高效液相色谱法与胶体金快速定量法测定玉米中呕吐毒素的对比

卢慧勇

摘要：使用高效液相色谱法与胶体金快速定量法分别检测28个玉米样品的呕吐毒素含量，比较发现两种方法的检测结果符合率达96.4%；通过在空白基质中加标分别使用两种方法检测对比两种方法检测的准确度均符合国标要求；与高效液相色谱法相比，胶体金快速定量法简单、快捷，定性相符率高，可以满足实验要求；当样本量比较大时，可用胶体金快速定量法作为初筛，再用高效液相色谱法进一步检测，可达到降本提效的目的。

关键词：玉米；呕吐毒素；高效液相；胶体金

中图分类号：TS210.7 文献标志码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240118

Comparison of high performance liquid chromatography and colloidal gold rapid quantitative method for the determination of vomitoxin in corn

Lu Huiyong

（ China grain storage （Shanxi） Quality Inspection Center Co.， LTD.， Taiyuan， Shanxi 030000 ）

Abstract： The content of vomitoxin in 28 corn samples was determined by high performance liquid chromatography （HPLC） and colloidal gold rapid quantitative method. The coincidence rate of the two methods was 96.4%. The accuracy of the two methods met the requirements of the national standard by adding marks to the blank matrix. Compared with high performance liquid chromatography （HPLC）， the colloidal gold rapid quantitative method is simple， fast， and has high qualitatively consistent rate， which can meet the experimental requirements. When the sample size is relatively large， the colloidal gold rapid quantitative method can be used as the primary screening， and then the high performance liquid chromatography can be used for further detection， which can achieve the purpose of reducing cost and improving efficiency.

Key words： corn； vomitoxin； high performance liquid phase； colloidal gold

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）又称呕吐毒素，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌组成，是F镰刀菌的二级代谢产物，广泛存在于粮食作物和加工品中[1-2]。呕吐毒素主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品。人畜摄入了被呕吐毒素污染的食物或饲料后，会导致厌食、呕吐、腹泻等急性中毒症状，严重时甚至会损害造血系统而造成死亡[3-4]。目前无法避免呕吐毒素污染粮食作物，而且其在研磨和加工过程中很难被降解，可能对人畜造成潜在的危害[5-6]。

粮食的呕吐毒素主要产生于田间种植、收货及储藏阶段，如田间种植阶段赤霉病流行，收获时遭遇阴雨天气造成的湿度过高，储藏阶段的温度和湿度管理不善均为导致呕吐毒素产生的因素。呕吐毒素的产生与菌株、温度、湿度、通风及日照等众多因素有关，其中以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为代表的真菌毒素受到社会的广泛关注，已成为粮食检测部门出入库检验、抽检普查的必检项目之一。

检测呕吐毒素的方法有很多种，而且高度灵敏的仪器方法和快速有效的免疫方法正逐步应用于呕吐毒素检测，包括呕吐毒素荧光定量快速检测法、呕吐毒素酶联免疫定量快速检测法、呕吐毒素胶体金定量定性快速检测法、呕吐毒素免疫亲和层析柱检测法[7-10]。比较经典且已经形成国家标准或行业标准予以实施的检测方法主要包括同位素稀释液相色谱-串联质谱法、免疫亲和层析净化高效液相色谱法、薄层色谱法、酶联免疫吸附筛查法、胶体金快速定量法。

目前，专门的检测实验室多采用GB 5009.111—2016《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》第二法：免疫亲和层析净化高效液相色谱法，粮库收购一线多采用LS/T 6113—2015《粮油检验 粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定 胶体金快速定量法》。为更好地服务基层粮库，本实验拟将两种方法作对比，考察二者在定性定量方面的符合性。

1 材料与方法

1.1 样品来源

扦取山西辖区库存玉米28份，涵盖不同品种、不同产地、不同收货年度、不同入库时间、不同仓房类型等可能对呕吐毒素在储存阶段产生影响的因素。

1.2 实验试剂

稀释缓冲液：CHARM；甲醇中脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品（100.7±3.2） μg/mL）：国家粮食与物资储备局科学研究院；甲醇（色谱纯）：天津科密欧实验试剂有限公司；纯净水（符合GB/T 6682中一级水的要求）：实验室自制。

1.3 实验仪器设备

Charm型真菌毒素定量检测系统（包含涡旋振荡器、离心机、孵育器、读数仪）：中检环贸生物技术（北京）有限公司；3310型盘式保水磨：瑞典波通仪器有限公司；VX-III型多管涡旋振荡器：安简（北京）科技有限公司；YP502N型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；Agilent 1260 II型液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；3100型锤式旋风磨：瑞典波通仪器有限公司；HX-01溶剂过滤器（带无油真空泵）：天津华鑫仪器有限公司；ZD-9624型摇床：常州易晨仪器制造有限公司；QL-866型涡旋振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；NDK-12W型水浴氮吹仪：上海皓庄仪器有限公司；Milli-Q direct8型纯水/超纯水一体化系统：南京金穗分析技术有限公司。

1.4 胶体金快速定量法

1.4.1 样品处理

将原始样品充分混匀，分取有代表性的样品500 g，除去杂质后，用盘式保水磨（出粉过20目筛）粉碎，充分混匀，用分样器缩分至200 g备用。准确称取10.00 g试样于100 mL离心管中，加入50.0 mL纯净水，旋紧离心管盖，涡旋振荡器上以2 000 r/min振荡1.5 min后取出，静置1～2 min后取1 000 μL上清液于1.5 mL离心管中， 4 000 r/min离心1 min。取离心后的上清液100 μL于另一个1.5 mL离心管中，加入1.0 mL稀释缓冲液，充分混匀待测。

1.4.2 检测方法

将孵育器预热到45 ℃后，放入检测条备用。准确移取300 μL待测溶液，加入检测条加样孔中，关闭加样孔，在孵育器中孵育5 min，取出检测条观察一条C线（质控线）和两条T线（检测线）显色情况。在确定质控线和检测线正常显色的情况下，选择读数仪的脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测频道并设定基质为00（MATRIX 00），将检测条塞入读数槽，开始样品测定，读数仪自动显示脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。为不影响检测结果，建议单个检测条在15 s内完成读数。

1.5 免疫亲和层析净化高效液相色谱法

1.5.1 样品处理

将原始样品充分混匀，分取有代表性的样品1 kg，用锤式旋风磨（出粉过30目筛）粉碎，再次充分混匀，用分样器缩分至200 g备用。准确称取25.00 g试样于250 mL具塞三角瓶中，加入100 mL纯净水，旋紧瓶塞，置于摇床上。将摇床调节至230 r/min，振荡20 min后静置1～2 min，先用中速定性滤纸过滤，再用玻璃纤维滤纸过滤。收集滤液2 mL过免疫亲和柱，保持每秒1～2滴的速度，直至空气进入亲和柱中，用水淋洗免疫亲和柱2次，每次10 mL，保持每秒1～2滴的速度，直至空气进入免疫亲和柱，弃去全部滤液，抽干免疫亲和柱，用2 mL甲醇洗脱免疫亲和柱，保持每秒1～2滴的速度。收集全部洗脱液至5 mL试管中，在50 ℃～60 ℃水浴中氮吹至近干，加入1.0 mL初始流动相甲醇—水（V甲醇∶V水=20∶80）定容，涡旋30 s溶解残留物，充分混匀后过0.22 μm滤膜，收集滤液于进样小瓶中以备进样。

1.5.2 色谱条件

色谱柱为C18柱长150 mm，内径4.6 mm，填料粒径5 μm；流动相：甲醇—水（V甲醇∶V水= 20∶80）；紫外检测器，检测波长218 nm；流速0.8 mL/min；进样体积50 μL；柱温35 ℃。

1.5.3 标准曲线制作

配置10.07 μg/mL的标准储备液：取购置的标准溶液（100.7 μg/mL，不确定度3.2 μg/mL）500 μL于5 mL容量瓶中，用初始流动相甲醇—水（V甲醇∶V水=20∶80）稀释并定容到5 mL，涡旋振荡10～15 s，充分混匀备用。

配置标准工作液：分别取10.07 μg/mL的标准储备液10、20、50、100、200、500 μL，用初始流动相甲醇—水（V甲醇∶V水=20∶80）稀释到1 mL，形成质量浓度为100.7、201.4、503.5、1 007、2 014、5 035 ng/mL的系列标准工作液，并按照1.5.2的色谱条件分别进样50 μL，上机检测。以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 定性分析

由表1可知，胶体金快速定量法与高效液相色谱法的定性相符率达96.4%，但胶体金快速定量法与高效液相色谱法相比，简单、快速，对人员能力要求低，可以达到快速定性的目的。

2.2 定量分析

2.2.1 假阳性样例定量分析

通过分别应用胶体金快速定量法与高效液相色谱法对28份玉米样品进行检测发现：在定量方面，胶体金快速定量法出现1例假阳性，占样品总量的5.6%；此例样品两种方法的差值为241 μg/kg，两种方法的平均值为980 μg/kg，两种方法的差值占平均值的24.6%。考虑到此例样品恰好处于国家标准限量临界值附近和真菌毒素快速检测仪器自身定量误差20%（厂家提供），而且样品总量有限，因此，对于假阳性的出现，是偶然现象，还是方法本身存在的问题，还需要加大样本量，增加阳性样品，做进一步研究。

2.2.2 两种方法定量比较

通过分析两种方法定量差值占平均值的比例，确定两种方法定量的偏差（参考脱氧雪腐镰刀菌烯醇国标检测方法中对双实验差的要求：双实验差大于平均值的23%的情况超过5%）。两种方法定量比较详见表1。

对于样品1、2、12、18的定量偏差均超过50%，4个样品的共同点是均有一种方法的定量值低于或接近国标的定量限（200 μg/kg），其余样品的定量偏差未见明显异常。对于是否国标定量限以上，胶体金快速定量方法与高效液相色谱法相比，定量接近，需要加大样本量，进一步研究；是否国标方法定量限以下，胶体金快速定量方法不能准确定量，且与高效液相色谱法定量值相差较大，需要加大样本量，进一步研究。

2.3 准确度分析

通过在玉米粉基质中添加量为200、1 000、2 000 μg/kg的呕吐毒素标准溶液，每个水平含量做3个平行实验，测定含量平均值与真值相对偏差见表2、表3。

按照GB/T 27404—2008附录F的要求，真值在10～10 000 μg/kg时，相对标准偏差范围在-20%～10%，根据表2和表3分析，高效液相色谱法和胶体金快速定量法测定结果的标准偏差均处于国标要求的范围内，符合准确度要求。

3 讨 论

（1） 胶体金快速定量法是呕吐毒素最简便的检测方法，检测不需要配套仪器，样品处理简单，5～10 min就可以看到检测结果。可以根据质控线（G线）、检测线（T线），初步确定所测样本呕吐毒素含量范围，能给出具体数值，但是结果准确性不够，容易产生假阳性和假阴性，价格最低，可作为粗略判断方法。高效液相色谱方法是以免疫亲和柱为分离手段的色谱法，用高效液相色谱仪作为检测工具的分析方法。该项技术灵敏度高，测定范围广泛，采用单克隆免疫技术，可以特效性地将呕吐毒素和其他真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高，正确性和可靠性强，有国标支持。但检测成本高，仪器维护成本高。一般作为检测机构终端判定方法，也有大型企业作为产品质量卫生指标控制方法。

（2） 高效液相色谱法灵敏度高，检测时间长，对实验条件有要求，试剂纯度要求高，实验耗材和仪器维护所需成本高，适用于检测机构出具报告或者在结果存在争议时作为仲裁方法。在日常粮油检验中，本着把好出入库关的原则，建议在入库验收和出库检测中优先使用高效液相色谱法。

（3） 胶体金快速定量法在进行测定样品时无需大型仪器，对实验条件要求低，无需接触标准品（阳性），方法简便快捷，适用于基层粮库出入库筛查。与高效液相色谱方法比较，可以在按照要求逐车检验的同时，有效地降低检验成本。

（4） 通过对28份玉米样品的呕吐毒素进行高效液相色谱法和胶体金快速定量法的检测，其实验结果显示：在定性方面，两种方法的符合率达 96.4%；在定量方面，胶体金快速定量法出现一例假阳性，占样品总量的3.6%。关于两种方法定量值的比较，需要加大样本量，进一步研究。

（5） 在实际工作中，应结合实际情况灵活运用两种方法，特别是在大型普查时，样本量比较大，可用胶体金快速定量法作为初筛，再用高效液相色谱法进一步检测，可达到降本提效的目的。

参 考 文 献

[1] 杜政，唐瑞明.粮食中真菌毒素标准法规与检验[M].长沙：湖南科学技术出版社，2013：5-6.

[2] 许烨.免疫亲和净化高效液相色谱法测定粮食中镰刀菌毒素分析方法的研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2006：5.

[3] 万小乐.高效液相色谱法测定粮食中呕吐毒素的方法研究[J].粮食加工，2016，41（4）：74-76.

[4] 徐冰涛，张勇，崔朝霞.呕吐毒素生物降解的研究进展[J].饲料研究，2022，45（17）：128-133.

[5] 谭洪波，牟沿华.白城市新收获玉米真菌毒素污染状况分析[J].粮食科技与经济，2023，48（1）：87-89.

[6] 于金旺，刘志斌，崔建，等.小麦中呕吐毒素的成因及危害[J].粮食科技与经济，2019，44（9）：81-82.

[7] 谢婷婷.呕吐毒素胶体金三线定量检测条性能研究[J].粮食科技与经济，2017，42（5）：32-34.

[8] 孙安权，MIKAELLAN K，PHILLIPS T D.霉菌毒素研究新进展[J].养殖与饲料，2006（10）：40-45.

[9] 刘绍伟，罗仕欢.浅谈霉菌呕吐毒素[J].湖南饲料，2006（2）：26-27+34.

[10] 袁克，龚燕，王俊双，等.金标试纸法和酶联免疫法检测呕吐毒素的对比研究[J].安徽农业科学，2007，35（18）：5341+5360.