春大白菜可溶性糖代谢及转运相关基因表达模式分析

陈熙　程斐　倪润茂　刘维信　刘倩倩

摘要：以春大白菜品种‘吉锦和‘华耐为材料，探索了春大白菜从幼苗期到叶球收获期的整个发育过程中可溶性糖类的积累变化规律及相关代谢酶和转运蛋白基因的表达模式。结果表明：在春大白菜发育过程中，可溶性总糖和葡萄糖在莲座期和结球初期快速积累，葡萄糖积累占优势，果糖则在结球后期结球叶的叶柄中含量快速增加。莲座叶和结球叶的柄部都是可溶性糖积累的重要部位；蔗糖合酶基因BrSUS1与两个品种叶柄中可溶性糖积累密切相关。分解蔗糖的酶基因BrSUS5、BrSUS6、BrCINV2及糖转运蛋白基因BrSUC4、BrTMT1、BrSWEET17、BrERDL6-16均在叶柄部位活跃表达，不同程度参与两个白菜品种的可溶性糖积累和分布。BrERDL6-16在两种白菜结球后期多个部位中的表达量急剧升高，可能在促进大白菜叶球发育中发挥特殊作用。本研究结果可为从分子水平调控大白菜可溶性糖积累分配及产量形成提供理论依据。

关键词：春大白菜：可溶性糖代谢与转运：基因表达

中图分类号：S634.1：Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）03-0019-13

大白菜是十字花科芸薹属蔬菜作物，不仅口感好且具有一定药用价值，在我国各地广泛栽培。春大白菜是大白菜的重要栽培類型，能够调节蔬菜的淡季供应，且市场价格高、效益好，但当前春大白菜的营养和风味品质仍不能满足消费者日益提升的需求。乔旭光等在对大白菜风味相关指标的通径分析中指出，可溶性糖对大白菜的感官品质影响最大。园艺产品中的甜味主要取决于可溶性糖的类型和组成。蔗糖是可溶性碳水化合物的主要长距离运输形态，葡萄糖、果糖是参与蔗糖代谢的主要糖类。Liu等研究发现秋冬季收获的大白菜叶球中葡萄糖、果糖含量高于蔗糖，且果糖的积累量高于葡萄糖。但春大白菜生长前期温度偏低，后期温度又快速升高，适合春大白菜生长的时间较短，其可溶性糖类积累可能与秋季播种的大白菜不同。目前对春大白菜的研究主要集中于温度对生长的影响、耐抽薹品种选育及栽培管理技术的提升等方面，缺少对其碳水化合物积累和分布的系统研究，而明晰春大白菜的可溶性糖代谢及相关基因功能将有助于从生理及分子水平对大白菜叶球产量及品质形成进行调控。

光合产物蔗糖从源到库的运输是植物生长的主要决定因素之一，不仅可通过韧皮部运输实现植物器官之间的碳分配，而且蔗糖在库端卸载时被酶解为己糖，为植物组织的生长提供动力。因此糖代谢酶及糖转运相关基因在植物的能量供应和物质存储中发挥重要作用。大白菜有表面褶皱的叶片及宽大的中脉（叶柄），Lee等通过研究大白菜莲座叶的叶片和叶柄中淀粉和蔗糖的日分布变化认为，大白菜源库代谢存在于同一片叶中，除了跨膜运输，叶柄组织可能直接通过共质体途径（胞间连丝）获取部分光合产物。但已有的针对局部组织的研究结果不能从整体上反映大白菜发育过程中糖类的积累和分配。

本研究选取不同结球类型的春大白菜，对幼苗期到收获期不同位置叶组织中可溶性糖类的积累动态进行探究，并分析蔗糖代谢酶和糖转运蛋白相关基因在转录水平上的变化与大白菜可溶性糖积累的关系，为从分子水平调节大白菜可溶性糖积累与分配进而提升大白菜品质及产量提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和样品采集

试验材料为中型结球大白菜‘吉锦和小株型大白菜‘华耐，于2021年3月25日在青岛农业大学试验田露地播种。小区面积160m2（10m×16m），采用随机区组排列，最终株行距为6cm×6cm。所有材料的水肥、除虫管理均采用同一标准控制。

根据春大白菜的不同发育阶段，分别于幼苗期（播种后26天，记为26DAS）、莲座期（44DAS）、结球初期（54DAS）、结球后期（67DAS）采集样本。其中，幼苗期取2-3片幼嫩叶片（L，leaf）；莲座期、结球初期取由外到内第1-3片莲座叶的叶片（external leaf，EL）和叶柄（external midrib.EM），以及由内到外第4-6片叶（长度超过3cm）的叶片（internal leaf，IL）和叶柄（internal midrib，IM）；结球后期IL、IM、EL、EM的取样同莲座期，另取外部1-3片球叶的叶片（middle leaf，ML）和叶柄（middle midrib，MM）。采样均在上午10时进行，设3次重复：采集的样品迅速置于液氮中冷冻，并带回实验室在-80℃储存，以备可溶性糖含量测定和qRT-PCR分析。两个春大白菜品种不同时期的形态见图1。

1.2 可溶性糖类含量的测定方法

可溶性总糖含量通过蒽酮比色法测定。蔗糖、葡萄糖和果糖参照Liu等的方法采用高效液相色谱（HPLC）法进行测定，所有样品均经过冷冻干燥。

1.3 糖代谢及转运相关基因的表达分析

根据青岛农业大学十字花科蔬菜遗传育种实验室已获得的大白菜叶球转录组数据，以log2（Fold change）≥1.0和FDR＜0.01为标准，选取在大白菜叶球不同部位表达有差异的23个糖代谢和转运相关基因进行qRT-PCR分析。使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取样品的总RNA，取1μg RNA，用Prime ScriptTMRT试剂盒合成cDNA。使用罗氏480实时PCR系统在标准模式下进行qRT-PCR。PCR反应体系为20μL：2xSYBR Creen I Master 10 μL，1：10稀释的cDNA 2μL，正、反向引物各0.4μL和双蒸馏水7.2μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃15 s.60℃30 s，72℃30 s，45个循环。选择延伸因子-1-α（EF-1-α，登录号为G0479260）作为参考基因。使用软件Primer Primier 6.0（Premier Biosoft Inc.）设计特异性引物，引物序列见表1。试验设置3次重复，用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.4 数据处理与分析

使用SPSS 22.0进行单因素方差分析（ANO-VA），用最小显著性差异（LSD）法进行多重比较，显著性水平为0.05。所有图表均使用OriginPro 8和Microsoft Excel 2010进行绘制。

2 结果与分析

2.1 大白菜发育过程中的可溶性糖类含量变化

‘吉锦和‘华耐不同部位的可溶性总糖含量在整个生育期的变化相似（图2A、B）。莲座期至叶球形成阶段，叶柄中的可溶性总糖含量均显著高于相应部位的叶片：结球后期两个品种外部球叶和内部球叶的叶柄（MM和IM）中可溶性总糖含量达到最高，且差异不显著。

与叶片相比，两个春大白菜品种叶柄的葡萄糖和果糖含量也占优势，表现出部位特异性（图2C、D、E、F）。幼苗期后，春大白菜中葡萄糖的积累量总体高于果糖。叶柄中的葡萄糖含量均显著高于相应叶片中的。结球后期，葡萄糖在两个品种内部球叶的叶片（IL）及‘华耐内部球叶的叶柄中（IM）积累量升高，果糖则在结球后期的内部叶柄（IM）中均显著上升。

蔗糖含量在两个大白菜品种整个生长阶段均处于极低水平，不超过组织干重的3%，且在最外部莲座叶的叶片（EL）及内部球叶的叶柄（IM）中含量较高（图2G、H）。说明蔗糖在大白菜主要光合叶（莲座叶）中合成，运输到生长旺盛的部位后被快速利用。

2.2 春大白菜发育过程中蔗糖代谢相关基因的表达模式分析

qRT-PCR分析结果（图3）显示，进入莲座期（44DAS）后，负责蔗糖卸载的蔗糖合酶基因Br-SUS1在两个春大白菜品种叶柄中的表达均显著上调，其中，‘吉锦在结球初期（54DAS）的IM中表达量最高，是莲座期IM中的2.70倍，在结球后期（67DAS）IM中的表达量次之，两者间差异不显著：‘华耐则在结球后期IM中的表达量显著上升。BrSUS5和BrSUS6的表达也表现出一定的组织特异性，在‘华耐中尤其明显，表现为叶柄中的表达量高于相应部位的叶片，以莲座期和结球初期莲座叶的叶柄（EM）中表达量较高。

转化酶基因BrCWI3、BrINV4和BrINVC在两个春大白菜品种中的表达呈现不同的变化趋势，且BrCWI3、BrINV4在‘吉锦中的表达量高于‘华耐，而BrINVC在‘华耐结球后期的表达量较高。其中，BrCWI3分别在‘吉锦结球初期的EL及‘华耐结球后期的MM中显著上调表达：Br-INV4和BrINVC分别在‘吉锦和‘华耐结球后期的MM和ML中显著上调表达，而在内部球叶（IL和IM）中的表达量始终保持较低水平。

细胞质中的BrCINV2基因从莲座期开始在两个春大白菜品种各部位叶片的叶柄中表达量迅速升高，在结球后期保持较高水平。负责蔗糖合成的BrSPS1和BrSPS4在莲座叶的叶片（EL）中具有显著的表达优势，而在内部球叶的叶柄中几乎不表达：进入结球后期，两基因在EL中的表达水平显著下降，但在ML中的表达量显著升高，这可能与该时期外部球叶承担主要的光合作用有关。

2.3 春大白菜发育过程中糖转运蛋白相关基因的表达模式分析

2.3.1 蔗糖转运蛋白基因BnSUCs

对大白菜蔗糖转运蛋白基因（BrSUCs）家族4个成员——BrSUC1、BrSUC2、BrSUC3和BrSUC4的表达情况进行分析，结果如图4所示。可见，BrSUC1在‘吉锦莲座叶的叶片（EL）中表达量显著高于同时期其他部位，且在結球初期的表达量最高，是幼苗期叶片（L）中的7.07倍，其次是结球后期（67DAS）；‘华耐中BrSUC1在结球后期的EL中表达量最高，而在内部球叶中的表达水平较低。BrSUC2主要在春大白菜叶片中表达，但在两品种中的表达水平总体偏低，相较于幼苗期（L），仅‘吉锦莲座期和叶球形成期EL中的表达量显著上调，而在内部球叶的叶柄中几乎不表达。进入莲座期后，BrSUC3和BrSUC4在‘吉锦各部位的表达量迅速升高，显著高于幼苗期，且分别在结球后期的ML和结球初期的EM中表达量最高：在‘华耐中，BrSUC3和BrSUC4的表达量在结球初期也开始增加，且均在结球后期的MM中表达量最高。说明蔗糖转运蛋白能够加强光合产物的运输，在大白菜叶球发育过程中发挥作用。

2.3.2 糖转运蛋白基因BrSWEETs

分析了4个糖转运蛋白基因BrSWEET1、BrSWEET11、Br-SWEET12、BrSWEET17在两个春大白菜品种中的表达差异，结果如图5所示。

SWEET1蛋白具有双向转运葡萄糖的功能。BrSWEET1在两个春大白菜品种中的表达呈现明显的组织特异性，即在各时期叶片中的表达量均显著高于叶柄中，且以结球后期内部球叶的叶片中表达水平最高。

BrSWEET11和BrSWEET12主要负责在韧皮部装载蔗糖向外输出。两个基因在‘吉锦莲座期和结球初期的EL中大幅上调表达，相对表达量显著高于幼苗期。Br.SWEET11在莲座期和结球初期表达量分别是幼苗期的36.68倍和43.57倍，而BrSWEET12则分别达到57.67倍和81.51倍，表明两基因在‘吉锦，快速生长期将光合产物从源叶输出的过程中发挥重要作用。在小株型春大白菜‘华耐中，BrSWEET11和BrSWEET12也在光合叶片（EL和ML）中表达占优势，但相比于幼苗期，BrSWEET11在莲座期和叶球形成期显著下调表达，BrSWEET12在莲座期和结球初期的EL和结球后期的ML中显著上调表达，在ML中的表达量最高，但仅是幼苗期的1.96倍。

BrSWEET17定位在液泡膜上，能够向液泡外输出果糖，从而维持细胞内部果糖的稳态。Br-SWEET17在两个春大白菜品种快速生长期（莲座期和结球初期）的莲座叶叶柄（EM）中大量表达，尤其在结球初期的EM中，表达量可达幼苗期L的140倍（‘吉锦）和70倍（‘华耐）。在结球后期，该基因的表达量迅速下降，但仍以叶柄中的表达量高于叶片中。说明BrSWEET17对果糖的分配调节在大白菜生长及叶球形成过程中也发挥着重要作用。

2.3.3 单糖转运蛋白相关基因

单糖转运蛋白STP1主要在葡萄糖吸收中发挥作用，H+/葡萄糖同向转运体ERDL6负责向液泡膜或质膜外输出葡萄糖，PGLCT4则参与葡萄糖输出：TMT是液泡膜单糖转运蛋白，能够将己糖和蔗糖转入液泡。对这些单糖转运蛋白基因在两个春大白菜品种中的表达模式进行分析，结果（图6）显示，BrSTP1在两个品种莲座叶和外部球叶的叶片中表达量上升。BrPGLCT4在‘吉锦，快速生长期的EL中表达量增加幅度较大，而在‘华耐中则是叶球形成期IL中的表达量较高，两者分别在莲座期的EL和结球初期的IL中达到最高。BrTMT1在两个品种快速生长期的EM中表达量较高：对于‘华耐，内部球叶叶柄中的表达水平也有升高：结球后期叶球内部各组织中该基因的表达量较幼苗期显著上升。BrTMT2在‘吉锦莲座叶片（EL）及外部结球叶（ML和MM）中的表达量显著升高，其余部位较幼苗期表达水平变化不大：而在‘华耐各组织中，BrTMT2表达量相对较低，且整个发育时期相对稳定。BrERDL6-4在‘吉锦不同生长时期的表达变化无明显组织特异性，在结球初期的EL、莲座期的EM和结球后期的ML中表达量显著高于幼苗叶中：而在‘华耐中，幼苗期后该基因在植株中的表达量显著降低，尤其结球后期在各部位的表达均处于极低水平。BrERDL6-16在两个品种结球后期的EM、ML、MM中表达量超过幼苗期的1000倍以上，其中，‘吉锦ML和‘华耐EM中的表达量分别是幼苗期叶片中的2772倍和4060倍，IM中的表达量也升高了3（X）-500倍：在‘吉锦莲座期和结球初期的EM中，BrERDL6-16表达量也显著升高，较幼苗期分别增加了90.48倍和226.56倍。

2.4 可溶性糖积累和糖代谢及转运相关基因的相关性分析

基于上述基因表达结果，进一步利用Pearson相关性分析方法研究这些酶和转运蛋白基因的表达与大白菜发育过程中可溶性糖含量变化之间的关系。结果（图7）显示，两春大白菜品种的果糖、葡萄糖均与总可溶性糖积累呈极显著正相关（P<0.01）。在‘吉锦中，BrSUS1与总可溶性糖含量的变化呈极显著正相关，BrSUS1和BrSWEET17与葡萄糖含量的变化呈显著正相关（P<0.05）；此外，部分酶基因（BrSUS5、BrSUS6、BrINV4、BrCINV2）与转运蛋白基因（BrSUC3、BrSUC4、BrT-MT1、BrERDL6-16）的表达也与可溶性总糖含量变化存在正相关关系。在‘华耐中，BrSUS1的表达与可溶性总糖及各组分含量的正相关性均达到极显著水平，BrSUS5、BrTMT1与可溶性总糖、葡萄糖和蔗糖含量变化均显著正相关，BrSUS6、BrCINV2与可溶性总糖和蔗糖含量变化显著正相关，BrSUC3、BrSUC4则均与可溶性总糖含量的变化显著正相关。综合来看，在两个品种春大白菜生长发育过程中，BrSUS1与可溶性糖卸载与积累密切相关，其余代谢酶及蔗糖和单糖转运蛋白基因也不同程度参与大白菜叶片发育过程中糖的转化与运输，但这些基因在在不同结球类型的白菜中发挥作用的阶段和程度存在差异。

3 讨论与结论

3.1 春大白菜发育过程中可溶性糖的积累特征

植物通过光合作用将无机碳同化为糖类来满足生长发育的能量需要。本研究对中型结球春大白菜‘吉锦和小株型春大白菜‘华耐生长发育过程中糖类的积累及分布规律进行分析发现，在大白菜的快速生长阶段（莲座期和结球初期），可溶性总糖含量在叶柄部位均快速积累，而能够进行光合作用的叶片部位如EL、IL中的可溶性总糖含量始终稳定在较低水平。说明大白菜光合组织中固定的碳大部分输出到生长旺盛的部位用于组织的生长发育，这与拟南芥中的报道相似。在去除水分的组织样品中，莲座叶的叶柄（EM）与内部球叶的葉柄（IM）都是可溶性总糖分布的优势部位，在快速生长期EM中的含量甚至超过内部组织。这与前期我们以新鲜样品获得的研究结果不同，这主要是因为EM和MM中含水量可达90%，因此在叶球形成过程中相应的可溶性糖含量的鲜重占比远低于内部球叶，不超过1.5%。从碳水化合物的积累来说，本研究结果进一步反映出大白菜外部叶柄作为库组织的重要地位。大白菜叶柄部着生于短缩茎上，短缩茎先端是细胞分裂及叶形态建成最活跃的区域。光合叶片合成的蔗糖能够在同一片叶的柄部快速卸载，并近距离转运到短缩茎及根部，因此莲座叶包括外部结球叶的叶柄既是库组织，也是糖类向其他异养组织输出的重要部位。

两个春大白菜品种整个生长过程中以葡萄糖和果糖积累为主，葡萄糖积累占优势，蔗糖积累则始终保持在较低水平。而在拟南芥中，蔗糖是莲座叶中的主要糖类，其次为葡萄糖。大白菜植株体积大，叶片多，生长周期短，推测光合组织中合成的蔗糖被快速输出的同时，莲座叶自身生长也会消耗大量光合产物，因此蔗糖在整个时期积累量较低。在两个春大白菜品种莲座期至结球后期（收获期）的叶柄中葡萄糖始终保持稳定的含量，可占到干重的20%。葡萄糖是经植物光合作用产生的可直接利用的糖类，也是储存能量的重要来源。本研究结果显示，葡萄糖在春大白菜莲座期、结球期初期和后期的叶柄中均具有较高的积累量，可为生长发育旺盛的库组织提供持续的能量供给。果糖作为蔗糖分解的另一种己糖产物，在收获期春大白菜叶球组织中的含量显著升高。可溶性总糖在结球后期的球叶柄部（MM和IM）积累量达到最高水平，推测与该时期果糖迅速积累相关。成熟期果糖的积累对桃果实甜度起着重要的作用。因此，若要提升大白菜叶球的甜度口感，可以针对叶球中果糖的代谢调节展开研究。

3.2 蔗糖代谢相关酶基因及转运蛋白基因在春大白菜生长发育过程中的作用差异

负责蔗糖合成、分解的相关酶类在光合产物转化及利用中起到关键作用。在梨和葡萄中，SUS1主要在未成熟果实中负责蔗糖分解，并为细胞壁构建或糖酵解提供底物。与大白菜秋季结球过程中的表达模式相似，BrSUS1作为重要的蔗糖库端卸载酶，在春大白菜叶柄中有显著的上调表达，并与可溶性糖积累显著正相关，因此，调控BrSUS1的表达，可能对调节大白菜叶球发育及产量产生重要影响。多个蔗糖转化酶基因在两个春大白菜品种中的表达模式不同，但除胞质转化酶基因BrCINV2外，其余转化酶基因在内部球叶组织（IL和IM）中的表达量均较低，与SUS基因发挥作用的部位存在差异。进入莲座期后，BrCINV2在两个春大白菜品种叶柄及内部球叶的叶中表达量均快速升高，推测其在维持大白菜光合产物卸载利用中也具有积极意义。在拟南芥中，AtCINV2可能在维持植株正常生长并将固定的碳向非光合组织供应方面发挥重要作用。因此，BrCINV2对春大白菜生长发育的影响值得进一步研究。

糖从源到库的运输以及胞内糖的分配利用也是植物生长的主要决定因素之一。整个植物体碳水化合物的分配需要膜上特定糖转运蛋白发挥作用，蔗糖转运蛋白SUCs以及SWEETII和SWEET12主要负责蔗糖的韧皮部装载及转运。在本研究中，在春大白菜快速生长期，BrSUC1-BrSUC4、SWEET11和SWEET12在外部叶组织中表达水平升高，可能不同程度地参与了蔗糖的源端装载。随着春大白菜植株的不断生长，上述基因表达量在‘吉锦中上升的幅度均大于小株型白菜‘华耐，推测叶球较大的白菜类型需要更高效的蔗糖装载及输出才能满足植株快速发育的需求，这为后续大白菜生长发育调控的研究提供了一个新的角度。进入结球后期，BrSUC4在‘吉锦外部和内部不同叶组织中表达水平都有提升，在‘华耐中也整体升高。AtSUC4在拟南芥源叶的次级叶脉中高水平表达，负责该部位蔗糖的高通量装载与运输，在库端组织如幼叶、花和果实中也表达活跃，负责蔗糖吸收。BrSUC4可能在大白菜结球过程中发挥着多方面的作用。

在负责己糖转运的蛋白中，SWEET17能在液泡膜上顺浓度梯度输出果糖，调节胞质中的果糖稳态，而TMT1是胞质葡萄糖稳态所必需的，参与液泡单糖转运。BrSWEET17和BrTMT1在快速生长期的春大白菜叶柄部位表达量占优势，可能在大白菜库组织的己糖储存与利用中发挥作用。ERDL6-16属早期响应干旱类似蛋白（ERDL6）家族，是液泡膜上的另一类糖转运蛋白，该类蛋白主要负责液泡中葡萄糖的外排，参与植物响应胁迫及体内糖的稳态和积累。BrERDL6-16在两个类型春大白菜结球过程中均有异常活跃的表达，尤其在结球后期的EM、ML、MM中表达量上调1000-4000倍，推测其可能对叶球发育过程中的能量分配与利用具有重要影响。

综上所述，莲座叶和结球叶的叶柄是春大白菜重要的库器官。葡萄糖在叶柄中快速积累，保证了生长旺盛的库组织的稳定能量供给：成熟期果糖的积累提升了春大白菜叶球可溶性糖的总含量；蔗糖分解酶和糖转运蛋白都参与了大白菜可溶性糖的代谢，但发挥作用的阶段和程度存在差异。本研究结果可为大白菜品质及产量调控提供理论依据。

基金项目：中央引导地方科技发展专项计划项目（23-1-3-5-zvvd-nsh）；山東省重点研发计划项目（2019GNC106009）；山东省农 业良种工程项目（2019LZGC006）