温度刺激对催青期樗蚕卵中孵化酶基因PccHE表达量的影响

张 豪 梁 爽 冯晓霞

(1广西壮族自治区农业广播电视学校，广西南宁 530007； 2广西壮族自治区农业职业技术学院，广西南宁 530007)

樗蚕(Philosamiacynthiacynthia)是鳞翅目(Lepidoptera)大蚕蛾科(Saturniidae)樗蚕属(Philosamia)的吐丝营茧昆虫[1]，其茧可缫丝、蛹可食用的特性决定了其同时也是一种十分重要的野蚕种质资源。催青是将解除滞育后的蚕卵在人工干预下置于适宜的温度、湿度、空气和光照条件中，促使卵内胚胎正常发育至孵化出蚁蚕的技术过程[2]。催青过程中的温湿度控制是蚕种催青的核心，需要贯穿整个催青过程，环境中适宜的温湿度可为蚕卵胚胎的生长发育提供基本条件[3]。家蚕卵胚胎发育速度与催青有效积温存在高度正相关关系[4]，蚕卵催青温度直接影响蚕卵的孵化整齐度、孵化率高低、蚁体健康[5-9]。

孵化酶是卵生动物(昆虫、鱼类、鸟类和爬行动物等)胚胎发育到特定阶段出现的一类蛋白酶，其表达受到极其精准的信号调控并具有组织特异性[10]。2018年，广西壮族自治区蚕业科学研究院野蚕研究室成功克隆到了樗蚕孵化酶基因PccHE，并对其做了表达特性分析[11]，为后续研究樗蚕卵孵化的分子调控机制打下了基础。为了进一步了解樗蚕卵孵化速度与催青温度之间的关系，利用qRT-PCR技术对PccHE在催青不同时期热处理后的相对表达量进行了分析，现将有关情况报告如下，供同仁参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试樗蚕卵 樗蚕卵，由广西壮族自治区蚕业科学研究院野蚕研究室保存提供。

1.1.2 主要试剂 TRIzon Reagent RNA提取试剂盒，购自康为公司；RNA反转录试剂盒，购自Tiangen公司；荧光实时定量PCR试剂盒SsoFast，购自Bio-Rad公司。

1.1.3 主要仪器 CFX96荧光实时定量PCR仪，Bio-Rad公司产品；HWS-450F恒温培养箱，丙林公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 樗蚕卵在室内与培养箱中催青的孵化率统计 按照浦月霞等[11]的方法在温度25 ℃、相对湿度75%的室内和培养箱中分别对樗蚕卵进行催青，并在第10天统计其孵化率。试验区(培养箱)和对照区(室内)各设置8个重复区，每区约200粒蚕卵，分别挑选其中生长发育情况基本一致的5个区进行混合取样和统计。

1.2.2 热处理 在温度25 ℃、相对湿度75%的培养箱中对樗蚕卵进行催青，设置进行干热空气处理的试验区和不进行干热空气处理的对照区，各8个重复区，每区约800粒蚕卵。分别在催青第2天、第5天、第8天的上午8：00随机从8个重复区中混合选取状态基本一致的蚕卵400粒，用46 ℃干热空气处理1 h，以不进行干热空气处理作为对照，重复3次，于干热空气处理后0 h、3 h和6 h(当日9：00、12：00和15：00)分别收集试验区和对照区的樗蚕卵样品各20粒，置于-80 ℃保存备用。未取样蚕卵用于之后的孵化率统计。

1.2.3 樗蚕卵样品总RNA的提取及cDNA的合成 (1)总RNA的提取。按照TRIzon Reagent RNA提取试剂盒的操作步骤进行，分别提取培养箱催青过程中第2天、第5天、第8天上午9：00、12：00及15：00试验区和对照区樗蚕卵样品的总RNA，最后将吸附柱置于一个新的RNase-Free离心管中，向吸附柱的中间部位加入30～50 μL RNase-Free水，室温放置1 min，12 000 r/min离心1 min，收集RNA溶液，-80 ℃保存。(2)cDNA的合成。根据RNA反转录试剂盒说明书操作，反转录体系10 μL，5×gDNA Buffer 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free水补足体系至10 μL，放置于42 ℃ PCR仪器内5 min后取出，然后加入配制好的反转录混合液(反转录试剂盒自带)10 μL，将加入反转录混合液的离心管置于PCR仪中反应，42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，最后获得的cDNA于-20 ℃保存。反转录混合液10 μL，反应体系为10×Fast Buffer 2 μL，RT Enzyme 1 μL，Primer Mix 2 μL，RNase-Free水5 μL。

1.2.4 催青不同时期热处理后不同时间樗蚕卵PccHE相对表达量的qRT-PCR定量检测 将合成的cDNA分别用双蒸水稀释20倍，然后按照荧光实时定量PCR试剂盒说明配制10 μL反应体系进行反应，qRT-PCR引物名称及序列见表1。2×SsoFast Buffer 5.00 μL，正反引物各0.25 μL，cDNA模板2.00 μL，双蒸水2.50 μL，每个样品3个重复，置于qRT-PCR仪器内进行反应。设定反应时间及参数如下：①95 ℃ 1 min；②95 ℃ 5 s；③58 ℃ 10 s；④重复②和③40个循环；⑤16 ℃恒温。得出的△Ct按标准化进行计算[10，12-13]。

表1 qRT-PCR引物名称及序列

引物名称引物序列(5′-3′)qRT-PccHE-FGCCACGCCTGCCATCGTCAGqRT-PccHE-RCTTCCCGCTATTCTCCTCGGqRT-PccGAPDH-FGCTGGTGCTGAATATGTTGTqRT-PccGAPDH-RGCACCACGGCCATCACGCCA

1.2.5 催青不同时期热处理后的樗蚕卵孵化率的调查试验 按照浦月霞等[11]的方法分别对在培养箱中催青第2天、第5天、第8天经过热处理1 h的樗蚕卵进行孵化率统计，以在培养箱中催青第10天的樗蚕卵为对照。

1.3 统计分析方法

利用Excel 2016和GraphPad软件对樗蚕卵孵化率和热处理樗蚕卵后孵化酶基因PccHE的相对表达量变化数据进行整理，并进行绘图。图中计量数据均以“平均数±标准差”表示，方差分析为单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 室内催青与培养箱中催青的樗蚕卵孵化率

从室内与培养箱中催青的樗蚕卵孵化率(图1)可以看出，催青室内樗蚕卵的孵化率为87%，培养箱中樗蚕卵的孵化率为88%，室内催青与培养箱中催青的樗蚕卵孵化率无显著性差异。

图1 室内与培养箱中催青的樗蚕卵孵化率

2.2 催青不同时期热处理后不同时间樗蚕卵PccHE的相对表达量

在胚胎发育不同时期，温度刺激(46 ℃干热空气处理)后不同时间对樗蚕卵中孵化酶基因PccHE的相对表达量的影响如图2所示：在胚胎发育早期(催青第2天)，PccHE对温度刺激没有响应，热处理后3 h和6 h的相对表达量均无显著性差异；在胚胎发育中期(催青第5天)，PccHE对温度刺激出现响应，但在热处理后3 h的相对表达量无显著性差异，热处理后6 h，相对表达量下降，表达量受到了抑制；在胚胎发育后期(催青第8天)，热处理后3 h樗蚕卵中PccHE的相对表达量受到抑制，之后迅速上升。对照区同一天内，PccHE相对表达量均无显著性差异。

*表示两者间差异显著(P<0.05)。图2 催青不同时期热处理后不同时间PccHE的相对表达量

2.3 催青不同时期热处理后的樗蚕卵孵化率

从催青不同时期热处理后不同时间PccHE的相对表达量(图2)和催青不同时期热处理后的樗蚕卵孵化率(图3)可以看出，不论是在催青第5天和第8天对樗蚕卵进行热处理1 h，均会瞬时改变樗蚕卵中孵化酶基因PccHE的表达量(图2)，但是对最终樗蚕卵的孵化率并没有明显影响，催青各时期热处理试验区和对照区樗蚕卵的孵化率间无显著性差异(图3)。

图3 催青不同时期热处理后的樗蚕卵孵化率

3 讨论

在之前的研究中，浦月霞等[11]成功从樗蚕卵中克隆到孵化酶基因PccHE全长cDNA序列，并对PccHE的表达特性进行了分析。分析发现PccHE的表达量在孵化时急剧升高的特性，表明该基因参与了樗蚕卵孵化的调控过程。本次试验，我们对胚胎发育不同时期的樗蚕卵进行热处理，在胚胎发育的早期(催青第2天)，该基因对热刺激没有响应(6 h内)，而在中期(催青第5天)与后期(催青第8天)均出现响应，在后期热处理后6 h内表达水平显著升高，表明PccHE的表达受到了热刺激的诱导，推测与其特异性表达特征有关，但经过热处理的蚕卵和对照区蚕卵在孵化率上并无显著性差异，推测热处理1 h并不会影响蚕卵整体的发育。