脊髓性肌萎缩症（SMA）基因筛查检测的临床应用研究

【摘要】目的：对广东省阳江地区育龄人群进行脊髓性肌萎缩症（SMA）基因筛查，分析本地区携带率，为临床提供科学的数据。方法：采用荧光定量PCR法，分别对SMN1基因第7和第8外显子的拷贝数进行相对定量检测，筛选出SMA携带者，进而筛选出高危夫妇，引导其进行产前诊断。结果：1115名受检者中，共检测出SMN1突变携带者18例（1.61%），其中SMN1基因第7外显子和第8外显子杂合缺失15例（1.35%），单纯SMN1基因第8外显子杂合缺失3例（0.27%）。结论：初步阐明阳江地区育龄人群SMA基因携带率，本研究的数据可为本地区开展遗传咨询和产前诊断提供参考资料。

【关键词】脊髓性肌萎缩症；运动神经元存活基因1；荧光定量PCR法；携带者筛查

基金项目：阳江市医疗卫生类科技计划项目《脊髓性萎缩症（SMA）基因筛查检测的临床应用研究》（SF2021089）

Clinical application study of genetic screening and testing for spinal muscular atrophy（SMA）

LIANG Weimin， LIU Qiuhua， XIE Wenguang， ZENG Zhaoshan， SITU Youfa， HE Xiaoyan Yangjiang Maternal and Child Health Hospital， Yangjiang， Guangdong 529500， China

【Abstract】Objective：To screen the gene of spinal muscular atrophy （SMA） in child-bearing population in Yangjiang，Guangdong，and to analyze the local carrier rate and provide scientific data for clinical practice.Methods：The copy numbers of exon 7 and exon 8 of SMN1 gene were relative quantitative detected by fluorescence quantitative PCR to screen out SMA carriers，then screen out high risk couples and guide them for prenatal diagnosis.Results：Among the 1115 subjects，18 cases （1.61%） were found to be carriers of SMN1 mutation，of which 15 cases （1.35%） were heterozygous deletion in exon 7 and exon 8 of SMN1 gene，and 3 cases （0.27%） were pure heterozygous deletion in exon 8 of SMN1 gene.Conclusion：The preliminary elucidation of the SMA gene carrier rate among the child-bearing population in Yangjiang area can provide reference materials for genetic counseling and prenatal diagnosis in this region.

【Key Words】SMA； SMN1； Fluorescence quantitative PCR； Carrier screening

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是因运动神经元存活基因1（SMN1）缺失/变异导致SMN蛋白缺乏致病的神经肌肉疾病，属于严重的常染色体隐性遗传疾病，具有很高的致死率。临床表现一般为进行性的肌肉无力和肌肉萎缩，并经常有消化、呼吸、营养、骨骼等多个系统的器官损害[1-2]。有研究表明：95%的SMA患者是因为SMN1基因第7外显子纯合缺失或第7和第8外显子同时出现纯合缺失致病；5%的患者是因为SMN1基因突变和点突变共同存在而患病[3-4]。对阳江地区育龄人群进行SMN1携带者基因筛查，筛选出高危夫妇进行产前诊断，是降低出生缺陷率的有效手段。

1 资料与方法

1.1 基本资料

收集2022年3月—2023年7月在阳江市妇幼保健院孕、产检的妇女及其丈夫外周血样1115例。所有受检者经过告知知情并签署了脊髓性肌萎缩症基因筛查检测知情同意书后抽取外周血2mL进行基因检测。所有流程符合阳江市妇幼保健院伦理委员会要求并获得批准。

1.2 方法

1.2.1 标本制备

取受测者EDTA-K2抗凝外周血各200μL用血液基因组DNA提取试剂盒（潮州凯普生物化学有限公司）提取DNA，采用德国的NanoDrop微量紫外分光光度计（Thermo）对提取的DNA进行浓度测定，用纯水按照倍数对DNA的浓度进行稀释，直至浓度变为10～20ng/μL。

1.2.2 荧光定量PCR

运动神经元存活基因1（SMN1）外显子缺失的检测试剂盒来自上海五色石医学科技有限公司。试剂盒借助MGB探针多重实时荧光定量PCR方法。被检测人的RPP40基因是内标基因，对SMN1基因E8（目的基因）、E7分别进行扩增，并对拷贝数进行定量检测。在操作时要严格按照流程进行，荧光定量PCR扩增仪选用上海宏石公司的SLAN-96S型号，对内标基因以及目的基因的信号进行 收集。

1.2.3 结果判断

对SMN1基因E7以及E8反应中存在的内标基因ΔCt值进行对比（ΔCt=Ct_FAM- Ct_VIC），将正常对照品在三个不同梯度的ΔCt平均值用ΔCt_a表示，用ΔCt_s表示待测样本值，用ΔΔCt=ΔCt_s-ΔCt_a对待测样本结果进行表示。有以下任意一项满足则代表检测人是缺失SMN1基因外显子：若ΔΔCt>0.8或者FAM无信号通道则是E7；若ΔΔCt>1.5或者FAM无信号通道则是E8。此外，还要满足以下几个条件才能对受检者的结果进行判定；正常对照组的内标CT值以及最小梯度目标基因值<28；正常对照品的三个梯度VIC通道信号以及FAM通道信号的线性相关系数都>0.95；受检者的样本内标基因内的CT值<28。

1.2.4 数据分析

采用上海五色石医学科技有限公司提供的SMA报告生成系统软件v2.5.0.0对实验结果进行分析，判断受检者SMN1基因第7、8外显子（E7、E8）缺失情况。

2 结果

2.1 筛查结果

1115名受检者中，共检测出脊髓性肌萎缩症SMN1突变携带者18例（1.61%），其中SMN1基因第7外显子和第8外显子杂合缺失15例（1.35%），单纯SMN1基因第8外显子杂合缺失3例（0.27%），见表1。

2.2 遗传咨询

检出15例孕妇携带者并引导其进行遗传咨询，其丈夫检测结果均未见突变，未进一步进行产前介入性诊断。

3 讨论

美国FDA于2016年12月批准在全球范围内上市首个对SMA有治疗效果的药物--美国Biogen Idec公司的Nusinersen，这一药品可以对儿童以及成人SMA患者进行治疗[5]。该药第一年需要用药6次，之后每年用药3次，一般家庭难以承受长期的经济负担和日常照顾护理。患者即使在后期接受了专业的修正治疗，遏制了运动神经元的凋亡情况，但是因为神经肌肉接头的功能并没有被改善，所以患者的运动功能恢复效果还是不明显[6]，患者需反复鞘内注射、终身用药[7]，患者依然要承受身体疾病和心理精神健康的双重压力。

SMA在治疗层面困难重重，但在预防层面上，致病基因明确。根据孟德尔遗传规律，可以推断出常染色体隐性遗传病携带者的父母之一为携带者、儿女和兄弟姐妹都有50%概率为携带者。为了保证筛查结果的准确性，本研究剔除携带者做家系分析的验证性数据，仅对1115名育龄夫妇进行筛查分析，其中发现15名孕妇为SMA携带者，携带率约为1.35%。查询比对，发现广东阳江地区SMA携带率仅比广西柳州市的1.24%[8]略高，低于茂名市的2.58%[9]、太原市的2.20%[10]、深圳市的2.09%[11]、云南省的2.03%[12]、江门市的2.34%[13]、江苏省的1.73%[14]和佛山市的1.48%[15]，各地区存在一定差异。夫妻双方为SMA携带者，生下SMA患儿概率为25%、携带者概率为50%和正常儿为25%。阳江地区筛查出15例孕妇为SMA携带者，经过遗传咨询，引导孕妇丈夫进行SMA基因筛查，结果均未发现突变，未进一步进行有创性产前诊断并告知受检夫妇可能存在的风险。考虑到筛查成本，本研究采用荧光定量PCR方法进行SMA携带者筛查。人群中很少有SMA携带者是因为SMN1突变以及SMN1“2+0”型基因突变所致（1+1D）[16]，由于方法缺陷性，本研究未能准确地筛查出这些携带者。本研究如果筛选出高危夫妇，最终还需使用MLPA方法进行疾病诊断与产前诊断。

综上所述，本文研究广东阳江地区SMA基因筛查检测的临床应用，通过筛查携带者，可将高风险的夫妻筛查出来并进行产前诊断，降低新生儿携带SMA的概率，可为本地区出生缺陷一、二级防控工作中预防措施、诊断、遗传咨询等提供科学的数据。

参考文献

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