香港牡蛎cyclinB基因组织表达特征及其多克隆抗体制备

邱衡通（1988-），海洋生物学博士，主要从事海洋经济生物生理生态 与海洋牧场信息化研究工作。主持广西科技基地和人才专项“高盐胁迫 对香港巨牡蛎鳃组织主要细胞周期蛋白表达影响的研究”、北部湾环境 演变与资源利用教育部重点实验室系统基金项目“北部湾大弹涂鱼群体 遗传多样性研究”等科研项目4项；作为主要成员参与国家重点研发计划 项目、国家自然科学基金面上项目、广西自然科学基金面上项目等国家 级或省部级科研项目10余项。在《Frontiers in Immunology》《Fishes》《Ma- rine Genomics》《南方农业学报》等国内外权威期刊上发表学术论文20余 篇；作为第一发明人申请国家发明专利1项，参编专著1部；指导国家级、 自治区级大学生创新创业训练计划项目2项。

摘要：[目的]明确香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）B型细胞周期蛋白基因（cyclin B）组织表达特征，并通过原核表达融合蛋白制备多克隆抗体， 为探究香港牡蛎cyclin B基因在环境胁迫下的表达特征及揭示cyclin B调控贝类细胞周期的作用机制提供理论依据。[方法]克隆香港牡蛎cyclin B基因cDNA序列，通过SignalP-5.0、ProtParam、TMHMM 2.0、NetSurfP 2.0及Bioedit 7.0等软件进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR检测cyclin B基因在香港牡蛎不同组织中的表达情况;构建重组质粒pET32a-cyclin B并运用原核表达系统诱导表达融合蛋白，经Ni-NTA镍离子亲和层析柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备鼠源多克隆抗体，然后以间接ELISA检测多克隆抗体效价、Westernblotting检测多克隆抗体特异性。[结果]香港牡蛎cyclin B基因cDNA序列全长2353 bp，包括1299 bp的开放阅读框（ORF）、103 bp的5'非编码区（5'-UTR）和951 bp的3'非编码区（3'-UTR），共编码432个氨基酸残基。香港牡蛎cyclin B蛋白相对分子量为49.13 kD，理论等电点为7.16，不含信号肽和跨膜结构域。香港牡蛎cyclin B氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框，与来自同属的长牡蛎cyclin B氨基酸序列相似性最高（98.8%），基于cyclin B氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示香港牡蛎与长牡蛎的亲缘关系最近。cyclin B基因在香港牡蛎的闭壳肌、外套膜、性腺、鳃唇瓣、消化腺等组织中均有表达，以性腺中的相对表达量最高，显著高于其他组织中的相对表达量（Plt;0.05）。通过原核表达获得的融合蛋白cyclin B具备良好免疫原性，且主要以包涵体形式存在;以其免疫BALB/c小鼠制备出的鼠源多克隆抗体效价大于1：64000，能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白。[结论]香港牡蛎cyclin B基因具有较高的保守性，其氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框;香港牡蛎cyclin B基因表达具有广谱性和组织差异性，在调控生殖细胞减数分裂过程中发挥作用。通过原核表达体系及免疫注射BALB/c小鼠制备获得的cyclin B鼠源多克隆抗体具有高效价，能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白，为进一步探究香港牡蛎cyclin B的生物学功能与表达调控机 理提供了技术支持。

关键词：香港牡蛎；cyclin B基因；表达特征；多克隆抗体；减数分裂

中图分类号：S968.31

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2024）04-0909-11

Tissue distribution characteristics of cyclin B gene in Hong Kong oyster （Crassostrea hongkongensis） and preparation of its polyclonal antibody

QIU Heng-tong1， XU Gui-lin1， LI Wan-yi1， ZHOU Qi-jia1， LIU Xiao-ning2， ZHU Jun-lin1

（1Key Laboratory of Environment Change and Resources Use in Beibu Gulf， Ministry of Education/Institute of Geography and Oceanography， Nanning Normal University， Nanning， Guangxi 530100， China;2Guangxi Academy of Marine Sciences （Guangxi Mangrove Research Center）， Guangxi Academy of Sciences/Research Center for Carbon Sink and Low-carbon Engineering in the Beibu Gulf of Guangxi， Nanning， Guangxi 530007， China）

Abstract：【Objective]The objective of this study was to clarify the tissue expression characteristics of cyclin B pro-tein gene （cyclin B） in Hong Kong oyster （Crassostrea hongkongensis）， and to prepare polyclonal antibody by prokaryo-tic expression fusion protein， so as to provide a theoretical basis for exploring the expression characteristics of cyclin Bin C. hongkongensis under environmental stress and revealing the mechanism of cyclin B in regulating the cell cycle ofshellfish. 【Method】 The cDNA sequence of cyclin B gene was cloned from C. hongkongensis， and the bioinformaticsanalysis was performed by softwares such as SignalP-5.0， ProtParam， TMHMM 2.0， NetSurfP 2.0 and Bioedit 7.0， andthe expression of cyclin B gene in different tissues was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The recombi-nant plasmid pET32a-cyclin B was constructed， the fusion protein was induced by the prokaryotic expression. Polyclonalantibodies were prepared by immunizing BALB/c mice after purification by Ni-NTA nickel ion affinity chromatographycolumn， and then the polyclonal antibody titer was detected by indirect ELISA and the specificity of polyclonal antibodywas detected by Western blotting. 【Result]The cDNA sequence of cyclin B gene in C. hongkongensis was 2353 bp inlength， including 1299 bp open reading frame （ORF）， 103 bp 5' non-coding region （5'-UTR） and 951 bp 3' non-codingregion （3'-UTR）， encoding a total of 432 amino acid residues. The calculated molecular weight of cyclin B protein in C.hongkongensis was 49.13 kD， the theoretical isoelectric point was 7.16， and it did not contain signal peptide and trans-membrane domain. The amino acid sequence of cyclin B contained two conserved cyclin boxes， and the amino acid se-quence of cyclin B was the most similar to that of Pacific oyster （98.8%）， the phylogenetic tree based on amino acid se-quence also showed that cyclin B of C. hongkongensis was the most closely related to that of Pacific oyster. The cyclin Bgene was expressed in the adductor muscle， mantle， gonad， gill， labial palp and digestive gland of C. hongkongensis，and the relative expression level in the gonad was the highest， which was significantly higher than that in other tissues （Plt;0.05）. The fusion protein cyclin B obtained by prokaryotic expression system exhibited good immunogenicity and mainlyexisted in the form of an inclusion body. The titers of the polyclonal antibody detected via immunizing BALB/c mice wereabove 1：64000， and the polyclonal antibody could specifically recognize cyclin B protein in the gonad of C. hongkongen-sis. 【Conclusion]The cyclin B gene of C. hongkongensis is highly conserved， and its amino acid sequence contains twoconserved cyclin boxes. The expression of cyclin B gene in C. hongkongensis is broad-spectrum and tissue specific， andplays a role in regulating the process of meiosis of germ cells. The murine polyclonal antibody prepared by prokaryotic ex-pression and immunization of BALB/c mice exhibits high titers， it can specifically recognize the cyclin B protein in thegonad of C. hongkongensis， and provides technical support for further exploring the biological function and expressionregulation mechanism of cyclin B in C. hongkongensis.

Key words： Crassostrea hongkongensis; cyclin B gene; expression characteristics; polyclonal antibody; meiosis

Foundation items： Marine Agriculture and Freshwater Fishery Science and Technology Innovation\" Project of National Key Research and Development Program of China （2022YFD2401200）; Guangxi Science and Technology Base and Talent Special Project （Guike AD21075012） ; Project of Key Laboratory of Environment Change and Resources Use in Beibu Gulf， Ministry of Education （KLOP-X1910）; Guangxi College Student Innovation and Entrepreneurship Training Project（S202310603072）

0 引言

【研究意义】香港牡蛎（Crassostrea hongkongen- sis）原称近江牡蛎，天然分布于我国南方沿海地区， 是我国牡蛎养殖的三大主导品种之一（张兴志等，2019，2022）。近年来，随着规模化养殖和品质的提升，香港牡蛎已获得中国农产品地理标志登记保护，并荣登中国品牌价值评价榜，成为北部湾海洋经济产业的新名片（潘英等，2015；黄一琦和孙凌梅，2019）。据统计，2020年仅广西的香港牡蛎产值就达100亿元，经济价值极高（潘英等，2021），香港牡蛎养殖已成为北部湾海洋贝类养殖的支柱产业。牡蛎养殖产值的增长与筏式养殖规模扩张存在直接联系，但筏式养殖可能会给牡蛎带来不合适的生境胁迫（Bodenstein et al.，2023），如香港牡蛎大规模死亡通常与其养殖区的海水盐度过高或污染状况有关（李蔚等，2020）。因此，开展香港牡蛎抗逆境胁迫的生理机制研究，对促进其养殖产业可持续健康发展具有重要意义。【前人研究进展】细胞周期蛋白（Cyclin，CYC）最先是在海胆（Arbacia punctulata）胚胎中被发现和鉴定（Evans et al.，1983），随后在高等真核生物中相继发现以cyclin A、cyclin B、cyclin C、cyclin D和cyclin E等命名的CYC（Lew et al.，1991），且这些CYC呈细胞周期时相性表达、累积与分解，通过选择性结合并顺序活化其依赖性激酶（CDKs），而精准调节细胞周期时相间的转换（Satyanarayana and Kal-dis，2009）。细胞周期检查点信号通路是通过感受器、信号转导和效应器对细胞内外环境做出反应，而决定是否影响细胞周期进程。B型CYC（cyclin B）从G1期末期开始表达积累，至G2期末期达峰值并持续至M期后才开始降解，是G2期进入M期和染色体分离的主要调节因子（Murray，2004）。cyclin B广泛存在于水生动物中。杨亚男等（2013）研究表明，近缘新对虾（Metapenaeus affinis）cyclin B基因以卵巢和肌肉中的表达水平较高，其次是胸神经节和心脏，在鳃组织、眼柄神经节及肝胰腺中几乎不表达；并证实终浓度0.1～1.0mmol/L的IPTG均能成功诱导近缘新对虾cylin B重组蛋白的原核表达。Héloise等（2016）研究证实，紫海胆（Sphaerechinusgranularis）和青灰拟球海胆（Paracentrotus lividus）卵受精后，cyclin B基因mRNA的翻译依赖于mTOR（雷帕霉素靶蛋白）信号通路活性。Zhu等（2016）研究发现，夏眠期间刺参（Apostichopus japonicus）的cyclin B基因表达水平显著低于非夏眠刺参，且cyclin B基因的表达与其核心启动子甲基化修饰水平呈正相关。邬婧等（2021）研究发现，光裸星虫（Sipunculus nudus）的cyclin B参与卵母细胞减数分裂G1/S期和G2/M期转换，对促进卵母细胞减数分裂有序进行起重要作用。贝类在净化水体的过程中发挥重要作用，同时具有很高的经济价值和营养价值，但目前针对贝类cyclin B的研究相对较少。Lamers等（2002）在斑马贻贝（Dreissena polymorpha）中克隆获得cyclin B基因，并证实cyclin B基因在斑马贻贝的卵巢、鳃等组织中高表达；王桐等（2011）在长牡蛎（C.gigas）中克隆得到cyclin B3基因cDNA全长序列，并证实长牡蛎cyclin B3基因含有10个外显子和9个内含子，具有较强的组织表达特异性，在性腺中的表达水平较高，且随性腺发育程度的推进而提高；刘佳敏等（2020）研究发现，三角帆蚌（Hyrio-psis cymingii）的cyclin B基因在各组织中广谱表达，尤其在性腺中高表达；经RNA干扰后性腺和鳃细胞中的G2/M期细胞比例下降，表明cyclin B基因在三角帆蚌中能调控细胞分裂。【本研究切入点】至今，有关香港牡蛎生长发育调控的研究主要集中在表观性状及组学等方面（官俊良等，2016；严雪瑜等，2022），但针对香港牡蛎cyclin B基因的研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】以二倍体香港牡蛎为研究对象，克隆cyclinB基因及分析该基因在香港牡蛎不同组织中的表达分布特征，并通过原核表达融合蛋白制备多克隆抗体，为探究香港牡蛎cyclin B在环境胁迫下的表达特征及揭示cyclin B调控贝类细胞周期的作用机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

试验用香港牡蛎均采自广西钦州市龙门港镇茅 尾海海域，挑选规格基本一致、无外观损伤的二倍体 香港牡蛎个体（1.5龄，体质量约110g），在盐度 15%o、水温26°℃的条件下室内暂养3d，期间每日换 水2次，换水后投喂蛋白核小球藻（Chlorella pyre- noidosa）和亚心形扁藻（Platymonas subcordiformis）的混合藻液。暂养结束后，使用蚝刀开壳并立即采 集香港牡蛎的闭壳肌、外套膜、性腺、鳃、唇瓣、消化 腺等组织样品，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存 备用。

1.2总RNA提取及反转录

使用RNAiso Plus（TaKaRa）从组织样品中提取总RNA，溶解于DEPC处理水，每份吸取3.0μg总RNA，以DNase I（EN0521）处理去除基因组DNA。 重新量取1.5 μg RNA，按照RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）使用说明合成cDNA 第一链。

1.3 cyclin B基因克隆及测序

在NCBI网站检索香港牡蛎基因组组装序列（GCA 015776775.1），运用BioEdit 7.0建立本地序列比对数据库（Alzohairy，2011）。参照香港牡蛎鳃组织转录组cyclin B基因序列及长牡蛎cyclin B基因序列（GenBank登录号XM 011413733.3），搜索香港牡蛎cyclin B基因组序列，运用BLASTp分析起始密码子和终止密码子，设计香港牡蛎cyclin B基因特异扩增引物对：F1（5'-TAAGAATTTGAACACCCCCG-3）和R1（5'-ATTTTATTTCCTTTATTTCATATC-3'），F2（5'-GCAGTGAATATGGTGAGAACAAG-3）和R2（5'-AAAGTAAAAATTATCAAATAGGTC-3'），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其中，引物对F1/R1用于第1轮PCR扩增，引物对F2/R2用于巢式PCR扩增。PCR反应体系20.0 μL：10xEx Taq PCRBuffer 2.0 pμL， dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 uL，上、下游引物（10 μumol/L）各1.2 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.1 μL，cDNA 模板/PCR扩增产物0.2 μL，双蒸水补足至20.0 μL。扩增程序：95 °C预变性5min;95 C30 s，58℃ 30 s，72°C160 s，进行35个循环;72 °C延伸5 min。使用胶回收试剂盒[B518131.生工生物工程（上海）股份有限公司]纯化回收目的片段，连接至pMD19-T载体，并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选出阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4序列分析

运用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）、BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、SignalP-5.0 （https：//services.healthtech. dtu. dk/services/SignalP-5.0/） ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/compute_pi/）、TMHMM 2.0 （https：//ser-vices.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）、Expasy-ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）、Pf-Phospho（http：//202.54.249.134/DB/predict.php）及Net-SurfP 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP-2.0/）等在线软件进行生物信息学分析，包括开放阅读框（ORF））查找、同源比对分析、信号肽预测、分子量和理论等电点（pI）预测、跨膜结构域预测、亲/疏水性预测、磷酸化位点预测、蛋白结构域预测等；采用Bioedit 7.0和MEGA 7.0分别进行多序列比对分析及构建系统发育进化树（Kumar et al.，2016）。

1.5实时荧光定量PCR检测

设计实时荧光定量PCR扩增引物F-rt（5'-TGCATACTCATCTTGAAACAATG-3'）和 R-rt（5'-TCTGGTTACAATCTGCTGTTG-3'）（引物跨越内含子），以β-Actin为内参基因，通过CFXConnect荧光定量PCR仪（Bio-Rad）检测cyclin B基因在香港牡蛎闭壳肌、外套膜、性腺、鳃、唇瓣和消化腺等组织中的表达情况，每个组织样品设6个生物学重复。实时荧光定量 PCR反应体系 20.0 μL：PowerUp SYBR Green预混液（A25778）10.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上、下游引物（10 pμmol/L）各1.0 μL，双蒸水补足至20.0 μL。扩增程序：95 °℃预变性2 min;95 °℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行 40个循环。熔解曲线生成过程：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min;从65 ℃以 0.3 ℃/10 s的速率升至95 °℃，确定熔解曲线为单一峰（邱衡通，2019）。每份cDNA样品设3个平行。

1.6 重组蛋白诱导表达与纯化

根据香港牡蛎cyclin B 基因 ORF序列，设计引物 F（5'-ccggaattcATGCATACTCATCTTGAAACAATG-3'）和 R（5'-acgcgtcgacTCATAGATCGTTCTGAGATGCCAA-3'），在引物5'端加入EcoR I和SalI酶切位点及保护碱基（小写字母部分），以重组质粒 pMD19T-cyclin B为模板扩增 cyclin B基因 ORF序列。然后双酶切 PCR扩增产物和 pET32a（+）质粒，回收酶切产物并以T4连接酶进行连接，再转化DH5a感受态细胞，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。以构建的重组质粒pET32a-cyclin B转化BL21（DE3）感受态细胞，并按1：100的比例接种至LB液体培养基中，37℃下摇床（180 r/min）培养2h左右，当菌液OD600为0.6时加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，诱导表达4h。收集100mL IPTG诱导的菌液，超声波破碎菌体后，4℃下12000r/min离心10min，以含1mmol/L DTT的预冷STET缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl， 100 mmol/L NaCl， 1 mmol/LEDTA，5%Triton X-100，pH8.0）重悬沉淀，4℃下12000 r/min离心10min，再以4 mL的6mol/L盐酸胍（含5mmol/LDTT）重悬沉淀，4℃下12000r/min离心10min，收集上清液，经0.22um孔径过滤器过滤后流经Ni-NTA镍离子亲和层析柱，以含20mmol/L咪唑的Wash Buffer洗脱杂蛋白，以含200 mmol/L咪唑的Elute Buffer洗脱目的蛋白。将含融合蛋白的洗脱液转移至透析袋中进行低温复性，并以12%SDS-PAGE分析样品中的蛋白组分。

1.7多克隆抗体制备与抗体效价测定

将融合蛋白 cyclin B与弗氏完全佐剂（F5881，美国Sigma公司）等体积混合乳化，按100 μg/只的剂量经皮下多点注射BALB/c 小鼠;注射 14 d后以融合蛋白 cyclin B与弗氏不完全佐剂（F5506，美国Sigma公司）乳化液进行加强免疫，随后每只小鼠再免疫3次，每次免疫间隔时长均为14d。免疫5次后，从小鼠尾静脉采集少量血清测定抗体效价。取2μg/mL融合蛋白于4℃下过夜包被，按1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000的比例梯度稀释血清，然后分别取100.0μL梯度稀释血清加入96孔细胞板中，室温孵育1h后TBST洗涤 3次；加入5000倍稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG （二抗），37℃下孵育45min，TBST洗涤3次；加入TMB显色液（100μL/孔）避光显色10min，酶标仪测定OD4somm，评估小鼠是否需要加强免疫。若无需加 强免疫，则在第5次免疫后第10d采集小鼠血清， -20°℃保存备用。

1.8 Western blotting检测

采集香港牡蛎性腺组织置于1.5mL离心管中， 按1：10（w/v）比例加入1×蛋白上样缓冲液，冰上匀 浆后95℃变性10min，然后在25℃下12000r/min 离心10min，收集上清液并进行SDS-PAGE分析。 然后将凝胶上的蛋白条带转印至硝酸纤维素膜 （HATF00010）上，经丽春红染液染色后，根据蛋白泳 道将硝酸纤维素膜裁剪成长条状，以5%脱脂牛奶室 温封闭1h，分别将硝酸纤维素膜长条置于5mL离心管中，每管加入4mL含小鼠抗体血清（1：1000稀释）的封闭液，4℃孵育12h，PBST洗膜3次（每次10min）；加入HRP标记山羊抗小鼠IgG（二抗），室温孵育1.5h，PBST洗膜3次，DAB显色试剂盒（DA1010，北京索莱宝科技有限公司）避光显色。

1.9统计分析

通过2-Aaa法计算cyclin B基因在香港牡蛎各组 织中的相对表达量（Livak and Schmittgen，2001），采 用GraphPad Prism 6.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）及Tukey's LSD多重比较（Qiu et al.，2019）。 2结果与分析

2.1 香港牡蛎cyclin B基因克隆及测序结果

扩增得到的香港牡蛎cyclin B基因（GenBank登录号OR690110）cDNA序列长2353bp，包括1299bp的ORF、103bp的5'非编码区（5'-UTR）和951bp的3'非编码区（3'-UTR），共编码432个氨基酸残基。香港牡蛎cyclin B蛋白相对分子量为49.13kD，pI为7.16。SignalP-5.0和TMHMM 2.0预测结果表明，香港牡蛎cyclin B氨基酸序列不含信号肽（图1-A）和跨膜结构域（图1-B）；Expasy-ProtScale预测发现，香港牡蛎cyclin B氨基酸序列N端亲水性较强，C端亲水性偏弱（图1-C）；Pf-Phospho预测结果表明，香港牡蛎cyclin B蛋白存在4个潜在的磷酸化位点，分别位于102Thr、103Ser、104Ser和141Ser处。

2.2 cyclin B氨基酸序列比对分析结果

cyclinB氨基酸序列比对分析结果（图2）显示，香港牡蛎与九孔鲍（Haliotis diversicolor supertexta）、欧洲笠螺（Patella vulgata）、大西洋浪蛤（Spisulasolidissima）、斑马纹贻贝（Dreissena polymorpha）、长牡蛎（Crassostrea gigas）、鸭嘴海豆芽（Lingula ana-tina）、虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）等物种的cyclin B氨基酸序列相似性分别为58.5%、56.1%、58.8%、60.0%、98.8%、50.0%和62.8%，说明cyclin B在软体动物中的保守性较高，尤其与来自同属的长牡蛎cyclin B氨基酸序列相似性最高。此外，香港牡蛎cyclin B氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框（Terminal cyclin box），即N端周期蛋白框和C端周期蛋白框，二者均具有5个保守的α-螺旋结构域。不同物种的cyclinB氨基酸序列均表现为N端的氨基酸序列保守性低于C端。

2.3系统发育进化树分析结果

从NCBI网站检索哺乳动物、两栖动物、鱼类、贝类、腕足类等物种的cyclin B氨基酸序列，基于cyclin B氨基酸序列相似性构建系统发育进化树，结果（图3）显示可划分为四大类群，即cyclin B、cyclinB1、cyclin B2和cyclin B3。其中，贝类和腕足类的cyclin B在系统发育进化树中形成单独的1个分支，且独立于哺乳动物、两栖动物和鱼类的cyclin B1、cyclin B2和cyclin B3。在基于cyclin B氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树中，香港牡蛎与长牡蛎的亲缘关系最近，与物种进化的分类地位相吻合。

2.4香港牡蛎cyclin B基因组织表达特征分析结果

利用实时荧光定量PCR检测cyclin B基因在香 港牡蛎不同组织中的表达情况，结果（图4）显示， cyclin B基因在香港牡蛎的闭壳肌、外套膜、性腺、 鳃、唇瓣及消化腺等组织中均有表达，以性腺中的相 对表达量最高，其次是唇瓣，在闭壳肌中的相对表达 量最低。香港牡蛎cyclin B基因在性腺中的相对表达量显著高于其他组织中的相对表达量（Plt;0.05）， 而在闭壳肌、外套膜、鳃、唇瓣和消化腺等组织间的相对表达量无显著差异（Pgt;0.05）。

2.5融合蛋白cyclin B表达与纯化效果

采用IPTG诱导重组质粒pET32a-cyclin B转化的BL21（DE3）表达菌株，超声波破碎菌体，离心收集菌体蛋白进行SDS-PAGE分析，结果（图5）显示， IPTG诱导表达获得的融合蛋白cyclin B大小约67.0 kD，与预期结果一致，且融合蛋白cyclin B主要以包涵体形式存在。采用Ni-NTA镍离子亲和层析 柱对融合蛋白cyclin B进行纯化，以ProteinRuler®I 蛋白分子量标准（DR101，北京全式金生物技术有限公司）为参照，SDS-PAGE分析结果显示，约在67.0kD处得到1条清晰的蛋白条带，其大小与预测结果 基本一致，且无明显杂带。

2.6多克隆抗体制备及其抗体效价测定结果

以融合蛋白cyclin B为免疫源制备鼠源多克隆 抗体，运用间接ELISA测定多克隆抗体效价。将采 集制备的免疫小鼠血清按1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000比例进行梯度稀释，同 时设1：1000稀释的未免疫小鼠血清为阴性对照、封 闭液为空白对照，以HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗，通过酶标仪测定OD4s0mm，结果（图6）显示，免疫接种 的6只小鼠均产生良好的免疫反应，采集到的鼠源 多克隆抗体血清稀释至1：64000时，其OD450mm仍是阴性血清OD4somm的2倍以上，表明血清抗体效价大 于1：64000，抗体效价较高，也进一步证实通过原核 表达获得的融合蛋白cyclin B具备良好免疫原性。

2.7 Western blotting检测结果

为检测制备获得的cyclin B鼠源多克隆抗体特 异性，以6只免疫小鼠血清抗体为一抗、1：1000稀释 的HRP标记山羊抗小鼠IgG为二抗，对香港牡蛎性 腺总蛋白进行Western blotting检测，结果（图7）显 示，以未免疫小鼠空白血清孵育未出现明显的目的 条带，而6只免疫小鼠的血清抗体均在49.0kD处出现明显的目的条带，且条带大小与香港牡蛎cyclin B蛋白的理论分子量一致，说明制备获得的cyclin B鼠 源多克隆抗体能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白，且在同等稀释倍数下以1号小鼠的血清抗体 识别效果最优。

3讨论

cyclin B作为最早被发现的CYC，在细胞分裂 周期转变过程中发挥重要调节作用（刘佳敏等， 2020；邬婧等，2021）。本研究从香港牡蛎中克隆获 得的cyclin B基因cDNA序列长2353bp，包括1299bp的ORF、103bp的5'-UTR和951bp的3'-UTR，共编码432个氨基酸残基。香港牡蛎cyclin B蛋白理论 分子量为49.13 kD，与cyclin A、cyclin E等蛋白的分子量非常相近（闫鸣等，2021）。动物cyclin B基因包 含多种亚型，其中，cyclin BI和cyclin B2基因最早从 非洲爪蟾（Xenopus laevis）受精卵mRNA文库中分 离获得（Minshull et al.，1989），cyclin B3基因最早在 原鸡（Gallus gallus）中分离获得（Gallant and Nigg， 1994）。由基于cyclin B氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树可知，贝类cyclin B在系统发育进化树上独立于哺乳动物、两栖动物和鱼类的cyclin B1、 cyclin B2和cyclin B3。贝类cyclin B与其他物种 cyclin B间的差异进化提示其行使的生物学功能可 能已存在一定程度的分化。多序列比对分析发现， 香港牡蛎和其他物种的cyclin B氨基酸序列具有较 高保守性，均包含2个保守的周期蛋白框，而周期蛋 白框结构域在介导cyclin B与CDK1结合及其活性 激活方面发挥着重要作用（Cukier et al.，2007）。cyclin B-CDK1复合体可磷酸化G2/M期细胞器分 离、线粒体活性、核膜破裂、染色体分裂等过程所 需的蛋白（Álvarez-Fernández and Malumbres，2014;Malumbres，2014）。a-螺旋密集分布在香港牡蛎cyclin B蛋白的周期蛋白框中，与cyclin E蛋白的结构特点十分相似（Qiu et al.，2024），这种复杂结构有助于cyclin B蛋白与CDKs分子间的结合。细胞有丝分裂间期，cyclin B穿梭于细胞质与细胞核之间，在有丝分裂前期cyclin B在细胞核内迅速累积，但这种累积作用主要依赖于CDK1活性（Gavet and Pines，2010）。cyclin B的细胞核累积能增加对y射线诱发细胞凋亡的敏感性（Porter et al.，2003）。

本研究通过实时荧光定量PCR检测cyclin B基因在香港牡蛎不同组织中的表达情况，结果表明，cyclin B基因在香港牡蛎性腺中的相对表达量显著高于在闭壳肌、外套膜、鳃等组织中的相对表达量，与斑节对虾（Penaeus monodon）（Qiu et al.，2007）、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）（Han et al.，2012）及三角帆蚌（刘佳敏等，2020）的cyclin B基因组织表达谱基本一致。此外，长牡蛎cyclin B3基因的表达水平随着性腺发育程度的推进而升高（王桐等，2011），通过RNAi干扰三角帆蚌cyclin B基因表达可降低性腺和鳃组织中的G2/M期细胞比例（刘佳敏等，2020）。cyclin A、cyclin B和cyclinE基因在性腺组织中的高表达现象与cyclin C和cyclin D2基因有所不同（冯上乐等，2021），提示cyclin A、cyclin B和cyclin E基因在调控机体生殖细胞减数分裂过程中发挥重要的协同作用。本研究结果表明，香港牡蛎cyclin B基因在闭壳肌、外套膜、鳃、唇瓣、消化腺等组织中均有表达分布，说明这些高度分化的组织仍具备一定的细胞有丝分裂活力，而cyclin B基因或许是维持这些组织细胞数量的必须基因（Han et al.，2017），但具体原理还有待进一步探究。

Western blotting已广泛应用于检测分析蛋白表达水平及其相互作用关系，但依赖于识别目标蛋白特异性抗体的制备。本研究通过构建重组质粒pET32a-cyclin B并运用原核表达系统，成功诱导表达获得融合蛋白cyclin B，通过免疫BALB/c小鼠制备出鼠源多克隆抗体，其血清抗体效价大于1：64000，进一步证实通过原核表达获得的融合蛋白cyclin B具备良好免疫原性。Western blotting检测结果表明，使用制备获得的cyclin B鼠源多克隆抗体能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白，为深入研究贝类cyclin B的生物学功能提供了技术支撑。此外，本研究检测到的香港牡蛎性腺cyclin B蛋白只出现1种亚型，与金鱼（Carassius auratus）（Yamashitaet al.，1995）和罗氏沼虾（Macrobrachium rosenber-gii）（冯海洋和邱高峰，2011）卵巢中的cyclin B 亚型数量相同，但在海胆（Meijer et al.，1989）、海星（Marthasterias glacialis） （Pondaven et al.， 1990）、非洲爪蟾（Gautier and Maller，1991）和中华绒螯蟹（Erio-cheir sinensis）（冯海洋和邱高峰，2011）的卵母细胞中存在2 种cyclin B蛋白亚型，可能与 cyclin B蛋白的磷酸化修饰有关，也提示cyclin B参与调控性腺发育的作用机理可能存在物种差异。cyclin B 蛋白的时空差异表达塑造了细胞有丝分裂的有序性，而细胞周期检查点保证了细胞分裂的实效性。cyclin B-CDK1复合物构成G2/M期检查点（Jiang et al.，2005），因此能决定细胞分裂是否继续进行。可见，香港牡蛎 cyclin B多克隆抗体的制备与蛋白表达水平检测可为评估盐度、温度等环境胁迫对牡蛎组织细胞有丝分裂活力的影响提供重要依据。

4结论

香港牡蛎cyclin B基因具有较高的保守性，其氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框；香港牡蛎cyclin B基因表达具有广谱性和组织差异性，在调控生殖细胞减数分裂过程中发挥作用。通过原核表达体系及免疫注射BALB/c小鼠制备获得的cyclin B鼠源多克隆抗体具有高效价，能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白，为进一步探究香港牡蛎cyclin B的生物学功能与表达调控机理提供了技术支持。

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（责任编辑 兰宗宝）