橙足海参多肽的制备工艺优化及其抗氧化活性研究

金丹莉 程逸潮 洪杏德 付晶晶 董秀萍 陈跃文

摘要：以橙足海参（Cucumaria frondosa）为原料，通过水解度、可溶性多肽含量、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、总还原力和铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）等理化指标的分析，结合单因素实验和响应面实验，探究了复合酶酶解法制备海参多肽的最佳工艺参数。利用切向流超滤技术对海参酶解液进行分离，考察了不同分子量段的海参多肽在体外消化前后的抗氧化活性。结果表明，最佳工艺参数为时间5.0 h、温度50.0 ℃和pH值7.0，在此条件下测得ABTS自由基清除率为38.43%。当分子量＜3 000 Da时，DPPH自由基清除率IC₅₀达到2.76 mg/mL，ABTS自由基清除率IC₅₀达到2.61 mg/mL，总还原力为0.31，FRAP为0.16μmol/mL Fe²⁺当量。同时，体外消化结果显示，海参多肽的ABTS自由基清除率上升，DPPH自由基清除率、总还原力和FRAP下降，但是仍具有较高的抗氧化活性。实验结果表明，海参多肽在消化前后均具有良好的抗氧化活性，为其功能性食品组分的添加和开发提供了理论依据。

关键词：橙足海参多肽；复合酶酶解；响应面分析；切向流超滤；体外消化；抗氧化能力

中图分类号：TS254.1

文献标志码：A

文章编号：1000-9973（2024）06-0022-09

Optimization of Preparation Process and Research on Antioxidant Activity of

Polypeptides from Cucumaria frondosa

JIN Dan-li^1，2， CHENG Yi-chao^1，2， HONG Xing-de³， FU Jing-jing^1，2，

DONG Xiu-ping^4，5， CHEN Yue-wen^1，4，5*

（1.School of Food Science and Biotechnology， Zhejiang Gongshang University， Hangzhou 310018，

China; 2.Donghai Food Research Institute （Taizhou）， Zhejiang Gongshang University， Taizhou

310018， China; 3.Qingdao Niucuisheng Biological Health Technology Co.， Ltd.， Qingdao

266071， China; 4.School of Food Science and Technology， Dalian Polytechnic

University， Dalian 116034， China; 5.National Engineering Technology

Research Center of Seafood， Dalian 116034， China）

Abstract： With Cucumaria frondosa as the raw material， the optimal process parameters for the preparation of Cucumaria frondosa polypeptides by enzymolysis of complex enzymes are determined through the analysis of degree of hydrolysis， the content of soluble polypeptides， DPPH free radical scavenging rate， ABTS free radical scavenging rate， total reducing power and ferric reducing antioxidant power （FRAP）， combined with single factor experiment and response surface experiment.The enzymatic hydrolysate of Cucumaria frondosa is separated by tangential flow ultrafiltration technique， and the antioxidant activity of Cucumaria frondosa polypeptides with different molecular weight segments before and after digestion in vitro are investigated. The results show that the optimal process parameters are time 5.0 h， temperature 50.0 ℃ and pH value 7.0. Under such conditions， the scavenging rate on ABTS free radical is 38.43%. When the molecular weight is less than 3 000 Da， DPPH free radical scavenging rate IC₅₀， ABTS free radical scavenging rate IC₅₀， total reducing power and FRAP is 2.76 mg/mL， 2.61 mg/mL， 0.31， 0.16μmol/mL Fe²⁺equivalent respectively. Meanwhile， the digestion in vitro results show that ABTS free radical scavenging rate of Cucumaria frondosa polypeptides increases， DPPH free radical scavenging rate， total reducing power and FRAP decrease， but they still have strong antioxidant activity. The experiment results show that Cucumaria frondosa polypeptides have good antioxidant activity before and after digestion， which has provided a theoretical basis for the addition and development of functional food components.

Key words： Cucumaria frondosa polypeptides; enzymolysis of complex enzymes; response surface analysis;

tangential flow ultrafiltration; digestion in vitro; antioxidant activity

收稿日期：2023-11-15

基金项目：浙江省自然科学基金项目（LQ21C200004）；浙江省教育厅一般科研项目（Y202352582）

作者简介：金丹莉（1999—），女，硕士研究生，研究方向：食品加工技术与理论。

*通信作者：陈跃文（1985—），男，副教授，博士，研究方向：食品加工技术与理论。

采用蛋白酶将蛋白水解成小分子肽不但能够提高生物活性的效用，而且能够拥有更高的产业价值^[1]。然而，粗酶解产物是由生物活性肽和许多非生物活性水解化合物组成的复杂基质，需要被有效分离才能充分发挥出生物活性作用^[2]。超滤分离技术在多肽综合开发领域的研究和应用已成为热点，例如，Leiva-Portilla等^[3]利用超滤（ultrafiltration，UF）截留出最具抗氧化性的部分（<3 000 Da），对获得虾加工废弃物高潜力的肽组分具有积极贡献。毕秋芸^[4]研究发现通过UF分离裙带菜多肽，低分子量段比高分子量段的抗氧化活性更强。关于超滤分离海参多肽的研究较少。此外，海参多肽具有抗氧化、抗炎和抗疲劳等生理活性，能够应用于面包和饮料等多种食品行业中。国内已开始出现以肽为原料的产品，但是市场占有率仍然处在低位^[5]。肖盼盼等^[6]利用牡蛎肽、海参肽、鳗鱼肽制备固体饮料，增强了小鼠的性功能和抗疲劳活性。肖彦春等^[7]将海参肽加入酸奶中，有效地提高了抗氧化能力。

本研究以低值橙足海参（Cucumaria frondosa）为原料，采用单因素实验结合响应面法对海参酶解工艺进行优化。采用切向流超滤技术分离海参多肽，以DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、总还原力和铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）为指标，对其消化前后的抗氧化能力进行初步研究，为海参多肽的分离、纯化及其功能性食品的开发和利用提供了理论支撑。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

橙足海参（Cucumaria frondosa）：由青岛纽萃生生物健康科技有限公司提供。

1.2 试剂

中性蛋白酶（50 U/mg）、木瓜蛋白酶（＞200 U/mg）：上海麦克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt， ABTS）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（2，4，6-tri（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）、牛血清蛋白、胃蛋白酶（≥3 000 U/mg，猪源）、胰蛋白酶（≥250 U/mg，猪胰腺）：美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器与设备

TGL-16M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Infinite E Plex多功能酶标仪 帝肯（上海）实验器材有限公司；CM-14斩拌机 无锡市哈克逊工贸有限公司；HCJ-2E磁力搅拌水浴锅 常州恩培仪器制造有限公司；Minimate切向流超滤系统及膜包 杭州九龄科技有限公司；Scientz-100FG/A冷冻干燥机 宁波新芝冻干设备股份有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 橙足海参的预处理

将橙足海参用流水解冻，去除头、尾及内脏部分，利用斩拌机切碎海参体壁，随后冷冻干燥48 h，得到海参冻干体壁，贮藏于-20 ℃冰箱中待用。

1.4.2 海参多肽的制备

将海参冻干体壁按照1∶20（海参冻干体壁∶溶液）的比例溶解于蒸馏水中，同时加入蛋白酶（蛋白酶∶海参冻干体壁为3∶50），在一定的温度、时间和pH值条件下进行酶解。结束后，在100 ℃恒温10 min进行灭酶。

1.4.3 海参多肽的分离

在灭酶后的海参酶解液中加入无水乙醇至浓度为80%，过夜醇沉，抽滤，旋蒸。然后利用切向流超滤系统配合不同分子量的膜包（3 000 Da和5 000 Da）进行分离，收集滤液并冻干，得到4种海参多肽组分，即未分离的海参多肽（SCP）、海参多肽分子量＜3 000 Da（SCP-Ⅰ）、海参多肽分子量在3 000～5 000 Da（SCP-Ⅱ）和海参多肽分子量＞5 000 Da（SCP-Ⅲ），保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.4.4 酶解工艺的优化

1.4.4.1 蛋白酶及其复合比例的确定

以海参冻干体壁为原料，根据1.4.2步骤进行酶解。固定酶解温度为50 ℃、酶解时间为5 h和pH值为7，考察不同蛋白酶及其复合比例对海参酶解液的影响。设定木瓜蛋白酶为E1组，中性蛋白酶为E2组，中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶为2∶1为E3组，中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶为4∶1为E4组，中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶为4∶5为E5组。收集上清液进行水解度、可溶性多肽含量、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、总还原力和FRAP的测定，实验重复3次。最终确定使用中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶为2∶1进行单因素实验，并以水解度和ABTS自由基清除率为测定指标。

1.4.4.2 单因素实验

分别考察时间、温度和pH值对水解度和ABTS自由基清除率的影响。每组称取10 g海参冻干体壁、0.4 g中性蛋白酶和0.2 g木瓜蛋白酶，加入蒸馏水200 mL，在一定时间、温度和pH值条件下进行酶解，反应结束后在100 ℃恒温10 min进行灭酶。样品以4 000 r/min离心10 min，取上清液测定水解度和ABTS自由基清除率。进行单因素实验时，改变单一因素的取值，其余因素固定不变。分别按照3个单因素进行酶解：时间取3，4，5，6，7 h，其余条件不变；温度取40，45，50，55，60 ℃，其余条件不变；pH值取5，6，7，8，9，其余条件不变。

1.4.4.3 响应面实验

在单因素实验的基础上，以ABTS自由基清除率为制备海参多肽的响应值。根据Box-Behnken实验设计原理，选择A时间（4，5，6 h）、B温度（45，50，55 ℃）、C pH值（6，7，8）进行三因素三水平响应面实验，实验设计因素和水平见表1。

1.4.5 体外抗氧化活性的测定

1.4.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

按照文献[8]的方法并稍作修改，准确称取0.099 2 g DPPH，用无水乙醇定容至25 mL，作为储备液，并于4 ℃下避光保存；量取2 mL储备液用无水乙醇定容至100 mL，摇匀即为0.2 mmol/L DPPH工作液，现配现用。分别取1 mL样品溶液，加入2 mL DPPH工作液避光反应30 min，以8 000 r/min离心5 min，取200μL溶液于96孔板中，在517 nm处测定吸光度A₁，同时测定1 mL样品溶液与2 mL无水乙醇溶液混合后的吸光度A₂，以及1 mL蒸馏水与2 mL DPPH溶液混合后的吸光度A₃。DPPH自由基清除率按公式（1）计算：

DPPH自由基清除率（%）=（1-A₁-A₂A₃）×100%。（1）

1.4.5.2 ABTS自由基清除能力的测定

根据文献[9]的方法并稍作修改，将7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液按照1∶1混匀，避光反应16 h，获得储备液。用蒸馏水稀释储备液，在734 nm处吸光度为0.70±0.02左右时获得工作液。然后取1 mL样品溶液，加入3 mL ABTS工作液，避光静置30 min，以8 000 r/min离心5 min，取200μL溶液于96孔板中，在734 nm处测定吸光度A₁，同时测定1 mL样品溶液与3 mL蒸馏水混合后的吸光度A₂，以及1 mL蒸馏水与3 mL ABTS工作液混合后的吸光度A₃。ABTS自由基清除率按公式（2）计算：

ABTS自由基清除率（%）=（1-A₁-A₂A₃）×100%。（2）

1.4.5.3 总还原力的测定

根据文献[10]的方法并稍作修改，取1 mL样品溶液，加入1 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH值6.6）及1 mL 1%的铁氰化钾溶液，充分混合后，在50 ℃水浴孵育20 min。再加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液，在25 ℃孵育10 min，然后以8 000 r/min离心10 min。取1 mL上清液，再加入1 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的氯化铁溶液，反应10 min，取200μL反应完后的溶液于96孔板中，在700 nm处测定吸光度。以等体积蒸馏水代替样品作为空白对照。溶液的吸光度越高，总还原力越强，反之越弱。

1.4.5.4 FRAP的测定

根据文献[11]的方法并稍作修改，醋酸盐缓冲液（0.3 mol/L，pH值3.6）、TPTZ溶液（0.01 mol/L）和三氯化铁溶液（0.02 mol/L），按照10∶1∶1混合，制备工作液。工作液需在37 ℃预热20 min再使用。取24μL样品或蒸馏水，加入180μL工作液，在37 ℃恒温反应10 min，于593 nm处测定吸光度。根据0.003 125～0.1μmol/mL的硫酸亚铁溶液制作标准曲线。FRAP按公式（3）计算：

FRAP（μmol/mL）=C×N。（3）

式中：C表示样品去掉空白后的吸光度代入回归方程得到的Fe²⁺当量（μmol/mL）；N表示稀释倍数。

1.4.6 水解度的测定

参考文献[12]的方法并稍作修改，采用甲醛滴定法测定水解度。取1 mL样品（1 mg/mL），调节pH值为8.2，然后加入2 mL中性甲醛，利用氢氧化钠溶液（0.5 mol/L）滴定至pH值为9.2，记录所消耗的氢氧化钠溶液的体积。空白对照是酶解前的样品溶液。总氮含量根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定。水解度按公式（4）计算：

水解度（%）=C×（V₁-V₂）×0.014N×100%。（4）

式中：C表示氢氧化钠溶液浓度（mol/L）；V₁表示酶解后所用的氢氧化钠溶液的体积（mL）；V₂表示酶解前所用的氢氧化钠溶液的体积（mL）;0.014表示氮的毫克当量；N表示样品底物中的总氮含量（g）。

1.4.7 可溶性多肽含量的测定

参考文献[13]的方法并稍作修改，分别称取0.15 g硫酸铜与0.6 g酒石酸钾钠作为溶质，同时量取50 mL蒸馏水和30 mL 10%的氢氧化钠溶液为溶剂，充分混匀后，获得双缩脲试剂。取2.5 mL样品溶液（10 mg/mL），加入2.5 mL 20%的三氯乙酸溶液，混合均匀，静置10 min，以12 000 r/min离心5 min，然后取3 mL上述溶液到另一试管中，加入2 mL双缩脲试剂，混合均匀，静置10 min，取上清液于540 nm处测定吸光度。

1.4.8 体外消化

1.4.8.1 模拟体外胃肠消化

根据文献[14]的方法并稍作修改，将10 mL肽溶液（2 mg/mL）的pH值调节至2.0，然后加入4 000 U/mL胃蛋白酶，37 ℃恒温摇床以120 r/min的速度消化1 h。将混合物的pH值调节至7.0，加入200 U/mL胰蛋白酶，37 ℃恒温摇床以120 r/min的速度进一步消化2 h。结束后，沸水浴15 min使酶失活。

1.4.8.2 多肽消化率的测定

根据1.4.7中的方法测定多肽含量，多肽消化率按公式（5）计算^[15]：

多肽消化率（%）=A₀-A₁A₀×100%。（5）

式中：A₀表示消化前多肽的含量（mg/mL）；A₁表示消化后多肽的含量（mg/mL）。

1.5 数据处理

数据使用SPSS 13.0软件进行方差和显著性分析，组间的多重比较采用单因素方差分析，P<0.05表示有统计学差异。采用Design-Expert 13对响应面实验结果进行作图分析，利用OriginPro 2023b绘制图形。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶及其复合比例的确定

利用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶及其不同复合比例对海参进行酶解。由图1中A可知，与其他3组相比，E3组的水解度和可溶性多肽含量呈现显著性差异（P<0.05），分别为55.01%和3.15 mg/mL。此外，双酶复合组比单酶组水解度高。由图1中B可知，E3组的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率相对于其他组具有显著性差异（P<0.05），分别达29.36%和38.54%。但总还原力（0.16）和FRAP（0.104μmol/mL）相对于其他组差异不显著（P>0.05）。因此，选择中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶为2∶1复合酶解制备海参多肽。有研究报道称蛋白酶具有底物特异性，且不同种类的蛋白酶对底物的酶切位点也有所不同，因此，酶解产物有时会进行加和产生更多的多肽^[16]。徐阳等^[17]研究发现双酶酶解大鲵蛋白的效果优于单酶酶解，可能是因为不同蛋白酶组合能够酶切到更多位点，促进水解效率。Zhu等^[18]探究食用菌汤料副产物制备酶解液时，发现复合酶水解产物的性质优于单一酶，DPPH自由基清除能力和总还原力较高。

2.2 单因素实验结果分析

由图2中A可知，随着温度的上升，水解度和ABTS自由基清除率呈现先上升后下降的趋势，在50 ℃时达到最高值，分别为55.33%和38.13%。温度对蛋白酶的酶活十分重要，温度过低或过高都会影响酶活力，从而影响释放肽的速率，而且温度会影响蛋白酶和蛋白质的特定结构，反应速率会下降^[19]。由图2中B可知，在酶解前期，底物浓度大且酶活力旺盛，水解度和ABTS自由基清除率持续上升，在5 h时达到最大值，分别为55.73%和38.89%；酶解后期呈现下降趋势，可能是因为含有抗氧化功能的多肽再次被水解^[20]。由图2中C可知，随着pH值的上升，水解度和ABTS自由基清除率呈现先上升后下降的趋势，在pH值为7时达到最大值，分别为55.92%和38.05%。溶液的酸碱程度会影响蛋白酶和底物的离解状态，在不恰当的范围内，酶无法保持最佳活性，从而降低酶的水解效率，同时多肽本身结构也容易被破坏^[21]。综上所述，选择温度45～55 ℃、时间4～6 h、pH值6～8进行响应面实验。

2.3 响应面实验分析

根据单因素实验结果，结合Box-Behnken实验设计原理，选择A时间（4，5，6 h）、B温度（45，50，55 ℃）、C pH值（6，7，8）进行三因素三水平响应面实验。以ABTS自由基清除率为响应值，探究A（时间）、B（温度）、C（pH值）对Y（ABTS自由基清除率）的影响。响应面实验设计及结果见表2。

该模型的方差分析结果见表3。

由表3可知，回归模型的F=121.06，P<0.001，说明模型极显著；失拟项的F=1.32，P=0.383 6＞0.05，说明方程的拟合度高，具有较高的可信度；一次项中A、B、C，二次项A²、B²、C²的P值均小于0.05，说明时间、温度、pH值3个因素的一次项和二次项都具有显著影响。决定系数R²=0.993 6，说明模型能解释99.36%响应值Y的变化，修正系数R_Adj²=0.985 4，与决定系数相差不大，说明模型的拟合度良好，可用于分析和预测酶解工艺条件。根据F值的大小，可以判断出各因素对ABTS自由基清除率的影响程度为A（时间）＞B（温度）＞C（pH值）。

3D响应面是回归方程的图形表示，其形状为凸形时，响应曲面图能够显示最佳工艺条件^[22]。由图3可知，随着时间的延长和温度的升高，ABTS自由基清除率呈现先上升后下降的趋势；随着时间的延长和pH值的升高，ABTS自由基清除率呈现先上升后下降的趋势；随着温度和pH值的升高，ABTS自由基清除率呈现先上升后下降的趋势。采用Design-Expert 13软件对上述数据进行拟合和优化，最终确定最佳酶解工艺为时间5.106 h、温度49.32 ℃、pH值7.249，在此条件下，ABTS自由基清除率预测值为38.649%。考虑到实验的实际操作，将海参酶解工艺条件修正为时间5.0 h、温度50.0 ℃和pH值7.0。在此条件下，经过3次平行实验，测得ABTS自由基清除率为38.43%，与回归方程预测值的误差小于1%，与理论值基本吻合，证明了响应面分析法对海参酶解工艺条件的优化是可行的。

2.4 分子量对海参多肽抗氧化活性的影响

本实验分别采用截留分子量为3 000 Da和5 000 Da的超滤膜对海参多肽进行分离，通过DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、总还原力和FRAP的变化，研究不同分子量段的海参多肽的抗氧化活性。

由图4中A～D可知，SCP-Ⅰ组的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、总还原力和FRAP均优于其他3组（P<0.05），DPPH自由基清除率IC₅₀达到2.76 mg/mL，ABTS自由基清除率IC₅₀达到2.61 mg/mL，总还原力为0.31，FRAP为0.16μmol/mL Fe²⁺当量，说明小分子量的海参多肽具有更强的抗氧化活性，同时说明切向流超滤能够有效分离海参多肽，提高其抗氧化活性。Wang等^[22]研究发现太平洋鲱（Clupea pallasii）酶解物分子量低于3 500 Da时表现出最高的体外抗氧化活性和细胞抗氧化活性。Noman等^[23]利用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶分别水解中华鲟鱼蛋白，发现<1 000 Da的水解产物的抗氧化活性最高，具体来说，DPPH自由基清除率IC₅₀分别为2.59，2.31 mg/mL，ABTS自由基清除率IC₅₀分别为1.54，1.36 mg/mL。与东海海参胶原蛋白酶解物的DPPH自由基清除率IC₅₀为24 mg/mL^[24]相比，经过切向流超滤分离的海参多肽的DPPH自由基清除能力更强。此外，不同分子量段的海参多肽呈现量效关系，这与Safari等^[25]的研究结果一致。

2.5 体外消化对海参多肽抗氧化活性的影响

生物活性肽要在体内发挥生物学效应，必须经过胃肠消化，这将会显著影响肽的生物活性。在进行体内研究之前，体外模拟胃肠消化模型已成为快速且广为接受的方法^[26]。将超滤分离前后的海参多肽进行体外消化，见图5 中A。SCP-Ⅰ组的消化率（51.90%）显著低于其他3组（P<0.05），说明小于3 000 Da的海参多肽在胃肠消化过程中更加缓慢，这与Chen等^[27]的研究结果一致。短链肽通常在体内表现出更强的生物活性，因为它们太小而不能作为消化蛋白酶的底物，从而增强了对胃肠消化的抵抗力，并增加了穿过肠道屏障以引发其生物学功能的可能性^[28]。赵才冬等^[29]发现甲鱼蛋蛋白水解物大分子多肽比小分子多肽更容易被降解为更短的肽，换句话说，短肽更能抵抗消化酶的水解，这是因为短肽本身较短，含有消化酶的消化位点更少。

为了考察不同分子量段的海参多肽的抗氧化能力，测定了DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、总还原力和FRAP，结果见图5中B～E。

由图5可知，SCP-Ⅰ组消化前后DPPH自由基清除率分别为20.57%和9.80%，ABTS自由基清除率分别为54.22%和60.55%，总还原力分别为0.25和0.19，FRAP分别为0.08μmol/mL Fe²⁺当量和0.06μmol/mL Fe²⁺当量。此外，在胃肠消化后，各组分均出现ABTS自由基清除率上升，DPPH自由基清除率、总还原力和FRAP下降的类似趋势。另外，SCP-Ⅰ组虽然出现下降，但是仍比其余3组表现出较高的抗氧化水平。Bai等^[30]研究发现牛皮胶原多肽分子量越大，越容易被消化成小肽，DPPH自由基清除能力在肠道消化后期显著下降。曹振海等^[31]的研究结果表明经过胃肠消化后抗氧化活性下降，可能是因为胰蛋白酶将具有抗氧化活性的疏水性氨基酸从肽链中释放出来。

3 结论

本研究以橙足海参（Cucumaria frondosa）为原料，采用中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶为2∶1的复合比例进行酶解实验，采用单因素实验和响应面实验共同确定了最佳酶解工艺参数为时间5.0 h、温度50.0 ℃和pH值7.0，在此条件下，测得ABTS自由基清除率为38.43%。不同分子量段的海参多肽及其体外消化产物的抗氧化活性结果表明，当分子量＜3 000 Da时，海参多肽的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、总还原力和FRAP均大于其他3组，且具有较好的耐胃肠消化能力，能够保持良好的抗氧化能力。此外，结果显示切向流超滤技术能够有效地分离海参多肽，增强抗氧化活性。本研究为海参多肽在食品领域的添加、利用和开发提供了思路和理论支持。

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