一株裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其生物学特性与全基因组分析

张雪丽　于浩淼　闫振贵　杨少华　张亮　杨宏军

摘要：本研究旨在分离能够高效裂解耐药金黄色葡萄球菌的噬菌体，为噬菌体生物制品的研制提供候选材料。以耐氨苄西林金黄色葡萄球菌为宿主菌，用双层平板法分离噬菌体，通过透射电子显微镜观察噬菌体形态，并对其进行生物学特性分析及全基因组测序分析。结果分离得到一株金黄色葡萄球菌噬菌体，效价达2.75×1010PFU/mL，命名为SP688。该噬菌体具有长的不收缩尾巴，属长尾噬菌体科，对7株耐氨苄西林金葡菌均有裂解效果，最佳感染复数为1，可在10h内抑制细菌生长，在温度-20-54℃范围和pH值3-11之间活性稳定，对紫外线敏感。全基因组分析显示，SP688基因组为环状DNA，全长45499kb，GC含量为34.1%；预测到64个开放閱读框（ORFs），其中19个（29.69%）被预测功能。该噬菌体是一株新型裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的广谱噬菌体，可为噬菌体治疗提供材料。

关键词：金黄色葡萄球菌；噬菌体；形态：生物学特性分析；全基因组分析

中图分类号：S852.6 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）03-0132-07

金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一。随着抗生素的广泛应用，金黄色葡萄球菌的耐药性不断增加，致使抗生素治疗效果不理想，奶牛乳腺炎难以得到控制和根除。同时，抗生素残留所引起的弃奶进一步加剧了养殖场的经济损失。在国家提倡“减抗替抗”的政策引导下，需要有新的制剂用于奶牛乳腺炎的防治。

噬菌体是一类侵袭细菌的病毒，具有独特的裂解机制和严格的宿主特异性，同时具有增殖速度快、研发时间短、高效裂解耐药细菌等优点。随着对噬菌体研究的不断加深，一些可裂解多重耐药细菌的噬菌体被发现，如可裂解金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌等。作为一种安全的生物制剂，噬菌体对于未来多重耐药性细菌感染的治疗具有重要意义。

本研究以从临床乳腺炎的奶牛乳汁中分离到的耐氨苄西林的金黄色葡萄球菌为宿主进行噬菌体的分离筛选，对筛选出的噬菌体进行生物学特性分析及基因组分析，以期为金黄色葡萄球菌噬菌体的研究及其对奶牛乳腺炎的治疗防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株及污水

供试菌株均由山东省农业科学院草食家畜疫病防控创新团队分离保藏，金黄色葡萄球菌分离于临床乳房炎患牛乳汁样品，部分大肠杆菌分离于环境样品。污水来源于济南某规模化奶牛场粪污水混样。

1.1.2 主要试剂和仪器

LB肉汤培养基购白北京陆桥技术股份有限公司：噬菌体基因组提取试剂盒购白上海尚宝生物科技有限公司：DNA酶l（DNase I）、RNA酶A（RNase A）及绿豆核酸酶（Mung Bean Nuclease）购白北京阿匹斯生物科技有限公司：0.22μm细菌滤器购自Merck Millipore公司。冷冻高速离心机、动态酶标仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司：JEM-2100 Plus透射电子显微镜（electron microscope，EM）购自日本电子株式会社。

1.1.3 缓存液

参照文献[9]配制SM缓存液，配方略有调整，不加入明胶。121℃高压灭菌15mm，4℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 噬菌体的富集

将污水混样12000r/min离心15min除杂，收集上清液。使用0.22μm滤器过滤上清液，4℃保存备用。将处于对数生长期的宿主菌、污水上清液、无菌LB肉汤培养基按1：5：10体积比充分混匀，于37℃、180r/min摇床培养24h，离心过滤，备用。

1.2.2 噬菌体的纯化

参照双层平板法分离噬菌体，用无菌针头挑取单个噬菌斑到2mL无菌离心管中，加入1mL SM缓存液充分混匀，4℃过夜。次日离心过滤，将滤液连续10倍梯度稀释至10-10。重复上述操作3-4次，直至得到大小均匀、边缘清晰、透亮的噬菌斑。

1.2.3 噬菌体效价测定

将纯化好的噬菌体连续10倍梯度稀释，每个浓度取100μL，用双层平板法培养得到噬菌斑，选择噬菌斑生长范围在20-300个的平板进行计数。每个浓度梯度做3个重复，取平均值计算噬菌体效价。噬菌体效价（PFU/mL）=噬菌斑平均数×稀释倍数×10。

1.2.4 噬菌体的电镜观察

取100μL纯化后的噬菌体（106PFU/mL）滴加到干净的膜上，将铜网放入噬菌体液中静置20min取出，自然吸收20s后吸去多余液体。用醋酸铀染液染色，2min后取出并吸去残留的染液，洗涤干燥。接着放入另1滴醋酸铀染液中复染，2min后取出，吸去残留染液，干燥后透射电镜观察噬菌体形态。

1.2.5 噬菌体的最佳感染复数

参照Niu等的方法，将噬菌体浓缩液（1×109PFU/mL）连续10倍稀释至103PFU/mL，每个浓度噬菌体稀释液各取100μL与宿主菌（1×106CFU/mL）1：1共同接种到96孔板中，每浓度设3个重复。37℃温箱中培养6-10h。以细菌组为阴性对照、SM缓冲液组为空白对照。培养结束后，记录无细菌生长孔的最低噬菌体浓度，即微孔内培养液呈澄清透明，无弥散状浑浊或丝状沉淀。同时测波长600nm处吸光值（OD600）。噬菌体一宿主试验的感染复数MOI=每孔噬菌体数／每孔细菌数。

1.2.6噬菌体裂解动力学

参照Niu等的方法，将噬菌体浓缩液（1×109PFU/mL）连续10倍稀释，吸取每浓度噬菌体稀释液100μL加入96孔板中，每孔加入100μL宿主菌（106CFU/mL）混合均匀，每个浓度设3次重复，以细菌组为对照。370C孵育18-20h，并使用动态酶标仪每小时动态读取OD600值，绘制曲线。

1.2.7 噬菌体的裂解谱测定

将除宿主菌外的15株大肠杆菌和39株金黄色葡萄球菌活化，培养至对数生长期，各取100μL菌液制双层平板，使用点板的方法，取噬菌体液5-10μL滴加到平板表面。37℃过夜培养，次日观察噬菌斑的形成情况。

1.2.8 噬菌体的抗逆性测定

热稳定性：将初始浓度为109PFU/mL的噬菌体液分装到2mL的EP管中，分别置于-20、4、25、37、46、54、60、70、90℃温度中处理1h。以处理前噬菌体液为阴性对照。处理后的噬菌体液通过双层平板法测定效价。每处理组设3个重复。

紫外线稳定性：将初始浓度为109PFU/mL的噬菌体液，分装到2mL的EP管中。分别在紫外线下照射10、20、30min，以未照射处理组为阴性对照，双层平板法测定效价。每处理组设3个重复。

pH稳定性：用H2SO4和NaOH调节SM缓冲液至pH值为3、5、6、7、8、11、13。将噬菌体液（109PFU/mL）分别与不同pH缓冲液等体积混合作为不同试验组，与SM缓冲液原液等体积混合作为阴性对照组，37℃静置孵育1h后，采用双层平板法测定处理后噬菌体的效价。每处理组设3个重复。

1.2.9 噬菌体全基因组的测序与分析

利用噬菌体基因组DNA提取试剂盒获得噬菌体DNA，委托上海派森诺生物科技有限公司完成基因组测序。参照HHMI SEA-PHAGES噬菌体基因组学指南对噬菌体的基因组进行建库、测序、组装和基因注释（https：//seaphagesbioinformatics.helpdocsonline.com/home）。采用Illumina TruSeq NanoDNA Sample Prep Kit方法构建文库。使用ABVSS（http：//www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss）拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，得到最优组装结果。把reads比对到组装好的基因组序列上，统计组装序列的GC含量和reads覆盖深度。运用GapCloser（https：／／sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/Gap-Closer/）软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正。使用GeneMarkS软件对测序的基因组进行编码基因预测。采用Rcirclize包绘制基因组圈图。通过BLAST（basic local alignment searchtool）与NCBI中已有的33株金黄色葡萄球菌噬菌体进行基因组比较分析。

1.3 数据统计与分析

使用GraphPad 6软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），对试验数据进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 噬菌體的分离

通过双层平板法从牛场污水混样中分离得到一株金黄色葡萄球菌噬菌体，命名为SP688。可见在含有宿主菌的双层平板上形成较大噬菌斑，边缘整齐无晕环，形态均一，清晰透亮，平均直径大小2.5mm（图1）。

2.2 噬菌体效价测定

将纯化后的噬菌体连续10倍梯度稀释，通过双层平板法计算各浓度梯度噬菌斑个数。经多次平行试验后，得出SP688噬菌体效价为2.75×1010PFU/mL。

2.3 噬菌体电镜形态观察

在透射电镜下观察SP688噬菌体的形态（图2）发现，其头部呈多面体结构，具不收缩的长尾，尾端有明显的纤突结构：总长413.40nm，头部的长度和宽度分别为102.1nm和59.51nm，尾巴的长度为291.52nm，爪子的宽度和长度分别为33.08nm和19.78nm。

2.4 最佳感染复数测定

将不同浓度的噬菌体稀释液与宿主菌共同培养后，通过对微孔浊度的观察，发现在MOI为1时，微孔内液体澄清透亮，无弥散状浑浊。同时测定OD600数值，在MOI为1时，与细菌组比较差异显著。结合两方法结果，SP688最佳感染复数为1（图3）。

2.5 噬菌体裂解动力学

将不同浓度噬菌体与宿主菌共同培养，通过动态酶标仪每小时记录OD600值，绘制噬菌体的裂解动力学曲线（图4）。结果显示，SP688噬菌体可一定程度抑制细菌的生长速度，减少细菌数，高浓度噬菌体在10h内能完全抑制细菌的生长。

2.6 噬菌体的裂解谱测定

通过双层平板法测定噬菌体对54株临床分离细菌的裂解作用，得到噬菌体裂解谱（表1）。噬菌体SP688裂解谱范围较宽，可裂解9株金黄色葡萄球菌，其中7株对氨苄西林有耐药性。宿主特异性较强，对大肠杆菌无裂解作用。

2.7 噬菌体的抗逆性

2.7.1 温度稳定性

将在不同温度孵育过的噬菌体通过双层平板法测定效价，结果（图5）显示，在-20℃至46℃时，噬菌体活性受到影响较小，效价变化不大。温度达到54℃时，噬菌体开始急剧失活，效价急剧下降，60℃时完全失活。表明噬菌体对低温有一定的耐受性（小于37℃），对高温耐受性弱，超过54℃噬菌体开始逐渐失去活性。

2.7.2 噬菌体的紫外线稳定性

将在紫外线下照射不同时间的噬菌体通过双层平板法测定效价，结果（图6）显示，SP688噬菌体对紫外线的耐受力较弱，照射10min时，效价下降40%左右，照射30min后完全失活。

2.7.3 噬菌体的pH稳定性

将在不同pH缓冲液中孵育的噬菌体通过双层平板法测定效价，结果（图7）显示，噬菌体SP688对酸碱耐受范围较大，对酸、碱均有一定的耐受力，但对强碱的耐受程度不如强酸。pH值为7.4时，噬菌体活性最强：当pH值为3.0、5.0、6.0、8.5、11.0时，对噬菌体活性影响不大，效价降低20%左右；当pH值为13.0时，效价降低60%。

2.8 噬菌体基因组测序

为了解噬菌体SP688的基因组特征，对其进行了Illumina全基因组序列测定，获得有效数据891.8Mb。组装后结果显示，噬菌体基因组为环状DNA（图8A），全长为45499kb，GC总含量为34.1%（图8B）。CeneMarkS软件预测噬菌体SP688基因组含64个开放阅读框（ORFs），其中19个（29.69%）具有特定功能，可将它们分为以下几个模块：（1）噬菌体结构组成相关蛋白：衣壳成熟相关蛋白（004）、主要衣壳蛋白（005）、主要尾蛋白（010）、主要尾蛋白（011）、尾标尺蛋白（014）、尾家族蛋白（015）；（2）复制和代谢相关蛋白：调节蛋H（032）、核酸结合蛋白（042）、DNA聚合酶A结构域（043）、dUTP酶（053）、转录激活因子（058）、病毒型复制修复核酸酶结构域（061）、SNF2_N家族超家族ⅡDNA/RNA解旋酶（062）、HNH核酸内切酶（064）；（3）噬菌体包装相关蛋白：末端酶小亚单位（001）、末端酶大亚单位（002）；（4）杀菌抑菌相关蛋白：穿孔素（023）、含CHAP结构域蛋白（024）、整合酶（025）、毒素-抗毒素系统蛋白（029）。根据噬菌体基因组的注释和分类，表明其具有自我复制、组装和宿主裂解所需的所有核心基因。

根据Oliveira等对噬菌体裂解酶的描述，将金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶分为4种不同类型：第一类由单基因编码：第二类含有Ⅰ组内含子：第三类由两段相邻基因共同编码：第四类含裂解酶间二级翻译起始位点的单基因。经分析，SP688噬菌体的裂解酶含AMI-3，Amidase_3do-main（PF01520/IPR002508）：SH3-5，SH3_5do-main（PF08460/IPR013667）两段结构域，属第三类噬菌体裂解酶（图9A），与SPPI相似度最高（图9B）。

3 讨论与结论

β-内酰胺类药物曾经被认为是治疗金黄色葡萄球菌的有效抗生素，但近年来由于滥用导致其耐药菌株分离率越来越高，严重威胁奶牛健康，临床防治迫切需要噬菌体等新的抗菌手段。本研究以临床分离到的奶牛源耐氨苄西林金黄葡萄球菌为宿主菌，分离得到一株裂解性噬菌体，命名为SP688。噬菌体SP688能在含有其宿主菌的双层平板上形成边缘整齐、透亮、无晕环的噬菌斑，符合裂解性噬菌体的特征14。透射电镜观察发现，SP688具有长而不收缩的尾巴，末端有一个膨大的纤突，符合长尾科噬菌体的特征。与王一凡等分离到的短尾金黄色葡萄球菌噬菌体P42相比，SP688效价更高，能达到1010PFU/mL以上，且裂解譜较广，对7株不同的耐氨苄西林金黄色葡萄球菌均有裂解能力。最佳感染复数为1，该指标的确定有利于快速收获高滴度噬菌体悬液。分析其裂解动力学曲线发现，该噬菌体可以一定程度抑制和减少细菌的生长速度和数量，且浓度较高时可在10h内完全抑制细菌的生长。在自然环境中，噬菌体对环境压力的耐受性决定其侵染宿主的能力，良好的环境压力耐受性是噬菌体作为新型生物抑菌制剂的前提。噬菌体SP688对温度耐受范围较宽，在-20-46℃均具有良好的活性，pH值3-11范围内活性良好。与葛志毅等分离到的噬菌体相比，SP688的耐热能力和耐酸碱能力更强，具备作为环境消毒剂的应用潜力。健康奶牛的乳腺环境pH值一般在6.4-6.6之间，患乳腺炎时会升高至7.2左右：体温正常范围在37.5-39.5℃。基于SP688良好的抗性，将其作为乳腺注入剂的应用过程中，也可保持稳定的活性，且不会在食品中残留，对人类健康和公共卫生具有良好意义。

全基因组分析是了解噬菌体最重要的手段。在基因水平上分析噬菌体的安全性是研究噬菌体的重要前提，是解析其结构和功能的基础。本研究中，噬菌体SP688全基因组测序结果显示，其基因组为环状DNA，全长45499kb，包含64个ORFs，其中已知基因功能的编码序列（CDs）有19个（29.69%）。通过基因组的注释和分类，该噬菌体具有DNA代谢、病毒粒子组装和裂解宿主所需的所有核心基因。穿孔素（023）、含CHAP结构域蛋白（024）是噬菌体SP688基因组中被注释到的与裂解相关的基因，是裂解酶LysGH15起催化作用的关键活性片段，该裂解酶对金黄色葡萄球菌表现出广谱高效的抗菌活性。一般来说，噬菌体大多采用穿孔素一裂解酶（holin-lysin）系统来裂解细菌。穿孔素是一种可插入细胞质膜并在膜上形成小孔的疏水性小蛋白质，与细菌内溶素（或裂解酶）协作，在噬菌体繁殖周期的最后阶段降解细菌细胞壁的肽聚糖，通过使细菌内部细胞质的渗透压失衡导致细菌溶解，同时释放子代噬菌体26。噬菌体SP688裂解酶由该两段相邻基因共同编码，表现出良好的裂解活性，在未来的应用研究中，不仅可以直接应用噬菌体SP688来进行疾病治疗，还可以通过蛋白表达手段制备裂解酶来抑制细菌的生长繁殖。

综上，本研究分离并鉴定了一株新的可裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的噬菌体SP688，其裂解谱广，裂解能力强，具有较好的环境耐受性。研究结果可为进一步开发噬菌体制剂提供数据支持，为使用噬菌体制剂防控细菌病提供新的参考。

基金项目：国家现代农业产业技术体系项目（CARS36）；山东省重点研发计划（乡村振兴科技创新提振行动计划）项目“预制菜全链条智慧生产技术创新与应用”（2022TZXD0021）；山东省农业科学院农业科技创新工程项目（CXGC2022A28）