guani[D].Kunming：Southwest Forestry"University.]

刘巧英，李梦歌，刘雪飞，余昊，王运兵.2016.中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析[J].湖北农业科学，55（21）：5659-5663.[LiuQY，LiM G，Liu XF，Yu H，Wang YB.2016.Cloning and sequence analysis of serine pro-teinase of Adelphocoris suturalis Jakovlev[J].Hubei Agri-cultural Sciences，55（21）：5659-5663.]doi：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.056.

马琳.2015.角倍蚜唾液蛋白的研究[D].北京：中国林业科学研究院.[Ma L.2015.Studies on saliva protens of Chi-nese horned gall aphid，Schlechtendalia chinensis[D].Bei-jing：Chinese Academy of Forestry.]

戚良轩，徐晴玉，李晶，鞠佳菲，孙洋，方继朝，纪锐.2023.灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定[J].江苏农业学报，39（1）：30-36.[Qi LX，Xu QY，Li J，Ju JF，Sun Y，Fan JC，JiR.2023.Morphology and protein identification"of salivary sheath from Laodelphaxstriatellus[J].Jiangsu"Journal of Agricultural Sciences，39（1）：30-36.]doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2023.01.004.

苏定义，王玉琴，李露，吴国星，朱家颖.2023.捕食性蝽类唾液腺解剖方法——以叉角厉蝽为例[J].环境昆虫学报45（4）：1126-1129.[Su DY，Wang YQ，LiL，Wu GX，ZhuJY.2023.A protocol for dissecting the salivary gland from predatory bug-A case study in Eocanthecona furcel-lata[J].Journal of Environmental Entomology，45（4）：1126-1129.]doi：10.3969/j.issn.1674-0858.2023.04.32.

唐琦，周倩，邱立鹏，李东，李国辉.2017.丝氨酸蛋白酶在昆虫先天免疫中的功能和作用机制研究进展[J].蚕业科学，43（3）：502-508.[Tang Q，ZhouQ，Qiu LP，LiD，Li GH.2017.Advances in functions and action mechanism of serine protease in insect innate immunity[J].Science of Sericulture，43（3）：502-508.]doi：10.13441/j.cnki.cykx.2017.03.022.

王雯.2019.丝氨酸蛋白酶ACYPI4531在豌豆蚜免疫防御反应中的作用研究[D].杨凌：西北农林科技大学.[Wang W.2019.The role of serine protease ACYPI4531 in immune responses of the pea aphid，Acyrthosiphonpisum[D].Yangling：Northwest Aamp;F University.]

王燕，张红梅，尹艳琼，李向永，赵雪晴，唐艺婷，王孟卿，谌爱东，陈福寿，张礼生.2019.蜀蝽成虫对草地贪夜蛾不同龄期幼虫的捕食能力[J].植物保护，45（5）：42-46.[Wang Y，Zhang HM，Yin YQ，Li XY，Zhao XQ，Tang YT，Wang MQ，Chen AD，Chen FS，Zhang LS.2019.Preda-tion of adult of Arma chinensis to larvae of Spodoptera fru-giperda[J].Plant Protection，45（5）：42-46.]doi：10.16688/j.zwbh.2019346.

王亚楠，赵胜园，何运转，吴孔明，李国平，封洪强.2020.黄带犀猎蝽对草地贪夜蛾幼虫的捕食作用[J].中国生物防治学报，36（4）：525-529.[Wang YN，Zhao SY，HeYZ，Wu KM，LiG P，Feng HQ.2020.Predationof the larvae of"Spodoptera frugiperda（J.E.Smith）by Sycams croceouit-tatus Dohrn[J].Chinese Journal of BiologicalControl，36（4）：525-529.]doi：10.16409/j.cnki.2095-039x，2020.04.014.

许静静，常永梅，任梦圆，董艳玲，李永强.2022.豌豆蚜可溶型海藻糖酶基因克隆及RNA干扰效应[J].西南大学学报（自然科学版），44（11）：88-98.[Xu JJ，Chang YM，Ren MY，Dong YL，LiY Q.2022.Gene cloningand RNA interference effects of soluble trehalase gene of the pea aphid，Acyrthosiphon pisum[J].Journal ofSouthwest University（Natural Science Edition），44（11）：88-98.]doi：10.13718/j.cnki.xdzk.2022.11.009.

邬伟，程依情，王正亮，俞晓平.2022.褐飞虱clip丝氨酸蛋白酶基因NICSP4的克隆及功能分析[J].中国生物防治学报，38（5）：1202-1212.[Wu W，Cheng YQ，Wang ZL，Yu XP.2022.Cloning and function analysis of aclip-domain serine protease gene NICSP4 in the brown planthopper，Nilaparvata lugens（Hemiptera：Delphacidae）[J].Chinese Journal of Biological Control，38（5）：1202-1212.]doi：10.16409/j.cnki.2095-039x.2021.11.008.

姚明勇，王岚，周吕，黄敏，陈文龙.2019.性比对叉角厉蝽成虫寿命和繁殖力的影响[J].山地农业生物学报，38（3）：78-81.[Yao MY，Wang L，Zhou L，Huang M，Chen WL.2019.Effects of different sex ratios on longevity and fecun-dity of adults Cantheconidea furcellata（Hemiptera：Asopi-nae）[J].Journal of Mountain Agriculture and Biology，38（3）：78-81.]doi：10.15958/j.cnki.Sdnyswxb.2019.03.014.

张曼，高平，赵航，周辰彦，梁晨，汤永玉，邢孔正，吴国星，高熹.2022.捕食性天敌叉角厉蝽生长发育、繁殖及各虫态形态特征观察[J].南方农业学报，53（4）：1078-1087.[Zhang M，GaoP，ZhaoH，ZhouCY，Liang C，Tang YY，Xing KZ，Wu GX，Gao X.2022.Development，fecundity and morphological characteristics of the predatory Eocan-theconafucellata（Wolff）[J].Journal of Southern Agri-culture，53（4）：1078-1087.]doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2022.04.021.

张新，陈成聪，杜琴，李喜旺，孙晓玲.2019.茶尺蠖丝氨酸蛋白酶基因EoSPI的克隆、时空表达及对饥饿的表达响应[J].茶叶科学，39（6）：669-680.[Zhang X，Chen CC，Du Q，LiXW，Sun XL.2019.Cloning and expression analy-sis of serine protease EoSPI in tea geometrid（Ectropis obliqua）and its response to starvation[J].Journal of Tea"Science，39（6）：669-680.]doi：10.13305/j.cnki.jts.2019.06.006.

赵爱平.2017.梨小食心虫幼虫中肠胰蛋白酶活性、表达量及与生长发育的关系研究[D].杨凌：西北农林科技大学.[Zhao AP.2017.Study of midgut trypsin activities and gene expression in oriental fruit moths during larval deve-lopment[D].Yangling：Northwest Aamp;F University.]

赵航，廖贤斌，高平，邢孔正，梁晨，吴国星，陈斌，高熹.2022.叉角厉蝽对亚洲玉米螟幼虫的捕食功能反应[J].环境昆虫学报，44（2）：422-429.[Zhao H，LiaoXB，Gao P，Xing KZ，Liang C，Wu GX，Chen B，Gao X.2022.Functional"response of Eocantheconafiurcellata to the larvae of Ostri-nia furnacalis[J].Journal ofEnvironmental Entomology，44（2）：422-429.]doi：10.3969/j.issn.1674-0858.2022.02.19.

朱邦勤.2019.中黑盲蝽TiyP和PGL基因的克隆及生殖调控功能研究[D].武汉：华中农业大学.[Zhu BQ.2019.Cloning and reproductive regulation of TiyP and PGL"genes ofAdelphocoris suturalis[D].Wuhan：Huazhong"Agricultural University.]doi：10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000205.

朱艳娟.2021.蝎蝽消化器官的初步观察与消化酶活性的研究[D].北京：中国农业科学院.[Zhu YJ.2021.Prelimi-nary observation on digestive organs and activities of digestive enzymes in Arma chinensis（Hemiptera：Pen-tatomidae）[D].Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.]doi：10.27630/d.cnki.gznky.2021.000794.

Azevedo D 0，Zanuncio JC，Zanuncio JS，Martins GF，Marques-SilvaS，Sossai MF，Serrao JE.2007.Biochemi-cal and morphological aspects of salivary glands of the predator Brontocoris tabidus（Heteroptera：Pentatomidae）[J].Brazilian Archives of Biology and Technology，50：469-477.doi：10.1590/s1516-89132007000300013.

Bao YY，Qin X，Yu B，Chen LB，Wang ZC，Zhang CX.2014.Genomic insights into the serine protease gene family and"expression profile analysis in the planthopper，Nilapanvata lugens[J].BMC Genomics，15（1）：507.doi：10.1186/1471-2164-15-507.

Beak JH，Lee SH.2014.Differential gene expression profiles in the salivary gland of Orius laevigatus[J].Journal of Asia-Pacific Entomology，17（4）：729-735.doi：10.1016j.aspen.2014.06.015.

BellésX.2010.Beyond Drosophila：RNAiin vivo and functional genomics in insects[J].Annual Review of Entomology，55：111-128.doi：10.1146/annurev-ento-112408-085301.

Cohen AC.1990.Feeding adaptations in some predaceous Hemiptera[J].Annals of the Entomological Society of America，83（6）：1215-1223.

Danneels EL，RiversDB，de Graaf DC.2010.Venom proteins"of the parasitoid wasp Nasonia vitripenmis：Recent disco-very of an untapped pharmacopee[J].Toxins，2（4）：494-516.doi：10.3390/toxins2040494.

Formesyn EM，Heyninck K，de Graaf DC.2013.The roleof serine-and metalloproteases in Nasoniavitripenmis venom in cell death related processes towards aSpodoptera frugi-perda Sf21 celline[J].Journal of Insect Physiology，59（8）：795-803.doi：10.1016/j.jinsphys.2013.05.004.

Gorman MJ，Kankanala P，Kanost MR.2004.Bacterial chal-lenge stimulatesinnateimmuneresponses in extra-embryo-nic tissues of tobacco hornworm eggs[J].Insect Molecu-lar Biology，13（1）：19-24.doi：10.1111/j.1365-2583.2004.00454.x.

Joga MR，Zotti MJ，Smagghe G，Christiaens 0.2016.RNAi efficiency，systemic properties，and novel delivery me-thods for pest insect control：What we know so far[J].Fron-tiers in Physiology，7：553.doi：10.3389/fphys.2016.00553.Lemos WP，Ramalho FS，Serrao JE，Zanuncio JC.2005.Morphology of female reproductive tract of the predator"Podisus nigrispinus（Dallas）（Heteroptera：Pentatomidae）fed on diferent diets[J].Brazilian Archives of Biologyand Technology，48：129-138.doi：10.1590/s1516-89132005000100017.

Moreau MJS，Asgari S.2015.Venom proteins from parasitoid wasps and their biological functions[J].Toxins，7（7）：2385-2412.doi：10.3390/toxins7072385.

Perona JJ，Craik CS.1995.Structural basis of substrate speci ficityin the serine proteases[J].Protein Science，4（3）：337-360.doi：10.1002/pro.5560040301

Polanowski A，Wilusz T.1996.Serine proteinase inhibitors from insect hemolymph[J].Acta Biochimica Polonica，43：445-453.doi：10.18388/abp.1996-4476.

Ross J，Jiang HB，KanostM R，Wang Y.2003.Serine proteases and their homologs in the Drosophila melanogaster genome：An initial analysis of sequence conservation and phylogenetic relationships[J].Gene，304：117-131.doi：10.1016/s0378-1119（02）01187-3.

Rügen N，Jenkins TP，Wielsch N，Vogel H，Hempel BF，Süssmuth RD，Ainsworth S，Cabezas-Cruz A，Vilcinskas A，TonkM.2021.Hexapod assassins'potion：Venom com-position and bioactivity from the Eurasian Assassin bug"Rhynocorisiracumdus[J].Biomedicines，9（7）：819.doi：10.3390/biomedicines9070819.

Veillard F，Troxler L，Reichhart JM.2016.Drosophila melano-gaster clip-domain serine proteases：Structure，function and regulation[J].Biochimie，122：255-269.doi：10.1016/j.biochi.2015.10.007.

Walker AA，Hernandez MJ，Corzo G，Fry BG，King GF 2018.Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera[J].Cellular and Molecular Life Sciences，75：3215-3229.doi：10.1007/s00018-018-2768-1.

Walker AA，Madio B，Jin JY，Undheim EAB，Fry BG，King GE.2017.Melt with this kiss：Paralyzing and liquefying venom of the assassin bug Pristhesancus plagipennis（Hemiptera：Reduviidae）[J].Molecularamp;Cellular Pro-teomics，16（4）：552-566.doi：10.1074/mcp.ml16.063321.

Walker AA，Robinson SD，Undheim EA B，Jin JY，Han X，Fry BG，Vetter I，King GF.2019.Missiles of mass disrup-tion：Composition and glandular origin of venom used as aprojectiledefensiveweapon by the assassin bug Platymeris rhadamanthms[J].Toxins，11（11）：673.doi：10.3390/tox-insl1110673.

Walker AA，Weirauch C，Fry GB，KingGF.2016.Venoms of Heteropteran insects：A treasuretrove of diverse pharmaco-logical toolkits[J].Toxins，8（2）：43.doi：10.3390/toxins 8020043.

Wen J，Chen K，Fu L，Chen YG.2017.Exposure ofEocan-thecona furcellata（Hemiptera：Pentatomidae）nymphs and"adults to high temperatures induces an aestivo-hibernal egg diapause：A strategy for surviving hot summers[J].Applied Entomology and Zoology，52：457-467.doi：10.1007/s13355-017-0497-9.

（责任编辑 麻小燕）