鸡新城疫抗体消长规律及血清抗体稳定性

蒋玲艳 王林果 张在 于乐 秦张善

摘要：为研究鸡新城疫灭活疫苗免疫后抗体消长规律及血清抗体稳定性，采用血凝抑制试验方法测定新城疫病毒-禽流感病毒（H9亚型）二联灭活疫苗免疫鸡血清新城疫抗体效价及经室温、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃反复冻融和加热等不同方式处理的血清中新城疫抗体效价。结果表明，试验鸡于1日龄和21日龄用灭活疫苗免疫两次后，在第二次免疫后14 d新城疫抗体平均效价达到8.1 log2，35 d达到最高值为8.9 log2；免疫后70 d抗体效价保持在7.8 log2，且自二免后14～70 d，新城疫抗体效价维持在7.8 log2～8.9 log2。血清新城疫抗体在室温和4 ℃相对稳定，室温下放置13 d对新城疫抗体效价几乎无影响；但4 ℃保存9 d，对新城疫抗体效价有一定影响，且差异显著（P<0.05）；56 ℃下30 min对新城疫抗体效价无影响；反复冻融3次对新城疫抗体效价影响极显著（P<0.01）。肉鸡于1日龄和21日龄用灭活疫苗免疫两次后，新城疫抗体水平高，且高水平抗体维持时间长。鸡血清新城疫抗体可耐56 ℃加热，室温保存活性稳定，反复冻融则影响其效价。

关键词：鸡新城疫；HI试验；抗体效价；灭活疫苗；抗体稳定性；血清保存

中图分类号：S831.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）06-0137-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.022 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Regularity of antibody fluctuation of Newcastle disease and serum antibody stability

JIANG Ling-yan1， WANG Lin-guo2， ZHANG Zai1， YU Le1， QIN Zhang-shan1

（1.College of Animal Science and Technology， Guangxi Vocational University of Agriculture， Nanning  530007， China；

2. PuLike Bio-Engineering Co.， LTD.， Luoyang  471000， Henan， China）

Abstract： In order to study the rule of antibody fluctuation and stability of Newcastle disease antibody activity in serum after immunization with inactivated Newcastle disease vaccine， the hemagglutination inhibition test was used to determine the titers of Newcastle disease antibody in serum of chickens immunized with Newcastle disease virus and avian influenza virus （H9 subtype） dual inactivated vaccine. The titers of Newcastle disease antibody in serum treated by different methods such as room temperature， 4 ℃ storage，      -20 ℃， -80 ℃ freeze-thaw and heating were determined. The results showed that the average titer of Newcastle disease antibody reached 8.1 log2 at 14 d and 8.9 log2 at 35 d after the second immunization. The antibody titer remained 7.8 log2 at 70 d after immunization， and the antibody titer was 7.8 log2 to 8.9 log2 from 14 d to 70 d after the second immunization. The serum Newcastle disease antibody was relatively stable at room temperature and 4 ℃， and the titer of Newcastle disease antibody was almost not affected by room temperature for 13 days. However， the titer of Newcastle disease antibody was affected by 4 ℃ for 9 days， and the difference was significant （P<0.05）. The titer of Newcastle disease antibody was not affected by 56 ℃ for 30 min. Repeated freeze-thaw for three times had a significant effect on the antibody titer of Newcastle disease （P<0.01）. The results showed that the level of Newcastle disease antibody was high and the maintenance time of the high level of Newcastle disease antibody was long after the broilers were immunized with inactivated vaccine twice at 1 and 21 days of age. Newcastle disease antibody of chicken blood could resist heating at 56 ℃， and its activity was stable at room temperature. Repeated freezing and thawing could affect its titer.

Key words： Newcastle disease； hemagglutination inhibition test； antibody titer； inactivated vaccine； antibody stability； preservation of serum

鸡新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的严重威胁养鸡生产的主要疫病。鸡新城疫抗体（Newcastle disease antibody，ND Ab）水平的检测既是鸡场ND免疫效果监测和制定ND免疫方案的主要参考依据，也是临床NDV感染诊断的辅助手段［1］。血清是临床鸡ND抗体水平检测最常见的送检样品。送检血清样品的保存方法、保存时间和运输方式直接影响样品质量及检测结果。因此，送检样品的保存方法、保存时间和运送方式是检测人员十分重视的问题。

鸡ND母源抗体的消长规律已有不少研究报道［2，3］，而鸡ND灭活疫苗免疫后抗体消长因饲养方式、品种、疫苗类型和免疫方案不同而具有显著差异。掌握针对鸡品种、饲养方式的新城疫免疫后抗体消长规律，对于制定科学的ND免疫方案尤为重要。本研究结合慢速型肉鸡生产实际需要，采用血凝抑制（HI）试验，对雏鸡新城疫-禽流感二联灭活疫苗免疫后血清中ND Ab的消长规律及鸡血清中ND Ab活性的稳定性进行研究，可为养鸡生产中科学合理地制定ND的免疫防控方案及ND Ab检测中选择送检血清样品的保存与运输方式提供参考，也可为抗体结构分析、相关功能的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

1日龄健康肉雏鸡（麻黄土鸡）105只，购自广西富凤农牧集团，采用笼养方式饲养在广西农业职业技术大学动物养殖场。

1.2 疫苗和试剂

新城疫病毒（LaSota株）-禽流感病毒（H9亚型）二联灭活疫苗（批号为160022133），购自普莱柯生物工程有限公司；新城疫血凝抑制试验用抗原、阳性血清与阴性血清（批号为154028082），购自青岛立见生物科技有限公司。

1.3 免疫

105只1日龄肉雏鸡苗，随机选取5只测定母源抗体；其余100只肉雏鸡颈部皮下接种新城疫病毒（LaSota株）-禽流感病毒（H9亚型）二联灭活疫苗0.3 mL/只。21日龄时用同样方式第二次接种新城疫病毒（LaSota株）-禽流感病毒（H9亚型）二联灭活疫苗0.5 mL/只。

1.4 血清分离

二免后3周开始，每周固定时间随机采集21只鸡翅静脉血，待血液凝固后收集血清，于3 000 r/min离心5 min，取上清液保存，用于ND Ab效价测定，连续测定9周。1日龄雏鸡通过颈静脉收集血清。

1.5 ND Ab效价测定

ND Ab效价采用血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）进行测定，按照国家标准《新城疫诊断技术》（GB/T16550—2020）执行。记录测定数据，计算HI（log2）结果平均值。抗体活性稳定性试验：取HI测定为ND Ab阳性且HI效价为10log2血清样品5个，用2 mL离心管分装，进行ND Ab稳定性试验。设置室温放置、4 ℃存放、-20 ℃反复冻融、-80 ℃反复冻融和56、65、72 ℃加热等不同条件处理血清，然后用HI试验测定ND Ab效价。

1.6 数据处理

鸡ND Ab效价HI测定值采用Excel 表格整理，采用GraphPad Prism 6.01软件进行统计分析，结果以HI（log2）平均值±标准差表示，差异显著性分析采用t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 雏鸡母源抗体效价的测定结果

随机取1日龄雏鸡5只，颈静脉放血收集血清后，HI试验测定ND母源抗体效价，结果分别为       2 log2、3 log2、4 log2、4 log2、6 log2，平均效价为3.8 log2。

2.2 鸡灭活疫苗免疫后ND Ab效价的测定结果

二免后，分别于14、21、28、35、42、49、56、63、70 d随机采集21只鸡静脉血，采用HI测定ND Ab效价，并计算HI（log2）平均值。结果表明，二免后14 d 鸡35日龄时，鸡ND Ab效价HI测定平均值达到8.1 log2，二免后35 d左右达到最高水平8.9 log2，二免后70 d时ND Ab效价HI测定平均值仍保持在7.8 log2（表1）。但在91 d的试验期，并未发现新城疫灭活疫苗免疫后抗体消长的规律，随日龄的增加，ND Ab效价表现出一定的无规则波动性。二免后14 d时有9.5%（2/21）的个体ND Ab效价低于保护临界值4 log2，随后每周检测鸡的ND Ab效价HI测定值均分布在5 log2～10 log2，新城疫个体免疫合格率和群体免疫合格率均达到100%。鸡ND免疫后抗体消长规律及个体ND Ab效价HI测定值分布范围见表1。

2.3 抗体稳定性测定

2.3.1 室温放置和4 ℃保存对血清ND Ab效价的影响 将血清首次测定ND Ab效价后，取HI测定值为10 log2的5个血清样品，每个血清样品分装后分别于室温（25～35 ℃）和4 ℃放置不同时间，测定抗体效价，计算平均值。结果表明，鸡血清ND Ab在室温下很稳定，夏季炎热天气，室温放置6 d对ND Ab效价几乎没有影响，室温13 d对ND Ab效价仅有轻微影响（P>0.05），HI测定平均值仅降低0.4 log2；鸡血清ND Ab在4 ℃保存相对稳定，反复从4 ℃拿出室温放置后进行HI测定，对ND Ab效价有显著影响（P<0.05），但HI测定平均值仅降低0.6 log2，结果见表2。

2.3.2 -20 ℃反复冻融和-80 ℃反复冻融对血清ND Ab效价的影响 用HI试验测定血清中ND Ab效价，取效价为10 log2的血清样品5个，分装后于4 ℃保存24 h后分别转至-20 ℃和-80 ℃超低温保存。将-20 ℃保存的样品分别于保存1、2、4 d取出融解后，测定ND Ab效价，共反复冻融3次；-80 ℃保存的样品分别于6、8、9 d后拿出室温融解后测定ND Ab效价。测定5个血清样品反复冻融后的ND Ab效价。结果表明，反复冻融对ND Ab效价有显著影响；-20 ℃和-80 ℃反复冻融3次以上对鸡ND Ab效价有极显著的影响（P<0.01），-20 ℃反复冻融3次ND Ab HI平均值降低1.6 log2；  -80 ℃冻融2次对ND Ab效价影响显著（P<0.05），反复冻融3次对ND Ab效价影响极显著（P<0.01），ND Ab HI平均值降低1.2 log2，结果见表3。

2.3.3 加热对血清ND Ab效价的影响 分离血清测定ND Ab效价后，随机取不同效价的6个样品，将血清样品等量分装后，分别进行56 ℃下30 min、65 ℃下30 min、72 ℃下1 min、72 ℃下5 min、72 ℃下10 min水浴处理，然后测定ND Ab效价。结果表明，56 ℃水浴加热30 min对血清中ND Ab效价完全无影响；65 ℃水浴30 min对ND Ab效价影响极显著（P<0.01），ND Ab效价平均值由原来的8.7 log2降低到6.2 log2，降幅明显。血清ND Ab对72 ℃水浴敏感，72 ℃水浴1 min可使其效价平均值明显下降，72 ℃水浴5 min使ND Ab效价由8.7 log2下降到4.7 log2，影响极显著（P<0.01）；72 ℃水浴5 min以上，血清出现果冻样凝固，很难吸出液体状血清，结果见表4。

3 小结与讨论

3.1 鸡ND灭活疫苗免疫后抗体消长规律

对于无ND母源抗体的SPF鸡，利用ND灭活疫苗免疫，通常在免疫后4～7 d可检测到抗体上升，且抗体产生速度受首免日龄和疫苗种类的影响较小，免疫后2周内抗体效价平均每日上升0.40 log2［4，5］。

然而，ND是鸡场常规免疫防控的重要疾病，种鸡、肉鸡均按照免疫方案进行免疫。因此，雏鸡均具有一定水平的ND母源抗体，母源抗体的高低与种鸡免疫程序及种鸡日龄有关。出壳后雏鸡ND母源抗体的自然消长规律主要有下坡势和单峰势，以下坡式为主，在21日龄以内，母源抗体的自然消退速度为平均每日下降约0.3 log2［4，6］。母源抗体可能导致疫苗免疫后效果不一，因此合理制定疫苗免疫方案非常重要。一般母源抗体效价越高，对免疫效果影响越大，免疫后21 d的抗体效价越低［4，7，8］。研究表明，ND母源抗体水平低于5log2的雏鸡，对ND弱毒疫苗的免疫效果影响不显著［2］。母源抗体一般在14～21日龄时降至3log2以下［9-13］，对ND疫苗免疫效果无明显影响，且不能保护鸡群受强毒的攻击［9］。而灭活疫苗中的抗原被油佐剂包被，受母源抗体的干扰较小，在鸡体内可缓慢释放持续剌激机体免疫系统产生的抗体，且维持时间长。

3.2 ND抗体活性稳定性

鸡血清ND Ab在室温和低温环境中稳定性较高，室温放置13 d对ND Ab效价影响较小，而4 ℃保存9 d对ND Ab效价的影响具有统计学差异，但实际HI平均值变化不超过１log2。因此，临床送检ND Ab的血液样品，待血清分离后，可常温运输。鸡血清4 ℃保存测定结果与李爱敏等［14］报道新冠病毒总抗体4 ℃保存30 d对抗体检测结果没有影响的结论基本一致，但4 ℃保存9 d时ND Ab效价HI平均值降低0.6 log2，可能与反复将样品从4 ℃取出测定造成的较大温度变化及检测加样时血清是否回温到室温有关。加样时血清温度高低对测定结果有轻微影响，加样时血清温度低时，HI测定结果偏低，部分样品约有1log2的差异。因此，血清ND Ab效价的稳定性与保存血清的温度是否恒定密切相关，血清样品保存温度稳定可以使抗体活性更持久稳定。

冻融对血清中ND Ab效价HI测定值有较大影响，冻融次数越多，HI测定值越低。-20 ℃和-80 ℃反复冻融3次以上，对ND Ab效价有十分显著的影响。江雅平等［15］报道低温冻融对丙型肝炎病毒抗体检测结果有明显影响，该结果与本研究基本一致，可能冻融对抗体活性结构域的结构有影响，其确切机理有待进一步研究。

水浴加热对鸡血清ND Ab效价的影响与加热温度密切相关，常见的牛奶消毒温度56 ℃下30 min对ND Ab效价完全没有影响。当温度升高到65 ℃时加热30 min对ND Ab效价有显著影响。72 ℃加热1 min，抗体HI效价明显下降，72 ℃水浴5 min以上时，则血清变成果冻样，说明72 ℃高温可使血清中蛋白质变性凝固。抗体是免疫球蛋白，其免疫保护作用和活性稳定结构具有广泛的应用价值［16］。

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