2019—2021年宜春地区患者结核分枝杆菌利福平耐药株基因型分析研究

邬俊勇 黄韬 江光荣

*基金项目：2023年宜春市指导性科技计划项目（2023ZDJH2691）

【摘要】 目的：探究2019—2021年宜春地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型。方法：选择2019年1月—2021年12月于宜春市人民医院接受治疗的肺结核患者100例，采集所有患者痰液样本进行检测。分析结核分枝杆菌分离情况及耐药性，另分析利福平耐药株基因型。结果：100例患者中共分离出结核分枝杆菌47株，分离率为47.00%，2019、2020、2021年结核分枝杆菌分离率分别为33.33%、45.95%、54.76%。2019年分离出结核分枝杆菌7株，利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为42.86%、28.57%、28.57%；2020年分离出结核分枝杆菌17株，利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为58.82%、29.41%、11.76%；2021年分离出结核分枝杆菌23株，利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为60.87%、21.74%、17.39%。结核分枝杆菌对利福平耐药率最高。经rpoB基因测序可见27株利福平耐药株均发生rpoB基因变异，基因突变率为100%（27/27），突变基因位点主要位于509～533位。结论：2019—2021年宜春地区结核分枝杆菌感染率呈逐年上升趋势，结核分枝杆菌感染患者对利福平存在较高的耐药性，且rpoB基因位点突变的发生与利福平耐药间存在密切联系。

【关键词】 肺结核 结核分枝杆菌 利福平 耐药株 基因分型

Genotype Analysis of Mycobaterium Tuberculosis Rifampicin Resistant Strain in Patients in Yichun Area from 2019 to 2021/WU Junyong， HUANG Tao， JIANG Guangrong. //Medical Innovation of China， 2024， 21（13）： -120

[Abstract] Objective： To explore the genotype of Mycobaterium tuberculosis Rifampicin resistant strain in patients in Yichun area from 2019 to 2021. Method： A total of 100 patients with pulmonary tuberculosis who received treatment in Yichun People's Hospital from January 2019 to December 2021 were selected， and all patients' sputum samples were collected for detection. The isolation and resistance of Mycobaterium tuberculosis were analyzed， and the genotype of Rifampicin resistant strain were also analyzed. Result： A total of 47 strains of Mycobaterium tuberculosis were isolated from 100 patients， and the isolation rate was 47.00%. The Mycobaterium tuberculosis isolation rates in 2019， 2020 and 2021 were 33.33%， 45.95% and 54.76%， respectively. In 2019，

7 strains of Mycobaterium tuberculosis were isolated， and the incidence of Rifampicin， Isoniazid and Streptomycin resistance were 42.86%， 28.57% and 28.57%， respectively. In 2020， 17 strains of Mycobaterium tuberculosis were isolated， and the incidence of Rifampicin， Isoniazid and Streptomycin resistance were 58.82%， 29.41% and 11.76%， respectively. In 2021， 23 strains of Mycobaterium tuberculosis were isolated， and the incidence of Rifampicin， Isoniazid and Streptomycin resistance were 60.87%， 21.74% and 17.39%， respectively. The resistance rate of Mycobaterium tuberculosis to Rifampicin was the highest. rpoB gene sequencing showed that all 27 strains of Rifampicin resistant strain had rpoB gene mutation， the mutation rate was 100% （27/27）， and the mutation loci were mainly located at 509-533 positions. Conclusion： From 2019 to 2021， the infection rate of Mycobaterium tuberculosis in Yichun area shows an increasing trend year by year， and patients with Mycobaterium tuberculosis infection have high resistance to Rifampicin， and there is a close association between the occurrence of mutations in the rpoB gene locus and Rifampicin resistance.

[Key words] Pulmonary tuberculosis Mycobaterium tuberculosis Rifampicin Resistant strain Genotyping

First-author's address： Department of Laboratory， Yichun People's Hospital， Yichun 336000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.13.027

结核分枝杆菌是导致结核病的重要病原菌，现已成为危害人类身体健康的严重问题，近年来，结核分枝杆菌感染率逐年上升。大量数据显示，每年约900万人发展为活动性结核病，约300万人发展为耐多药结核病[1-2]。由此可见，给予结核分枝杆菌感染的结核病患者积极治疗尤为重要。随着抗结核药物的不断更新及应用，结核病患者的用药中极易出现不合理的用药现象，导致患者无法彻底杀灭结核分枝杆菌，且长时间的反复用药也引发患者机体出现不同程度的耐药，从而延长了疾病病程，大大增加了患者的死亡风险[3-4]。目前，在结核病治疗中利福平为首选药物，能够有效缩短患者病程。但在临床应用中，若结核分枝杆菌发生耐药性，采用利福平治疗时获得的临床效果将下降，易出现耐多药肺结核，进而加重患者病情[5-6]。因此，在结核病治疗的同时分析且掌握结核分枝杆菌的耐药性尤为重要，利于治疗的进一步开展。鉴于此，本研究选择2019年1月—2021年12月于宜春市人民医院接受治疗的肺结核患者100例，对2019—2021年宜春地区患者结核分枝杆菌利福平耐药株基因型进行分析，为临床诊疗提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1月—2021年12月于本院接受治疗的肺结核患者100例。纳入标准：临床明确诊断为肺结核；病历资料齐全。排除标准：肥胖症、糖尿病等内分泌系统疾病；妊娠期及哺乳期；病历资料缺乏；存在白血病、严重贫血等血液系统疾病；已接受化疗；精神异常，无法配合完成本次研究。男62例，女38例；年龄23～75岁，平均（49.82±3.91）岁。患者或患者家属均知情同意本次研究。本研究获本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

采集所有患者痰液样本，对痰液样本行生物化学反应，对结核分枝杆菌的菌种进行鉴定。（1）主要试剂与仪器：恒温培养箱选用德国Eppendorf公司生产；微生物鉴定分析系统（美国BD公司，型号：BD Phoneix 100）。（2）耐药性实验：采用比例法行药敏试验，刮取新鲜菌苔时使用无菌接种环刮，将其配置成菌悬液，随后吸取0.1 mL接种于含有药液的培养基上，4周后仔细观察培养结果。（3）结核分枝杆菌基因组DNA制备：自培养基上取菌落加入DNA裂解液中，放置于55 ℃环境下水浴3 h，随后置于95 ℃环境下灭活5 min，加入酚-氯仿-异戊醇溶液，按照25︰24︰1的比例，抽提2次后再次加入高压灭菌双蒸水溶液50 μL，并将其置于20 ℃环境

中保存待检。（4）聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增检测：上游引物序列RD105-F，GGAGTCGTTGA GGGTGTTCATCAGCCAGTCCGGT；下游引物序列RD105-R1与RD105-R2分别

如下，CGCCAAGGCCGCATAGTCACGGCG、TGCCCACTGGTCGATATGGTGGACTT。取2 μL DNA

模板，上、下游引物各1 μL，ddH2O补足，反应参数设置如下：94 ℃环境下变性30 s，94 ℃环境下预变性8 min，于58 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，上述共40个循环，72 ℃终延伸8 min。

rpoB基因PCR引物序列rpoB-F、rpoB-R分别如下：CTTGCACGAGGGTCA GACCA、ATCTCGTCGC-TAACCACGCC，取50 μL反应体系，ddH2O 20 μL，2 μL DNA模板，上、下游引物各1 μL，反应参数设置如下：94 ℃变性40 s，94 ℃预变性8 min，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共计35个循环，72 ℃终延伸8 min。扩增所获得的产物需应用1%琼脂糖凝胶电泳检测。（5）DNA测序：PCR扩增产物由专业公司进行测序后再行DNA基因组序列的分析。

1.3 观察指标

分析结核分枝杆菌分离情况及耐药性，另分析利福平耐药株基因型。

2 结果

2.1 结核分枝杆菌分离情况

100例患者中共分离出结核分枝杆菌47株，分离率为47.00%（47/100）。2019、2020、2021年收治肺结核患者分别21、37、42例，结核分枝杆菌分离率分别为33.33%（7/21）、45.95%（17/37）、54.76%（23/42）。

2.2 药物耐药性分析

2019年分离出结核分枝杆菌7株，利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为42.86%、28.57%、28.57%；2020年分离出结核分枝杆菌17株，利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为58.82%、29.41%、11.76%；2021年分离出结核分枝杆菌23株，

利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为60.87%、21.74%、17.39%。见表1。

2.3 利福平耐药株基因型

经rpoB基因测序可见27株均发生rpoB基因变异，基因突变率为100%（27/27），突变基因位点主要位于509～533位，见表2。

3 讨论

结核病属重大传染性疾病，危险性较高，随着生存环境的改变，结核病发病率呈逐年上升趋势，对患者生命安全及生活质量造成严重影响[7-8]。既往临床采用痰培养的方式鉴别诊断结核分枝杆菌，但耗费时间较长，无法满足临床检验需求，甚至延误最佳治疗时机[9-10]。故探讨一种更为有效的检验方法在结核分枝杆菌检验中具有重要作用。

研究显示，结核分枝杆菌的菌体细胞壁外侧存在一层荚膜，可有效保护菌株[11-12]。近年来，随着结核病发病率不断升高，结核分枝杆菌的传播与发展，使得后期获得性结核病耐药率明显上升，由此导致耐药结核病发生率逐年升高，特别是多药结核病的发生率，已严重威胁结核病的控制，同时在临床治疗中造成极大的困扰[13-14]。因此，如何有效的缓解及控制结核耐药菌耐药情况现已成为研究的重点。利福平、异烟肼及链霉素均为广谱抗分枝杆菌活性的药物，是目前治疗结核分枝杆菌感染的首选。本研究结果显示，100例患者中共分离出结核分枝杆菌47株，分离率为47.00%。2019、2020、2021年结核分枝杆菌分离率分别为33.33%、45.95%、54.76%，其中2019年分离出结核分枝杆菌7株，利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为42.86%、28.57%、28.57%；2020年分离出结核分枝杆菌17株，利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为58.82%、29.41%、11.76%；2021年分离出结核分枝杆菌23株，利福平、异烟肼、链霉素耐药发生率分别为60.87%、21.74%、17.39%。结核分枝杆菌对利福平耐药率最高，且耐药率呈逐年上升趋势，表明2019—2021年宜春地区结核分枝杆菌感染率逐年上升，分离株对利福平存在较高的耐药率，这可能与宜春地区结核病患者使用药物的治疗频率等存在密切联系。利福平为利福霉素类合成的广谱抗生素，作为一线抗结核药物，已在临床上得到充分的使用[15-16]。相关研究显示，约87%的利福平耐药菌株同时对异烟肼也有较强的耐药性，且利福平敏感性较强，可将其作为鉴别诊断结合分枝杆菌的重要依据[17-18]。故积极监测结核分枝杆菌耐药性变化对指导利福平使用意义重大。

为了进一步降低临床上利福平耐药率，临床加强了对耐药基因的检测。结核分枝杆菌发生耐药的风险多在染色体上，也是在基因突变作用下而造成，又因不同药物基因突变类型存在相应位点的突变[19]。本研究结果显示，经rpoB基因测序可见27株利福平耐药株均发生rpoB基因变异，基因突变率为100%（27/27），突变基因位点主要位于509～533位。分析其原因可知，发生rpoB基因突变的患者多伴有胞嘧啶向胸腺嘧啶的转换，导致531位的丝氨酸转变为亮氨酸，致使突变发生率大大提高[20-21]。由此可见，在结核分枝杆菌治疗中，可将rpoB基因的起始端作为临床的检测靶标，有助于评估利福平的耐药性，对有效提高临床分子检测技术的准确度及敏感度具有重要作用，同时利于提高利福平药物使用价值。

综上所述，2019—2021年宜春地区患者结核分枝杆菌检出率逐年升高，且利福平耐药率逐年上升，rpoB基因变异是导致结核分枝杆菌分离株对利福平耐药的重要原因，在临床干预中需予以重视。

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（收稿日期：2023-10-27） （本文编辑：陈韵）