热水浴法解除蚕卵滞育的条件优化及应用效果分析

摘要：【目的】通过Box-Behnken响应面优化热水浴法解除蚕卵滞育的处理条件，并测试以不同来源水处理蚕种的孵化效果，为热水浴法在蚕业生产中的推广应用提供科学依据，探索出可替代传统盐酸孵化法且更安全环保、成本低廉的蚕种人工孵化方法。【方法】选用两广二号为供试蚕种，以卵龄（A）、处理时间（B）和处理温度（C）为变量，以蚕卵实用孵化率（Y）为响应值，通过Box-Behnken响应面优化热水浴法解除蚕卵滞育的处理条件；选择自来水、纯净水及矿泉水等不同来源的水，并选取萨尼斯、932、湘晖和春5等4个蚕种品种，分别采用优化后的条件对蚕卵进行热水浴处理，检验热水浴法解除蚕卵滞育的效果。【结果】蚕卵实用孵化率对3个变量因素的二项式拟合方程为：Y=91.03-2.01A-4.60B+22.89C+0.040AB+4.03AC+0.89BC-10.46A2+3.25B2-19.60C2，响应面设计模型拟合程度较好。各因素对蚕卵实用孵化率的影响排序为处理温度（C）gt;处理时间（B）gt;卵龄（A），其中，处理温度影响极显著（Plt;0.01），处理时间影响显著（Plt;0.05，下同），卵龄影响不显著（Pgt;0.05，下同）;两因素间交互作用对蚕卵实用孵化率的影响排序为ACgt;BCgt;AB。修正后的热水浴法最佳处理条件：卵龄17.5h，处理时间13s，处理温度50℃，此条件下的实际蚕卵实用孵化率为97.94%，与理论预测值（98.81%）接近。不同来源水对两广二号正、反交种进行热水浴处理后的实用孵化率均在95.00%以上，仅阳山自来水和纯净水1在热水浴处理两广二号正交种时的实用孵化率显著低于盐酸即时浸酸法，但其实用孵化率仍高于93.00%;萨尼斯、932、湘晖、春5等4个家蚕品种的热水浴实用孵化率与盐酸即时浸酸法相比均无显著差异，表明热水浴法具有较强的普适性。【结论】热水浴法能有效解除蚕卵滞育，具有较强的普适性，且成本低廉、操作简单，可作为蚕业生产上替代传统盐酸孵化法的新方法。

关键词：热水浴法；二化性家蚕品种；蚕卵；解除滞育；人工孵化；响应面优化

中图分类号：S882.35文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）01-0280-10

Optimization of conditions and application effect analysis for prevention of diapause in silkworm eggs by hot water treatment

SUN Zhen-bo¹·2，LIAO Sen-tai¹，YANG Qiong¹，LIU Ji-ping2，XIAO Yang'，LI Qing-rong'，XING Dong-xu¹

（'Sericulture and Agri-food Research Institute，Guangdong AcademyofAgricultural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510610，China;2College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou，

Guangdong510642，China）

Abstract：[Objective]The Box-Behnken response surface was used to optimize the treatment conditions of the hot water bath method for relieving silkworm egg diapause，and to test the hatching effect of sikworm eggs treated with wa-ter from different sources，so as to provide ascientific basis for the promotion of the hot water bath method in sericul-ture production，and to explore asafer，environmentally friendly and cost-effective method of artificial hatching for silk-worm egs，which could be used instead of the traditional hydrochloric acid hatching method.[Method]The treatment conditions of relieving silkworm egg diapause by hot water bath were optimized by Box-Behnken response using Liang-guangNo.2as the test species，with egg age（A），treatment time（B）and treatment temperature（C）as the variables，and practical hatching rate（Y）as theresponse value;different sources of water suchas tap water，pure water and mineral wa-ter were selected and four silkworm varieties such as Sanisi，932，Xianghui and Chun5were selected to test the effect of hot water bath method in relieving diapause by applying optimized conditions to silkworm eggs in hot water bath treat-ment respectively.【Result]The binomial fitting equation of silkworm egg practical hatching rate to the thre variable factors was Y=91.03-2.01A-4.60B+22.89C+0.040AB+4.03AC+0.89BC-10.46A2+3.25B2-19.60C2，which was agood fit for the response surface design model.The effect of each factor on the practical hatching rate of eggs was ranked as treat-ment temperature（C）gt;treatment time（B）gt;egg age（A），in which the effects of treatment temperature were extremely significant（Plt;0.01），the effects of treatment time weresignificant（Plt;0.05，the samebelow），and theeffects of egg age were insignificant（Pgt;0.05，the same below）;and the effects of the interaction between the two factors on practical hat-ching rate of silkworm eggs wereranked as ACgt;BCgt;AB.The optimum treatment conditions of the modified hot water bath method were：egg age17.5h，treatment time13s，andtreatment temperature50°℃.The actual practical hatching rate of silkworm eggs was97.94%，which was close to the theoretical predicted value（98.81%）.The practical hatching rates of different sources of water for the hot water bath treatment of the orthogonal and inverse crosses of Liangguang No.2were all above95.00%，and only the practical hatching rates ofYangshan tap water andpure waterl in the hot water bath treat-ment of the orthogonal cross of LiangguangNo.2were significantly lower than those of the hydrochloric acid instant acid immersion method，but their practical hatching rate was still higher than93.00%;there was no significant difference in the practical hatching rate of four silkworm varieties，including Sanisi，932，Xianghui and Chun5，in the hot water bath method compared with the hydrochloric acid instant acid immersion method，indicating that the hot water bath method had astrong generalization.【Conclusion]Hot water bath method can effectively relieve the diapause of silkworm eggs has strong generalization，and low cost，simple operation，can be used as anew method to replace traditional hydrochlo-ric acid incubationmethod in sericulture production.

Keywords：hot water treating method;bivoltine silkworm breed;sikworm egg;relieving diapause;artificial incu-bation;response surface optimization

Foundation items：Youth Project of National Natural Science Foundation of China（31702189）;Guangxi Key Re-search and Development Plan Project（GuikeAB23026056）;General Project of Guangdong Natural Science Foundation（2021A1515010595）;Guangdong Agricultural Science and Technology Innovation and Extension System Construction Project（2021KJ124）

0引言

【研究意义】蚕桑业是我国的特色优势产业，而广西是我国最大的桑蚕产区。为满足蚕桑业的生产需求，通常需要对蚕种进行人工孵化处理，其中盐酸孵化是目前生产上通用的方法（蒋满桥等，2012;Li et al.，2019;张静宇，2020），但盐酸对人体具有很强的刺激毒害性，对机械设施也有较强的腐蚀性。随着我国对化学品管控的日趋严格，盐酸的采购和管理也极为不便。此外，即时浸酸对盐酸浓度有严格要求，操作技术要求非常高（徐世清等，1990）。因此，亟待研发出更安全、环保、便捷的人工孵化方法以促进蚕桑业高质量发展。【前人研究进展】除了盐酸孵化法外，已报道的人工孵化方法还包括温水浸渍法（杨邦杰等，1983;杨希哲和付图强，1993）、电晕人工孵化法（叶士璟等，1996;张雨丽等，2020;Zhang et al.，2022）、过氧化氢活化法（沈爱英等2003;江志勇等，2005）、二甲基亚砜孵化法（Yama-moto et al.，2013）、高浓度氧孵化法（龚竞等，2020）等，且部分方法涉及的相关作用机制已得到初步验证（徐世清等，2004;Gong et al.，2016;龚竞等，2017）。在上述方法中，高浓度氧孵化法、电晕人工孵化法和过氧化氢活化法较安全环保且有效，但高浓度氧孵化法的处理时间较长（龚竞等，2020），电晕人工孵化法尚未实现大批量处理蚕种（张雨丽等，2020;Zhang et al.，2022），而过氧化氢活化法因产卵介质不同其处理方法也不同（沈爱英等，2003）。因此，这3种人工孵化方法在蚕桑生产中仍未能推广应用。此外，杨邦杰等（1983）以二化性白茧种华十原种及华九×瀛汗为供试蚕种，发现温水浸渍处理后蚕卵实用孵化率可超过90%。杨希哲和付图强（1993）通过研究温水浴种对二化性蚕品种秋星、781和苏3×秋3的孵化效果，发现温水浴种对二化性蚕品种781和苏3×秋3的效果较好。但与盐酸孵化法相比，上述人工孵化方法的蚕种孵化效果还有待进一步提高。蒋满桥等（2012）采用不同酸类物质和温水处理产卵后20h的两广二号蚕种，结果发现温水浸渍时间为1～20min时，家蚕孵化率仅在18.4%～85.7%，不具备实用价值。可见，温水浸渍处理条件对蚕种解除滞育的效果并不理想，达不到实用化水平。【本研究切入点】本课题组前期研究发现，卵龄16h的两广二号蚕种经50℃水浴处理15s可获得与盐酸孵化法相当的孵化效果，但针对热水浴法的处理条件尚未进行深入研究，其应用效果也有待进一步验证。【拟解决的关键问题】通过Box-Behnken响应面优化热水浴法解除蚕卵滞育的处理条件，同时测试以不同来源水处理蚕种的孵化效果，以期为热水浴法在蚕业生产中的推广应用提供科学依据，探索出可替代传统盐酸孵化法且更安全环保、成本低廉的蚕种人工孵化方法。

1材料与方法

1.1试验材料

供试蚕种为二化性四元杂交品种两广二号正交种（9芙×7湘）和反交种（7湘×9芙），由广东丝源集团有限公司阳山分公司提供。自来水分别取自广州市天河区和阳山县阳城镇，其他纯净水和矿泉水购自盒马鲜生超市，各种水pH如下：广州自来水pH6.7、阳山自来水pH6.5、纯水（RO）pH6.8、纯净水1pH6.9、纯净水2pH6.5、纯净水3pH6.8、矿泉水1pH7.5、矿泉水2pH7.2、矿泉水3pH7.3。

1.2单因素试验

1.2.1处理温度对蚕卵实用孵化率的影响将两广二号正交种（9芙×7湘）蚕卵（卵龄18h）热水浴处理20s，比较不同处理温度（46、48、50、52和54℃）对蚕卵实用孵化率的影响，每个温度处理3个卵圈。

1.2.2卵龄对蚕卵实用孵化率的影响两广二号正交种（9芙×7湘）蚕卵在50℃下热水浴处理20s，比较不同卵龄（12、15、18、21和23h）对蚕卵实用孵化率的影响，每个卵龄处理3个卵圈。

1.2.3处理时间对蚕卵实用孵化率的影响两广二号正交种（9芙×7湘）蚕卵（卵龄18h）在50℃下进行热水浴处理，比较不同处理时间（10、15、20、25和30s）对蚕卵实用孵化率的影响，每个时间处理3个卵圈。

1.3Box-Behnken响应面优化热水浴处理法

以卵龄（A）、处理时间（B）和处理温度（C）为变量，以蚕种实用卵化率（Y）为响应值，设计3因素3水平试验，利用Design-Expert10进行Box-Behnken试验设计，试验因素与水平设计见表1，试验方案见表2。每个组处理6个卵圈。

1.4热水浴法应用效果分析

1.4.1不同来源水对蚕卵实用孵化率的影响按Box-Behnken响应面试验得到的最优处理条件，分别以不同来源的水进行热水浴处理，以盐酸即时浸酸法（1.075g/mL HCl，卵龄20h，46℃处理5min）为阳性对照，未处理蚕卵为阴性对照。每个试验组处理12个卵圈（6个正交种卵圈，6个反交种卵圈），收蚁后统计实用孵化率。

1.4.2不同家蚕品种对实用孵化率的影响按Box-Behnken响应面试验得到的最优处理条件，分别对一化性家蚕品种萨尼斯和二化性家蚕品种932、湘晖、春5等进行热水浴处理，以盐酸即时浸酸法（1.075g/mL HCl，卵龄20h，46℃处理5min30s）为阳性对照。每个试验组处理3个卵圈，收蚁后统计实用孵化率。

1.5统计分析

采用Excel2019和SPSS26.0进行数据整理及显著性分析，并以Origin2019b进行绘图。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1处理温度对蚕卵实用孵化率的影响由图1可知，处理温度为50℃时蚕卵实用孵化率最高[（98.50±0.57）%]，处理温度上升到54℃时蚕卵实用孵化率最低[（0.87±0.44）%]。各温度处理组间的蚕卵实用孵化率均存在显著差异（Plt;0.05，下同），表明处理温度对蚕卵实用孵化率影响显著。

2.1.2卵龄对蚕卵实用孵化率的影响由图2可知，卵龄18h的蚕卵实用孵化率最高[（96.23±1.56）%]，与其他卵龄处理组间存在显著差异；卵龄12h的蚕卵实用孵化率最低[（45.96±4.17）%]。随着卵龄的增加，蚕卵实用孵化率呈先上升后下降的变化趋势，卵龄在18～24h的范围内，蚕卵实用孵化率呈逐渐下降趋势，说明随着胚胎进入深度滞育后热水浴法解除滞育的效果较差。

2.1.3处理时间对蚕卵实用孵化率的影响由图3可知，处理时间为20s时蚕卵实用孵化率最高[（96.83±0.91）%]，与处理15、25和30s的蚕卵实用孵化率存在显著差异。各处理组的蚕卵实用孵化率均在90.00%以上，表明蚕卵实用孵化率受处理时间的影响较小。

2.2Box-Behnken响应面优化结果

2.2.1回归方程建立及方差分析结果采用Design-Expert10对表3的试验数据进行多元回归拟合，得到二项式拟合方程：Y=91.03-2.01A-4.60B+22.89C+0.040AB+4.03AC+0.89BC-10.46A2+3.25B2-19.60C2。

由表4可知，该模型的Plt;0.0001，表明该模型极显著;失拟项P=0.7484gt;0.05，表明模型失拟项不显著，说明该方程对试验拟合较好，可用于后续研究。对模型进行回归方程系数显著性检验，结果显示，处理温度影响极显著（Plt;0.01，下同），处理时间影响显著，卵龄影响不显著（Pgt;0.05，下同），卵龄和处理温度的平方项均极显著，而处理时间的平方项不显著，说明各因素对蚕卵实用孵化率的影响不是简单线性关系。交互项均表现为不显著，说明不同因素间的交互作用对蚕卵实用孵化率的影响较小。根据F可知，在所取因素水平范围内，各因素对蚕卵实用孵化率的影响排序为处理温度（C）gt;处理时间（B）gt;卵龄（A），各因素间交互作用对蚕卵孵化率的影响排序为ACgt;BCgt;AB。

2.2.2交互作用影响分析结果由回归方程得出响应面图（图4～图6），可直观反映卵龄（A）、处理时间（B）、处理温度（C）各因素交互作用对蚕卵实用孵化率的影响。两因素交互作用的响应曲面越陡峭且等高线越接近椭圆形，表明交互作用对响应值的影响越显著（刘彦峰等，2022;李凡等，2023）。图4中

响应曲面平缓，表明卵龄（A）与处理时间（B）对蚕卵实用孵化率的交互作用不明显；图5中响应曲面较陡峭，且其等高线呈椭圆形，表明卵龄（A）与处理温度（C）的交互作用对蚕卵实用孵化率有明显影响；图6也显示处理时间（B）与处理温度（C）的交互作用对蚕卵实用孵化率的影响较小，与模型方差分析结果一致。

2.2.3验证试验结果通过Design-Expert10分析得到热水浴处理最优条件为卵龄17.65h、处理时间13.11s、处理温度50.32℃，在此条件下的蚕卵理论孵化率为98.81%。综合考虑实际生产中的操作可行性，对最优条件进行修正：卵龄17.5h，处理时间13s，处理温度50℃。3次平行试验得到的蚕卵实用孵化率平均值为97.94%，与模型预测值接近，说明可通过Box-Behnken响应面法优化热水浴处理条件。

2.3热水浴法应用效果分析

2.3.1不同来源水对蚕卵实用孵化率的影响为检验热水浴法的应用效果，选取不同来源的自来水、纯净水和矿泉水，以优化后的条件处理蚕卵，试验结果如图7～图8及表5所示。以不同来源水对两广二号正、反交种进行热水浴处理后的实用孵化率均在95.00%以上。其中，与盐酸即时浸酸法相比，以不同来源水对两广二号反交种（7湘×9芙）进行热水浴处理的实用孵化率均无显著差异，但在正交种（9芙×7湘）中阳山自来水和纯净水1的热水浴实用孵化率显著降低。无论正交种还是反交种，采用热水浴法处理后各组的蚕卵实用孵化率均超过生产合格指标（实用孵化率≥93%）。

2.3.2不同家蚕品种对实用孵化率的影响为检验不同家蚕品种对热水浴法解滞育效果的影响，采用优化后的热水浴处理条件（卵龄17.5h，处理时间13s，处理温度50℃）对萨尼斯、932、湘晖和春5等家蚕品种滞育卵进行处理，结果（图9）显示，与盐酸即时浸酸法相比，4个家蚕品种滞育卵经热水浴处理后的实用孵化率均无显著差异。其中，一化性品种萨尼斯经2种孵化方法处理后的实用孵化率均较低，可能是其滞育程度相对于二化性品种更深所致。

3讨论

本研究以二化性四元杂交组合两广二号为供试家蚕品种，选用对蚕卵孵化率影响较大的卵龄、处理温度和处理时间3个因素进行Box-Behnken试验设计，所得试验结果以Design-Expert10进行分析并拟合构建相应的数学模型，其回归分析结果表明：处理温度对蚕卵实用孵化率的影响极显著，处理时间的影响显著，卵龄的影响不显著，且不同因素间的交互作用对蚕卵实用孵化率的影响较小。结合生产实际，优化得到热水浴法处理蚕卵的最优条件：卵龄17.5h，处理时间13s，处理温度50℃。在此条件下，蚕卵实用孵化率平均值达97.94%，可有效解除蚕种滞育。据统计，1992—2020年家蚕品种两广二号在广西和广东蚕区的发种量已超过1亿张，其中盐酸即时浸酸蚕种占有较高比例（陈振烽和肖杰章，2013;冯家新等，2021）。热水浴法的操作简便、普适性强，与盐酸孵化法相比更加安全、环保，且能降低生产成本，在我国蚕区具有极高的推广价值。本课题组下一步将针对全国其他蚕区的主导品种开展热水浴解滞育试验，同时探究热水浴法对家蚕生长发育及经济性状的影响，为热水浴法的实际推广应用提供更多科学依据。

为综合考虑全国各蚕区自来水的pH和成分组成差异是否会影响热水浴的处理效果，本研究选取不同来源的自来水、纯净水和矿泉水进行蚕种热水浴处理，结果发现，不同来源水对两广二号正、反交种进行热水浴处理后的实用孵化率均在95.00%以上，仅阳山自来水和纯净水1在热水浴处理两广二号正交种时的实用孵化率显著低于盐酸即时浸酸法，但其实用孵化率仍高于93.00%，超过现行标准对蚕卵实用孵化率的要求，说明不同来源水对热水浴处理蚕种的孵化效果无明显影响。此外，本研究选用一化性品种萨尼斯及二化性品种932、湘晖和春5等不同家蚕品种进行热水浴处理，结果发现4个家蚕品种的热水浴实用孵化率与盐酸即时浸酸法相比均无显著差异，表明热水浴法具有较强的普适性，在蚕桑生产中具有极高的应用潜力。除家蚕品种春5外，其他品种经热水浴处理后的实用孵化率略低于盐酸即时浸酸法，可能是不同家蚕品种的最佳热水浴处理条件有所差异，因此今后需针对不同家蚕品种进行热水浴处理条件优化。

蔡晓明和朱勇（2003，2004a，2004b）研究认为，H*是盐酸孵化法的效应离子，推测H*可改变细胞膜的通透性，同时影响生物酶的稳定性和活性。蒋满桥等（2012）用不同酸类物质处理滞育蚕卵，结果发现不同酸类物质间的效果差异是由pH不同所引起，指出H浓度在解除蚕卵滞育中发挥重要作用。

Gong等（2016）、许瑾等（2020，2021）通过研究盐酸处理对生物酶的影响，发现在盐酸即时浸酸卵中的海藻糖酶、海藻糖合成酶、山梨醇脱氢酶、己糖激酶及磷酸果糖激酶等生物酶表达水平与滞育卵存在显著差异。此外，Kitta等（2015，2018）研究发现盐酸孵化法解除蚕种滞育还与Ca2+从绒毛膜和蚕卵内部外排有关。本研究中，不同来源水的热水浴处理均能有效解除蚕种滞育，其pH范围在6.5～7.5，其中3个矿泉水均呈弱碱性，表明H*并非热水浴法的主要影响因子。Box-Behnken响应面分析结果表明，处理温度是影响热水浴法实用孵化率的最主要因素，与徐世清等（2004）研究认为高温在解除蚕卵滞育上可能发挥重要作用的结论一致，但热水浴法解除蚕卵滞育的机制是否与盐酸孵化法相同还有待进一步探究。

4结论

热水浴法能有效解除蚕卵滞育，具有较强的普适性，且成本低廉、操作简单，可作为蚕业生产上替代传统盐酸孵化法的新方法。热水浴法解除蚕卵滞育的最佳处理条件：卵龄17.5h，处理时间13s，处理温度50℃，在此条件下蚕卵实用孵化率可达97.94%。

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（责任编辑 兰宗宝）