金银花提取物对脂多糖致心肌细胞凋亡、氧化应激和炎症反应的影响

初毅 代宁 曹艳杰

摘要目的：探讨金银花提取物对脂多糖（LPS）致心肌细胞氧化应激、细胞凋亡和炎症反应的影响及分子机制。方法：将H9c2细胞分为对照（Con）组、LPS组、LPS＋金银花低剂量组、LPS＋金银花中剂量组、LPS＋金银花高剂量组、LPS＋pcDNA组、LPS＋pcDNA含山梨醇和SH3结构域连接蛋白2（SORBS2）组、LPS＋金银花高剂量＋siNC组、LPS＋金银花高剂量＋siSORBS2组。流式细胞术检测细胞凋亡；蛋白免疫印记（WesternBlot）法检测蛋白表达；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、乳酸脱氢酶（LDH）活性、肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素1（IL1）、白细胞介素6（IL6）水平。结果：金银花提取物呈剂量效应降低LPS诱导的H9c2细胞凋亡率、MDA含量、LDH活性，升高SORBS2蛋白表达、SOD活性，降低TNFα、IL1、IL6水平，差异均有统计学意义（P＜0.05）。过表达SORBS2与金银花提取物作用相同；敲除SORBS2逆转了金银花提取物对LPS致心肌细胞氧化应激、细胞凋亡和炎症反应的作用。结论：金银花提取物可能通过上调SORBS2表达抑制LPS致心肌细胞氧化应激、细胞凋亡和炎症反应。

关键词金银花提取物；心肌细胞；氧化应激；细胞凋亡；炎症反应；脂多糖；实验研究

doi：10.12102/j.issn.16721349.2024.06.011

研究表明，心肌细胞凋亡参与许多心血管疾病的发生发展过程；心肌细胞受损之后线粒体氧化应激引起的能量代谢障碍是许多心血管疾病的发病原因，且心肌损伤会引起强烈的炎症反应，进而加剧心肌细胞凋亡［13］。研究发现，中药可通过减轻线粒体损伤而抑制心肌细胞凋亡，对心肌细胞损伤具有保护作用［4］。金银花（LonicerajaponicaThunb）是中国传统的清热解毒草药，具有抗炎、抗菌等作用［5］。研究表明，从金银花中分离提取的单体化合物JX2B6和JX2B11具有抗过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡的作用［6］。金银花提取物可抑制肺组织炎性因子的产生，改善脂多糖（LPS）致大鼠急性肺损伤［7］。金银花提取物可能通过抑制活性氧（ROS）产生，进而抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体通路介导的促炎因子白细胞介素1β（IL1β）和白细胞介素18（IL18）的释放，缓解肺组织炎症损伤，从而对重症急性胰腺炎大鼠的肺损伤具有保护作用［8］。以上研究表明，金银花提取物具有抗心肌细胞凋亡作用及抗炎作用，然而其对心肌细胞氧化应激和炎症反应的影响及机制尚不清楚。含山梨醇和SH3结构域连接蛋白2（sorbinandSH3domaincontainingprotein2，SORBS2）为位于4q35.1的一种衔接蛋白，研究报道过表达SORBS2可减少LPS诱导的肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα，TNFα）和白细胞介素6（IL6）释放及细胞凋亡，提高细胞活力［9］。miR213p通过靶基因SORBS2调控LPS诱导的脓毒症心肌病［10］。因此，本实验旨在研究金银花提取物是否能够通过调控SORBS2表达影响LPS诱导的心肌细胞氧化应激凋亡和炎症反应。现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

H9c2细胞购自美国ATCC；LPS购自北京索莱宝科技有限公司；金银花提取物购自南京道斯夫生物科技有限公司；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；凋亡检测试剂盒购自美国eBioscience公司；蛋白提取试剂盒购自美国Epigentek公司；丙二醛（malonaldehyde，MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）试剂盒、乳酸脱氢酶（lacticdehydrogenase，LDH）试剂盒均购自美国Biovision公司；TNFα、白细胞介素1（IL1）、IL6酶联免疫吸附试剂盒（ELISA）购自美国Sciencell公司。

1.2细胞处理和分组

将H9c2细胞分为对照（Con）组、LPS组、LPS＋金银花低剂量组、LPS＋金银花中剂量组、LPS＋金银花高剂量组、LPS＋pcDNA组、LPS＋pcDNASORBS2组、LPS＋金银花高剂量＋siNC组、LPS＋金银花高剂量＋siSORBS2组。LPS组：H9c2细胞培养于DMEM培养基，取对数期细胞，用1μg/mL的LPS处理H9c2细胞；Con组：正常培养细胞；LPS＋金银花低剂量组：用1μg/mL的LPS和浓度为125μg/mL的金银花提取物处理细胞；LPS＋金银花中剂量组：用1μg/mL的LPS和浓度为250μg/mL的金银花提取物处理细胞；LPS＋金银花高剂量组：用1μg/mL的LPS和浓度为500μg/mL的金银花提取物处理细胞；LPS＋pcDNA组：将pcDNA转染至H9c2细胞后用1μg/mL的LPS处理；LPS＋pcDNASORBS2组：将pcDNASORBS2转染至H9c2细胞后用1μg/mL的LPS处理；LPS＋金银花高剂量＋siNC组：将siNC、siSORBS2转染至H9c2细胞后用1μg/mL的LPS和500μg/mL的金银花提取物处理；LPS＋金银花高剂量＋siSORBS2组：将siSORBS2转染至H9c2细胞后用1μg/mL的LPS和500μg/mL的金银花提取物处理。

1.3流式细胞术检测细胞凋亡

收集细胞，按试剂盒说明操作，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4蛋白免疫印记（WesternBlot）法检测蛋白表达

提取总蛋白，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），转膜、封闭，分别加一抗和二抗孵育2h，加增强化学发光试剂（enhancedchemiluminescence，ECL）显色，暗室显影、定影；分析蛋白条带灰度值，计算蛋白的相对表达量。

1.5细胞SOD活性、MDA含量和LDH活性检测

收集培养48h各组细胞上清液，按试剂盒说明书进行操作。

1.6ELISA检测TNFα、IL1、IL6水平

收集培养48h各组细胞上清，具体按照试剂盒操作进行检测。

1.7统计学处理

采用SPSS20.0软件进行分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差异法（LSD）t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1金银花提取物对LPS处理的H9c2凋亡的影响

与Con组相比，LPS组H9c2细胞凋亡率升高，SORBS2蛋白表达水平下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS＋金银花低剂量组、中剂量组、高剂量组H9c2细胞凋亡率降低，SORBS2蛋白表达水平升高，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。详见图1～图4。

2.2金银花提取物对LPS处理的H9c2中氧化应激的影响

与Con组相比，LPS组H9c2细胞中SOD活性降低，MDA含量、LDH活性升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS＋金银花低剂量组、中剂量组、高剂量组MDA含量、LDH活性降低，SOD活性升高，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。详见表1。

2.3金银花提取物对LPS处理的H9c2中炎性因子的影响

与Con组相比，LPS组TNFα、IL1、IL6水平升高（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS＋金银花低剂量组、中剂量组、高剂量组TNFα、IL1、IL6水平下降，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。详见表2。

2.4ORBS2对LPS处理的H9c2细胞氧化应激和炎性因子的影响

与LPS组和LPS＋pcDNA组相比，LPS＋pcDNASORBS2组细胞凋亡率、MDA含量、LDH活性降低，SORBS2蛋白表达水平、SOD活性升高，TNFα、IL1、IL6水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表3、图5～图8。

2.5敲除SORBS2对金银花作用的H9c2凋亡和氧化应激的影响

与LPS＋金银花高剂量＋siNC组相比，LPS＋金银花高剂量＋siSORBS2组H9c2细胞凋亡率升高，SORBS2蛋白表达水平降低，SOD活性降低，MDA含量、LDH活性升高（P＜0.05）。详见表4、图9～图12。

2.6敲除SORBS2对金银花作用于H9c2炎性因子的影响

与LPS＋金银花高剂量＋siNC组相比，LPS＋金银花高剂量＋siSORBS2组H9c2细胞中TNFα、IL1、IL6水平升高（P＜0.05）。详见表5。

3讨论

心血管疾病是危害健康的重要疾病，氧化应激、炎症反应在心血管疾病的发病机制中起重要作用［1112］。研究显示，中药具有多靶点效应，通过调节氧化应激、炎症反应等发挥保护心肌的作用［13］。有研究报道，金银花提取物可通过降低肺泡灌洗液中促炎细胞因子IL1、IL6和TNFα的释放和减轻组织脏器的损伤，对LPS诱导的急性呼吸窘迫综合征大鼠具有显著的保护作用［14］。金银花提取物通过抑制小鼠的肝星状细胞激活，逆转上皮细胞间充质转化（EMT）并通过诱导Nrf2激活减少肝脏损伤，从而减轻小鼠肝纤维化［15］。金银花提取物可通过激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子κB（NFκB）信号通路来抑制小胶质细胞的炎症反应［16］。本研究通过建立心肌细胞损伤模型，用不同剂量金银花提取物处理，发现细胞凋亡率、MDA含量、LDH活性、TNFα、IL1、IL6水平降低，SORBS2蛋白表达水平、SOD活性升高，且呈浓度依赖性，表明金银花提取物能抑制LPS诱导心肌细胞损伤。

有研究显示，SORBS2在心肌梗死病人组织中表现出异常降低［17］。LncRNAH19通过调节miR935p/SORBS2轴来抑制败血症诱导的心肌损伤的进展［18］。本研究显示，LPS诱导可降低心肌细胞中SORBS2蛋白表达，过表达SORBS2可降低LPS诱导的心肌细胞凋亡率、氧化应激及炎性因子水平。金银花提取物可提高SORBS2的表达，而敲除SORBS2逆转了金银花提取物对LPS致心肌细胞氧化应激、细胞凋亡和炎症反应的作用。

综上所述，金银花提取物可通过增加SORBS2减轻LPS致心肌细胞氧化应激、凋亡和炎症反应。

参考文献：

［1］徐标，孙璇.炎症在心肌损伤和修复中的作用［J］.临床心血管病杂志，2018，34（7）：633635.

［2］CHISTIAKOVDA，SHKURATTP，MELNICHENKOAA，etal.Theroleofmitochondrialdysfunctionincardiovasculardisease：abriefreview［J］.AnnalsofMedicine，2018，50（2）：121127.

［3］WANGXW，GUOZK，DINGZF，etal.Inflammation，autophagy，andapoptosisaftermyocardialinfarction［J］.JournaloftheAmericanHeartAssociation，2018，7（9）：e008024.

［4］杨雪芹，王炜，杨爱东，等.中药干预线粒体途径抑制心肌细胞凋亡的研究进展［J］.上海中医药杂志，2019，53（5）：98101.

［5］CHENWC，LIOUSS，TZENGTF，etal.WoundrepairandantiinflammatorypotentialofLonicerajaponicainexcisionwoundinducedrats［J］.BMCComplementaryandAlternativeMedicine，2012，12：226.

［6］潘晓冬.金银花和玄参抗心肌细胞凋亡作用及机制研究［D］.哈尔滨：哈尔滨医科大学，2014.

［7］唐陆平，李伟豪，袁生.金银花提取物改善脂多糖致大鼠急性肺损伤作用机制研究［J］.畜禽业，2019，30（10）：13.

［8］吴瑞霞，黄粮，白玉鹏，等.MiR153通过靶向SORBS2促进LPS诱导的心肌H9C2细胞损伤［J］.中国病理生理杂志，2020，36（1）：2228.

［9］王惠.MicroRNA213p通过靶基因SORBS2调控LPS诱导的脓毒症心肌病［D］.南京：南京医科大学，2016.

［10］阮辉辉，卫巍，许永富.金银花提取物对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠ROSNLRP3炎症小体信号通路的影响［J］.中国中医急症，2019，28（8）：13441348.

［11］GARCAN，ZAZUETAC，AGUILERAAGUIRREL.Oxidativestressandinflammationincardiovasculardisease［J］.OxidativeMedicineandCellularLongevity，2017，2017：5853238.

［12］STEVENS，FRENISK，OELZEM，etal.Vascularinflammationandoxidativestress：majortriggersforcardiovasculardisease［J］.OxidativeMedicineandCellularLongevity，2019，2019：7092151.

［13］薛慧文，胡超群，郑书臣，等.中药保护心肌的活性成分（部位）及作用机制研究进展［J］.药物评价研究，2019，42（8）：16851688.

［14］王华，迟琼，熊石龙，等.金银花提取物对LPS致ARDS大鼠肺炎症影响的研究［J］.广东药科大学学报，2017，33（3）：379382.

［15］MIAOH，ZHANGY，HUANGZL，etal.Lonicerajaponicaattenuatescarbontetrachlorideinducedliverfibrosisinmice：molecularmechanismsofaction［J］.TheAmericanJournalofChineseMedicine，2019，47（2）：351367.

［16］HANMH，LEEWS，NAGAPPANA，etal.FlavonoidsisolatedfromflowersofLonicerajaponicathunb.inhibitinflammatoryresponsesinBV2microglialcellsbysuppressingTNFαandILβthroughPI3K/Akt/NFκBsignalingpathways［J］.PhytotherapyResearch，2016，30（11）：18241832.

［17］KAKIMOTOY，ITOS，ABIRUH，etal.SorbinandSH3domaincontainingprotein2isreleasedfrominfarctedheartintheveryearlyphase：proteomicanalysisofcardiactissuesfrompatients［J］.JournaloftheAmericanHeartAssociation，2013，2（6）：e000565.

［18］SHANB，LIJY，LIUYJ，etal.LncRNAH19inhibitstheprogressionofsepsisinducedmyocardialinjuryviaregulationofthemiR935p/SORBS2axis［J］.Inflammation，2021，44（1）：344357.

（收稿日期：20220921）

（本文编辑郭怀印）

作者单位1.河北省保定市第一医院（河北保定071000），Email：yoyonaa@126.com；2.河北省保定市清苑区人民医院

引用信息初毅，代宁，曹艳杰.金银花提取物对脂多糖致心肌细胞凋亡、氧化应激和炎症反应的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（6）：10271032.