紫檀芪抗H2O2诱导H9C2心肌细胞肥大

杨资鉴 王家璞

[摘要] 目的 探讨紫檀芪（pterostilbene，PTE）对H2O2诱导H9C2心肌细胞肥大的影响。方法 培养H9C2心肌细胞，使用50μmol/L的H2O2诱导心肌肥大，随机将其分为对照组（control组，C组）、心肌肥大组（hypertrophy组，H组）和心肌肥大+PTE组（H+PTE组）。干预48h后，采用细胞免疫荧光法检测H9C2心肌细胞表面积，采用蛋白免疫印迹法检测p62和p-mTOR蛋白表达。结果 与C组比较，H组心肌细胞的表面积显著增大，p62表达显著升高，p-mTOR/mTOR表达显著降低（P<0.05）。与H组比较，H+PTE组心肌细胞的表面积显著减小，p62表达显著降低，p-mTOR/mTOR表达显著升高（P<0.05）。结论 PTE通过抑制mTOR信号通路调节自噬进而减轻H2O2诱导的H9C2心肌细胞肥大。

[关键词] 紫檀芪；自噬；H2O2；心肌细胞肥大

[中图分类号] R542.2      [文献标识码] A    [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.15.006

Pterostilbene against H2O2-induced hypertrophy of H9C2 cardiomyocytes

YANG Zijian1， WANG Jiapu1， 2

1.Department of Cardiology， Shanxi Cardiovascular Hospital， Taiyuan 030024， Shanxi， China; 2.Central Laboratory， Shanxi Cardiovascular Hospital， Taiyuan 030024， Shanxi， China

[Abstract] Objective To investigate effects of pterostilbene （PTE） on H2O2-induced hypertrophy of H9C2 cardiomyocytes. Methods H9C2 cardiomyocytes were cultured in DMEM， cardiomyocyte hypertrophy model was created by using 50 μmol/L H2O2， and they were randomly divided into control group （group C）， cardiac hypertrophy group （group H） and cardiac hypertrophy + PTE group （group H+PTE）. After 48 hours of intervention， surface area of H9C2 cardiomyocytes was detected by using cellular immunofluorescence， protein p62 and p-mTOR expression were detected by using Western blot. Results Compared with group C， surface area of cardiomyocytes and expression of p62 significantly increased in group H， and expression of p-mTOR/mTOR significantly decreased in group H （P<0.05）. Compared with group H， surface area of cardiomyocytes and expression of p62 significantly decreased in group H+PTE， and expression of p-mTOR/mTOR significantly increased in group H+PTE （P<0.05）. Conclusion PTE alleviates H2O2-induced hypertrophy in H9C2 cardiomyocytes by regulating autophagy through inhibition of mTOR signaling pathway.

[Key words] Pterostilbene; Autophagy; Hydrogen peroxide; Cardiomyocyte hypertrophy

心肌细胞肥大是一个或可逆转的病理生理过程。越来越多的研究集中在寻找具有生物活性的小分子上，以期能逆转这一过程。作为一种具有多种生物学活性的非黄酮类多酚化合物，紫檀芪（pterostilbene，PTE）在心肌梗死、心肌缺血再灌注等方面具有显著的心脏保护作用[1-4]。本研究拟在H2O2诱导H9C2心肌细胞肥大模型上观察PTE的影响及可能机制。

1  材料与方法

1.1  主要材料

H9C2心肌细胞购自中国科学院细胞库。α肌动蛋白、PTE和H2O2购自Sigma Aldrich公司，mTOR、p-mTOR和GAPDH购自Abcam公司。

1.2  实验分组及处理

H9C2心肌细胞用10%胎牛血清DMEM液在37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育。随机将其分为对照组（control组，C组）、心肌肥大组（hypertrophy组，H组）和心肌肥大+PTE组（H+PTE组）。提前48h加入50μmol/L的H2O2干预获得细胞肥大模型，50μmol/L的PTE预先加入干预[5-6]。

1.3  细胞免疫荧光法检测细胞表面积

H9C2心肌细胞接种于24孔板，密度3×104个，37℃ 5%CO2培养箱孵育贴壁，30% H2O2处理48h，或与50μmol/L的PTE共孵育48h后磷酸盐缓冲液洗板，加入4%多聚甲醛固定，10%山羊血清室温避光封闭30min弃掉，加入抗α肌动蛋白抗体静置孵育4℃过夜，第2天磷酸盐缓冲液洗板，加FITC标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G室温孵育2h后弃去，磷酸盐缓冲液洗板，DAPI避光染核，磷酸盐缓冲液洗涤3次吸干，封片剂封片，荧光倒置显微镜观察拍照。

1.4  蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达

使用RIPA提取液，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，4℃匀浆，取上清，BSA法定量，10% SDS-PAGE电泳后转膜，5% BSA封闭1h，加一抗anti-p62抗体、anti-mTOR抗体、anti-p-mTOR抗体和内参anti-GAPDH抗体4℃摇床过夜，1×TBST洗膜3次后加入二抗，1×TBST洗膜3次后增强化学发光法发光，BIO-RAD凝胶成像仪曝光，Image Lab分析条带灰度值。

1.5  统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。所有数据均进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  PTE减轻H2O2诱导的H9C2心肌细胞肥大

三组心肌细胞的表面积情况见图1。与C组比较，H组心肌细胞的表面积显著增大（P<0.05），提示H2O2诱导H9C2心肌细胞肥大，与H组比较，H+PTE组心肌细胞的表面积显著减小（P<0.05），提示PTE可阻止H2O2诱导H9C2心肌细胞进一步肥大。

2.2  PTE通过调节自噬减轻H2O2诱导的H9C2心肌细胞肥大

三组心肌细胞的p62、p-mTOR表达见图2。与C组比较，H组心肌细胞的p62表达显著升高，p-mTOR/mTOR表达显著降低（P<0.05），提示H2O2诱导H9C2心肌细胞肥大是通过自噬增强达成。与H组比较，H+PTE组心肌细胞的p62表达显著降低，p-mTOR/mTOR表达显著升高（P<0.05），提示PTE延缓自噬的累积，具有自噬调节作用。

3  讨论

心肌细胞肥大是心力衰竭发生和发展的重要一环。抑制心肌细胞肥大、延缓心力衰竭发生是目前治疗心力衰竭的方法之一。PTE作为一种生物活性物质具有稳定高效的生物利用度[7]；相关文献多涉及动物实验，主要集中在心肌梗死、缺血/再灌注损伤和心力衰竭的心肌保护[2-4，8-9]。前期研究发现PTE具有抵抗压力超负荷大鼠早期心肌肥厚的作用，与文献中PTE改善大鼠心肌肥厚的作用结果类似[10]。

PTE在细胞水平上的表现证实，PTE可抵抗缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡[6]。本研究通过采用H2O2干预获得心肌细胞肥大模型，并通过细胞免疫荧光法测量H9C2心肌细胞表面积后发现，使用低浓度外源性的H2O2干预可获得心肌细胞肥大模型[5]。在PTE干预之后心肌细胞表面积显著缩小，提示PTE可减轻H2O2诱导的H9C2心肌细胞肥大。

自噬介导氧化应激诱导的心力衰竭和心肌肥厚[5，11-12]。自噬蛋白p62增加即自噬通量的增加[13]。本研究通过免疫抑制实验检测自噬相关蛋白p62的表达发现，H9C2心肌细胞肥大早期p62表达上调，提示自噬参与H2O2诱导的H9C2心肌细胞肥大，呈现p62依赖性，与文献结果一致[14]。H+PTE组心肌细胞的p62表达较H组显著下降，提示PTE通过调节p62依赖性自噬减轻H2O2诱导H9C2心肌细胞肥大。此外，PTE通过mTOR信号激活自噬[15]。本研究还发现，H组心肌细胞的p-mTOR/mTOR较C组显著下降，当给予PTE干预后出现上调，提示PTE调节自噬是通过抑制mTOR信号通路达成，进而发挥心肌保护作用。

综上所述，PTE通过调节自噬减轻H2O2诱导的H9C2心肌细胞肥大，其机制与抑制mTOR信号有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2023–08–13）

（修回日期：2023–09–16）