莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）ZLX10对发酵雪茄烟叶中性致香成分的影响

赵晓超 李林林 施友志 张贝贝 周亚彬 禹言 张静亚 瞿欢 普倩 黄友谊 潘勇

摘要：为探究烟草源微生物单菌发酵对雪茄烟叶挥发性致香成分的影响，采用GC-MS检测莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）ZLX10发酵雪茄烟叶中性致香成分，筛选差异致香成分，并与感官评价进行相关性分析，结合ROAV值变化，明确ZLX10提升雪茄烟叶感官品质的关键致香成分。结果表明， ZLX10发酵雪茄烟叶后，香气总量和大多数中性致香成分含量均显著提高，共筛选得到15种差异中性致香成分，共有10种致香成分显著上调（P<0.05），其中巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮、茄酮和植物醇与烟叶香气呈显著正相关（P<0.05），可认为是增加烟叶干香和花香的关键差异致香成分；共有5种致香成分显著下调（P<0.05），其中苯乙醛和2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚与烟叶刺激性呈显著正相关（P<0.05），对烟叶香气有较大的负面影响。由此可知，ZLX10发酵能促进雪茄烟叶香气质和香气量得到提升，这为人工接菌发酵雪茄烟叶提供了基础。

关键词：雪茄烟叶；莫海威芽孢杆菌；烟叶发酵；中性致香成分

中图分类号：S572         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）06-0173-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.028 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Bacillus mojavensis ZLX10 on the neutral aroma components of

fermented cigar tobacco leaves

ZHAO Xiao-chao1， LI Lin-lin1， SHI You-zhi1， ZHANG Bei-bei2a， ZHOU Ya-bin2a， YU Yan2a，

ZHANG Jing-ya2a， QU Huan2a， PU Qian2b， HUANG You-yi2b， PAN Yong1

（1. China Tobacco Hubei Industrial Co.， Ltd.， Wuhan  430040， China；2a. College of Life Science and Technology； 2b. College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University，Wuhan  430070， China）

Abstract：To investigate the effect of mono-bacterial fermentation of tobacco-derived microorganisms on volatile aroma components of cigar tobacco leaves， the neutral aroma components of cigar tobacco leaves fermented by Bacillus mojavensis ZLX10 were detected by GC-MS， the differential neutral aroma components were screened， and the correlation analysis was done with the sensory scores. Combined  with the change of ROAV value， the key aroma components to improve the sensory quality of cigar tobacco leaves by ZLX10 were identified. The results showed that after ZLX10 fermented cigar tobacco leaves， the total aroma and the contents of most neutral aroma components obviously increased. A total of 15 differential neutral aroma components were screened， and a total of 10 aroma components were significantly increased （P<0.05）. Among them， megastigmatrienone A， megastigmatrienone B， 6-methyl-5-hepten-2-one， 2，6，6-trimethyl-2-cyclohexene-1，4-dione， solanone and phytoalcohol were significantly positively correlated with the aroma of cigar tobacco leaves （P<0.05）， which could be considered as the key differential aroma components to increase the dry aroma and floral aroma of cigar tobacco leaves. Five aroma components significantly decreased （P<0.05）， among which phenylacetaldehyde and 2，4-di-tert-butyl-6-nitrophenol were significantly positively correlated with cigar irritability （P<0.05）， and had a greater negative impact on the aroma of tobacco leaves. It could be seen that ZLX10 fermentation could promote the quality and quantity of cigar tobacco leaves aroma， which provided a basis for the fermentation of cigar tobacco leaves by artificial inoculation.

Key words： cigar tobacco leaves； Bacillus mojavensis； tobacco fermentation； neutral aroma components

雪茄烟是最古老的传统烟草产品之一［1］，经过发酵后的雪茄烟叶香气更加浓郁、刺激性降低、烟香特征更加显露［2］。雪茄烟叶发酵的方法一般分为人工发酵和自然发酵，通过人工添加有益微生物可以有效缩短发酵时间、降低成本。已有研究表明，微生物能够改善烟叶香气，其中芽孢杆菌（Bacillus）和小球菌（Pediococcus）效果尤为突出［3］。李宁等［4］将一株蜡样芽孢杆菌接种于雪茄烟叶发酵，发现该菌增香提质作用明显。薛磊等［5］将一株可降解β-胡萝卜素的芽孢杆菌YN14接种于烟丝表面发酵，烟丝香气质、香气量等感官品质均得到改善。罗家基等［6］将从烟叶中筛选出的优势芽孢杆菌随机混合用于烟叶发酵，发现发酵后烟叶烟香更加明显。帅瑶等［7］使用解淀粉芽孢杆菌发酵烟叶，在缩短发酵时间的同时显著提升了烟叶感官质量。黄晓春［8］利用一株具有降烟碱的节杆菌发酵烟叶后烟叶香气量提高、香气质改善、刺激性减弱。李勇等［9］将一株从红大烟叶表面筛选到的出芽短梗霉菌用于发酵烟叶，有效降低烟叶杂气和减少刺激性。黄申等［10］将一株嗜麦芽窄食单胞菌接种于新鲜烟叶后茄酮含量有效提升2倍，香气品质大大提升。多项研究表明，接种微生物发酵烟叶是改善烟叶品质的重要方式。研究表明，莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）亲缘关系密切，区别仅在于全细胞脂肪酸组成和DNA序列的差异等［11］。当前莫海威芽孢杆菌主要被广泛报道于多种植物真菌病害的防治，其对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、马铃薯坏疽病菌Phoma foveata、褐腐病菌Stysanus stemonitis、干腐病菌Fusarium oxysporum和早疫病菌Alternaria solani等多种病原菌均有较好的抑制效果［12，13］。此外，莫海威芽孢杆菌还具有高产蛋白酶和淀粉酶特性，将其用于山西老陈醋发酵，可明显提高风味品质［14-16］。目前尚未见将莫海威芽孢杆菌用于烟叶发酵的报道，为此，将从进口雪茄烟支中筛选到的一株莫海威芽孢杆菌ZLX10接种发酵雪茄烟叶，探究其对雪茄烟叶中性致香成分的影响，为人工接种发酵雪茄烟叶提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟叶：原料由湖北中烟工业有限责任公司提供，品种：Criollo 98，叶位：上二棚；供试菌株：分离自古巴产罗密欧朱丽叶短身丘吉尔雪茄烟支的莫海威芽孢杆菌ZLX10菌株。培养基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，琼脂粉20.0 g/L，pH 7.0～7.2。乙酸苯乙酯（98%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；C7-C40正构烷烃混标为色谱纯（BR），购于上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种制备 将ZLX10菌株接种至牛肉膏液体培养基，于37 ℃、180 r/min振荡培养12 h。菌液以4 000 r/min离心5 min，收集菌体。菌体用无菌水清洗2次，无菌水重悬得菌液，菌剂浓度调为5.0×108 CFU/mL备用。

1.2.2 发酵雪茄烟叶 挑取完整片状雪茄烟叶原料，每份40 g。将ZLX10菌液直接均匀喷洒至雪茄烟叶表面，至接种量为1.0×108 CFU/g烟叶。喷洒无菌水，使雪茄烟叶含水率为40%，参照文献［17］所述方法进行水分测定。将接种后的雪茄烟叶装于无菌袋中，密封，于37 ℃恒温发酵15 d，取出发酵雪茄烟叶进行分析。对照组（CK）雪茄烟叶不添加菌，仅添加无菌水至含水率为40%，置于同样条件发酵15 d。每组设置3个重复。

1.2.3 中性致香成分提取与测定 雪茄烟叶中性致香成分用水蒸气蒸馏-二氯甲烷溶剂萃取法测定［18］。发酵好的雪茄烟叶先剪切，后用植物粉碎机粉碎，过孔径0.425 mm筛，低温保存备用。在1 000 mL圆底烧瓶中加入5.0 g烟样、0.5 g 柠檬酸、500 mL去离子水和50 μL乙酸苯乙酯（浓度2.23 μg/μL），使用恒温电热套进行加热；装置的另一端接盛有40 mL二氯甲烷的250 mL圆底烧瓶，该端烧瓶置于恒温水浴锅中加热，水浴温度为60 ℃。同时蒸馏萃取2.5 h，萃取完成后，加入过量无水硫酸钠干燥有机相，将有机相转移到茄形瓶，使用旋转蒸发仪浓缩至约1 mL，即得烟叶精油。将烟叶精油转移至2 mL棕色气相瓶中，用于GC-MS分析。

色谱柱：TG-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。载气He，流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃，传输线温度280 ℃。离子源温度177 ℃。升温程序：初始温度60 ℃保留2 min，然后以2 ℃/min的升温速度升至230 ℃，保留15 min，分流比10∶1，进样量为2 μL，电离能70 eV，电离方式EI。质量数范围35～500 amu，溶剂延迟6 min。

由GC-MS得出正构烷烃标样C7-C40和发酵样品中各香气成分色谱峰的保留时间（RT），计算物质的保留指数，经计算机通过NIST谱库进行检索匹配，以匹配值>600，保留指数误差不超过15为鉴定标准，结合数据库中的匹配度进行定性挥发物的含量计算公式如下。

含量=[内标含量×目标物质的峰面积/内标的峰面积烟叶含量]   （1）

1.2.4 发酵后的雪茄茄芯烟叶感官评析 将发酵好的雪茄烟叶由6名评审专家进行感官评析，评价指标包括烟叶香气、刺激性、色泽，各指标按档次分别赋予不同分值，满分依次为15、15、10分（表1）。

1.3 数据处理

所有鉴定出的中性致香成分利用TBtools（version 1.0682）进行可视化转换。利用|log2FC|>1和独立t检验中P<0.05筛选出显著变化的物质作为差异代谢物并作火山图。烟叶香气、刺激性与色泽得分与差异中性致香成分之间采用皮尔逊相关性方法分析（Pearson correlation coefficient）［19］，通过SPSS 23计算，利用TBtools（version 1.0682）进行可视化。关键中性致香成分采用相对香气活力值（Relative odor activity value，ROAV）进行比较，阈值查询采用文献［20］提供的空气介质觉察阈值，优先使用最新年份的阈值数据。一般认为ROAV≥1的组分为关键香气成分，0.1≤ROAV<1的组分为修饰香气成分［21］。

2 结果与分析

2.1 莫海威芽孢杆菌ZLX10发酵的雪茄烟叶中性致香成分

为了解莫海威芽孢杆菌ZLX10对雪茄烟叶香气品质的影响，采用GC-MS检测接种ZLX10发酵后雪茄烟叶中性致香成分。基于正构烷烃（C7-C40）混合标准的保留指数，共检测出43种中性致香成分，根据结构可以分为烯烃类、酮类、醇类、酯类、醛类和酚类六大类（表2）。各类中性致香成分占比如图1所示，不同处理雪茄烟叶各类中性致香成分占比均以烯烃类、酮类和醇类致香成分为主，其中烯烃类和醇类致香成分经ZLX10发酵后占比增加最明显，分别增加7.06个百分点和5.78个百分点。经ZLX10发酵后与对照相比，各类中性致香成分的香气量及种类有一定改变（表2），对致香成分相对含量进行Z-score归一化处理并绘制聚类热图如图2所示。雪茄烟叶中性致香成分总量由1 104.18 μg/g提高至1 606.62 μg/g，提升45.50%；中性致香成分的种类均为39种，但具体种类发生改变；中性致香成分含量增加的种类主要是烯烃类、酮类、醇类和酚类，分别由295.95、293.76、233.33、33.10 μg/g增加至543.94、401.36、427.95、67.99 μg/g，分别增加83.8%、36.6%、85.8%和105.4%。含量增加的烯烃类主要包括正十五烷、新植二烯、正二十五烷和正二十七烷，分别从5.45、143.30、22.64、116.18 μg/g增加至30.27、301.59、33.83、171.87 μg/g。含量增加的酮类共10种，包括香叶基丙酮、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮、茄酮、β-大马酮、巨豆三烯酮A和巨豆三烯酮B等与香气质有较大正面影响的物质［22］，分别增加15.0%、34.8%、76.8%、12.5%、175.8%和253.3%。醇类含量增加的共有7种，包括（S）-氧化芳樟醇、2，6-二甲基环己醇、反-橙花叔醇、异植醇、香叶基芳樟醇、2，7，11-西柏三烯-4-醇和植物醇；植物醇含量从176.08 μg/g提高至340.93 μg/g，是含量最高的醇类成分。酯类和醛类的总量分别减少14.9%和85.8%，减少的成分包括（R）-二氢猕猴桃内酯、苯乙醛、2，6，10-三甲基-9-烯-十一醛、3-（2，6，6-三甲基-1-环己烯基）-2-丙烯醛和十五烷醛。此外，经ZLX10发酵后中性致香成分种类增加了酮类6-甲基-5-庚烯-2-酮、醇类（S）-氧化芳樟醇和香叶基芳樟醇、酯类4，8，12，16-四甲基十七烷-4-内酯，而存在对照中的2，6二甲基壬烷、苯乙醛、（R）-二氢猕猴桃内酯和2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚则未检出。从以上可知，经ZLX10发酵后雪茄香气总量及多种致香成分的含量呈增加趋势，主要为烯烃类、酮类、醇类和酚类，包括2种叶绿素降解物新植二烯和植物醇，西柏烷类降解物茄酮，7种类胡萝卜素降解物6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮、β-大马酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、香叶基丙酮、金合欢基丙酮；减少的成分主要为酯类和醛类，包括苯丙氨酸降解物苯乙醛，类胡萝卜素降解物（R）-二氢猕猴桃内酯。

2.2 莫海威芽孢杆菌ZLX10发酵雪茄烟叶中差异中性致香成分

差异致香成分的筛选能够更加明确莫海威芽孢杆菌ZLX10发酵对雪茄烟叶中性致香成分的影响，为此根据发酵后致香成分的含量，通过倍数变化分析（Fold change，FC）和独立样本t检验，以|log2FC|>1和P<0.05为标准筛选差异致香成分，分析了ZLX10发酵后雪茄烟叶中具有显著变化的致香成分，结果如图3所示。共筛选出15种差异中性致香成分，显著上调（P<0.05）的有10种，包括酮类的巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮、茄酮，醇类的（S）-氧化芳樟醇、香叶基芳樟醇、植物醇，烯烃类的新植二烯，酯类的4，8，12，16-四甲基十七烷-4-内酯；显著下调（P<0.05）有5种成分，包括2，6二甲基壬烷、 （R）-二氢猕猴桃内酯、苯乙醛、3-（2，6，6-三甲基-1-环己烯基）-2-丙烯醛和2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚。差异致香成分以酮类、醇类为主，这与之前的研究类似［23，24］。

2.3 莫海威芽孢杆菌ZLX10发酵雪茄烟叶关键差异中性致香成分

对发酵雪茄烟叶香气、刺激性、色泽进行感官评析，结果如表3所示。与对照组相比，经ZLX10发酵后烟叶香气、色泽得分提高，刺激性减少，总体得分高于未接菌雪茄烟叶，说明ZLX10发酵后雪茄烟叶的整体品质有所提升。中性致香成分含量与烟叶感官品质关系密切，为明晰ZLX10发酵雪茄烟叶差异致香成分与烟叶品质的相关性，采用皮尔逊相关性系数分析差异中性致香成分与烟叶色泽、香气、刺激性评分之间的相关性并作热图，结果如图4所示。共有11种差异致香成分与香气呈正相关，其中巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、茄酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮、植物醇和新植二烯达显著正相关（P<0.05）。另一方面，共有5种成分与刺激性呈正相关，其中苯乙醛和2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚达显著正相关（P<0.05）。从两种处理雪茄烟叶中性致香成分与感官评分相关性明显可知，巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、植物醇、茄酮、新植二烯、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮可认为是ZLX10发酵雪茄烟叶后的关键差异中性致香成分，这些关键差异致香成分的增加对改善烟叶香气发挥了重要的作用。

为确定雪茄烟叶中性致香成分对整体的香气贡献，根据相对定量结果和各致香成分阈值计算了ROAV值，结果如表4所示。未接菌发酵样共鉴定出12种ROAV值大于1的致香物质，包括酮类5种（异佛尔酮、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮、香叶基丙酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B），醇类3种（芳樟醇、反-橙花叔醇、植物醇），酯类2种（（R）-二氢猕猴桃内酯、邻苯二甲酸二丁酯），醛类1种（苯乙醛），酚类1种（2，4-二叔丁基苯酚）。其中2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮（100.000）、巨豆三烯酮A（42.156）和香叶基丙酮（40.533）贡献最大，ROAV均大于40，被认为对未接菌雪茄烟叶香气具有重要贡献；其次是苯乙醛（38.376）、巨豆三烯酮B（30.111）、反-橙花叔醇（20.510）、植物醇（15.559）、（R）-二氢猕猴桃内酯（13.404）和异佛尔酮（15.685），其ROAV均大于10，同样对雪茄烟叶香气具有重要贡献。而ZLX10发酵烟叶中共有11种ROAV值大于1的致香物质，包括酮类6种（异佛尔酮、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮、茄酮、香叶基丙酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B），醇类3种（芳樟醇、反-橙花叔醇、植物醇），酯类1种（邻苯二甲酸二丁酯），酚类1种（2，4-二叔丁基苯酚）。其中2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮（100.000）、巨豆三烯酮A（85.977）和巨豆三烯酮B（79.189）贡献最大，ROAV均大于40，被认为对ZLX10发酵茄芯烟叶香气具有重要贡献；其次是香叶基丙酮（37.570）、反-橙花叔醇（19.017）、植物醇（22.858）和异佛尔酮（11.540），其ROAV均大于10。从以上可知，经过ZLX10发酵雪茄烟叶后，具有干果香和花香的致香成分贡献增大，而具有清凉感和樟脑气味的致香成分贡献减少，关键差异中性致香成分中巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、植物醇、茄酮、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮对雪茄烟叶香气品质的贡献增大，可增加雪茄烟叶的干果香、花香香韵，进一步阐明了ZLX10发酵后关键差异致香成分的重要性。

3 讨论与结论

酮类中性致香成分对烟叶品质具有重要作用［25］，接种莫海威芽孢杆菌ZLX10后增加的酮类中茄酮有新鲜胡萝卜香气，可使烟气醇和、增加甜润感、香气丰满细腻、掩盖杂气、降低刺激性［26，27］；香叶基丙酮、β-大马酮具有玫瑰特征香气，能减少刺激性，是增加卷烟清甜香的关键成分，广泛应用于卷烟加香［28，29］；2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮具有干草香，可作为烟用香精［30，31］；巨豆三烯酮类具有烟草香和辛香底韵，可使烟气和顺、有效改善侧流烟气并增加舒适度，还可增加烟叶中的花香和木香特征，是烟草中重要的香气成分，其含量的增加对烟叶香味品质提升具有重要作用［28，32，33］；6-甲基-5-庚烯-2-酮能增加雪茄烟花果香韵［34］。增加的醇类中香叶基芳樟醇和植物醇具有花香和木香香调［35］，能增加雪茄花香风味；反-橙花叔醇的风味特征以清香、花果香为主［36］。由以上可知，ZLX10发酵雪茄烟叶提高的致香成分多具有烟草干香、花果香等特征，研究表明莫海威芽孢杆菌具有蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶等多种碳水化合物活性酶，而淀粉酶可将淀粉水解成小分子还原糖，糖类成分又与氨基酸缩合生成烟叶香气前体物，提升烟叶香气品质［37］。在多种酶促作用下，烟叶中的大分子物质如蛋白质、β-胡萝卜素、叶绿素和西柏烷发生降解生成香味物质进而提升烟叶香气品质［24］。

使用进口雪茄烟支优势菌ZLX10发酵与未接菌发酵雪茄烟叶处理相比，共筛选得到15种差异致香成分，其中10种呈显著上调趋势，同时与雪茄烟叶香气呈正相关，其中巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、茄酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮、植物醇和新植二烯达显著正相关（P<0.05）。于建军等［31］采用多元统计典型相关分析烟叶各类中性致香成分与香气关系结果表明巨豆三烯酮A对香气影响最大，并表现为显著的正相关；2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4-二酮是影响香气量的主要成分，且与香气呈正相关［31，38］；类西柏烷类降解产物茄酮对香气质有较大的正面影响［39］；姜慧娟等［40］对中性致香物质与烟叶香气质量关系研究表明，6-甲基-5-庚烯-2-酮对香气质的正面影响最大；新植二烯是烟草中性挥发物中含量最高的成分，也是烟叶主要致香成分的前体［41］，其本身不具香气或香气较弱，但对香气质、柔细度、透发性等影响较大，可作为捕集烟气气溶胶中香气的载体，具有携带烟叶中挥发性香气物质进入烟气的能力［42，43］，本研究与前人研究一致。共有2种中性致香成分与雪茄烟叶香气呈显著负相关（P<0.05），分别为苯乙醛和2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚。苯乙醛具有花香，可增加烟叶的清甜香和青香，但是和焦甜香和焦香香韵呈显著负相关［44］，而在本研究中苯乙醛含量的减少并未导致雪茄烟叶香气削减，这可能与烟叶中其他致香成分的增加有关，更加说明烟叶香气品质的提升是多种致香成分共同协调的结果，单一物质含量的增减对烟叶香气影响有限；2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚常见于酒类饮品挥发性物质中［45-47］，但目前并未见其与感官品质相关性的研究，本研究结果表明其与雪茄烟叶刺激性呈显著正相关（P<0.05），对烟叶香气存在较大的负面影响， ZLX10发酵后未检测到2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚，该成分的消减可能对烟叶香气起到了积极的作用。此外，显著降低的香气成分中，未检测到类胡萝卜素降解产物（R）-二氢猕猴桃内酯，推测ZLX10可能抑制了相关降解途径。

本研究通过接种进口雪茄优势菌ZLX10，提升雪茄烟叶感官品质，结果表明处理后的烟叶香气量及丰富性增加，干香和花香增加，刺激性减少，莫海威芽孢杆菌（Bacillus  mojavensis）ZLX10有望成为提升雪茄烟叶品质的优良菌种。

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