硒对云南白灵芝生长、品质及DNA甲基化特征的影响

姚春馨　梁明泰　刘家迅　王晖　陈霞　田果廷

摘要：采用田间覆土栽培试验，设置6个Se浓度（0、50、100、200、300、400μg/g）处理，分别记为CK、Se50、Se100、Se200、Se300、Se400，研究外源硒对云南白灵芝生长发育、重金属积累、生物活性成分含量及其DNA甲基化特征的影响。结果表明，与CK相比，外源Se对子实体柄长和菌盖大小（横径、纵径）无显著影响，但能显著降低菌盖厚度：随着Se施用水平提高，菌丝生长速率和子实体硒含量均呈先增后降的趋势，生物量呈先降后增再降的趋势。子实体重金属含量（As、Cd、Ph、Hg）随Se浓度增加呈持续降低趋势，线性分析也表明，重金属含量与Se施用浓度均呈显著负相关。施Se增加了子实体多糖、粗蛋白、黄酮及总氨基酸含量，其中，多糖、黄酮含量在Se400处理下最高，总氨基酸、粗蛋白含量分别在Se200、Se300处理下最高。HPLC测定分析表明，与CK相比，Se300提高了灵芝酸A、灵芝酸DM、灵芝酸F及灵芝酮三醇为主的三萜酸组分，其总三萜酸含量较其他处理提高2.93%-25.54%。敏感扩增多态性分析（MSAP）结果显示，Se300较CK、Se400相比具有较高的未甲基化位点比例和较低的甲基化位点比例。综上，施用外源硒可促进早期菌丝生长，提高子实体生物量累积，改善子实体重金属安全性能和生物活性成分品质，改变DNA甲基化比例，且以300μg/g施用浓度的整体效果最佳，其子实体产量较对照显著提高11.36%。

关键词：白灵芝；硒；农艺性状：重金属含量；品质；DNA甲基化

中图分类号：S567.31 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）03-0106-09

灵芝（Ganoderma sp.）是担子菌门的一种食药用真菌，其子实体和孢子具有丰富的多糖、氨基酸及三萜类物质，市场开发前景广阔。研究表明，灵芝在降血脂、抗氧化、除风湿等方面均具有显著疗效，同时也是抗癌和抗病毒药物的重要成分之一，目前已被广泛应用于药膳、保健品及饲料添加剂，表现出可观的经济和药理价值。白灵芝（Ganoderma leucocontextum）又称为白肉灵芝、藏白灵芝、藏灵芝，其菌落绒毛状蓬松、菌肉洁白，是稀缺的灵芝种类，主要分布于我国西南的高海拔地区，为典型的区域性灵芝种类之一。在云南省，白灵芝主要生长在海拔2500m以上区域，是独特的低温型灵芝种类，已成为云南食药用菌的重要铭牌之一。近年来，市场需求使得白灵芝价格连年攀高，野生资源无序采摘导致野生白灵芝日益枯绝，人工栽培成为解决白灵芝资源短缺的重要途径。目前，白灵芝主要采用段木覆土或袋栽覆土栽培，但覆土引起的重金属累积严重影响着食药安全性。

硒（Se）是生物体所必需的多功能生物营养元素，同时也是谷胱甘肽过氧化物酶、硒蛋白质和一些挥发性硒化合物的核心枢纽物质，在抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等方面具有重要作用。自然系统中，硒同时以负Ⅱ价[Se（-Ⅱ）]、正Ⅳ价[Se（Ⅳ）]、正Ⅵ价[Se（Ⅵ）]和零价[Se（0）]的无机、有机形态存在：Se在土壤中的存在形态与土壤的团粒结构、氧化还原电位、酸碱度、气候等因素密切相关，不同价态的硒其有效性亦存在较大差異。最常见的无机硒化合物为亚硒酸钠（Na2SeO3）、硒酸钠（Na2SeO4）和硒化氢（H2Se）。对生物体而言，有机硒低毒性但其生物促生效果较弱。与有机态相比，无机态硒具有较高的生理毒性，难以快速吸收，但其生物利用度往往较好。因此，目前以Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）为主的外源硒已逐渐应用到农业生产中，并且在重金属修复、盐胁迫、干旱胁迫及作物品质提升等方面表现出，优良效果。

富硒功能性食品的研究已越来越成为研究的热点。有研究表明，大型食用菌（如金针菇、平菇、香菇、灵芝等）具有良好的Se积累和转化能力，可发展为理想的富硒食品。目前，对富硒食用菌的研究主要集中在通过向固体基质中添加无机硒化合物以研究硒代谢物的变化特征和潜在生物活性，而对Se在实际栽培过程中的质量安全研究较少。不同的生物体种类对Se的耐受、吸收、转化及利用能力不同，筛选适宜Se用量成为Se施用的必要前提。此外，相比于其他食药用菌，白灵芝的驯化选育工作开展时间较晚，目前关于白灵芝高效优质栽培的探索仍处于起步阶段，对外源矿质养分吸收与利用的研究更是鲜有涉及。基于此，本研究以Na2SeO3为硒源，探索Se（Ⅳ）不同用量对白灵芝重金属安全及生物活性成分品质的影响，并结合胞嘧啶碱基对DNA甲基化的响应特征确定最佳的硒施用量，以期为硒应用于白灵芝的人工培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验概况及材料

试验于2021年4月-2022年2月在云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所科研基地进行。白灵芝品种为课题组自主选育的“云白灵芝l号”[鉴（食用菌）2022070号]。栽培基质：硬杂木屑86%、麦麸10%、豆粕2%、碳酸钙1%、石膏粉1%，含水量60%，pH值8.0。亚硒酸钠（Na2SeO3）购自默克化学试剂公司。

1.2 试验设计

设置硒单因素6水平完全随机试验，Na2SeO3施用水平分别为0、50、100、200、300、400μg/g，分别记为CK、Se50、Sel00、Se200、Se300、Se400。其中上述μg/g为Na2SeO3用量（μg）与栽培基质干重（g）之比。

基质配料基于常规常压灭菌，冷却后采用聚乙烯菌料袋装袋，菌料袋规格17cm×20cm×0.005cm，每袋装基质510g。采用单头接菌法接入白灵芝菌种，垂直摆放于湿度80%、温度18-23℃的培菌室黑暗培养。菌丝长满袋后转移至水帘出菇棚进行开袋覆土，每处理设置3区，每区30袋。将Na2SeO溶解于无菌水，配制成400mg/mL水溶液，相应Se处理则基于该母液进行稀释处理。后续白灵芝的培养管理参考姚春馨等研究中所述。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 白灵芝农艺性状测定

采收期每小区随机挑选5-10朵长势均匀的成熟子实体，用直尺测量菌盖横径和纵径，用电子游标卡尺测量菌盖厚度，用数字尺测量菌柄长度。每个小区随机选择3朵鲜灵芝，测定子实体鲜重，并于65℃下烘干称取干重，折算每个菌袋子实体鲜重和干重。菌丝生长速率采用定期划线法测定。

1.3.2 白灵芝子实体硒及重金属含量测定

白灵芝子实体中的重金属包含镉（Cd）、砷（As）、铅（Pb）、汞（Hg）。准确称取子实体200.00mg于微波消解管中，加入浓硝酸5.0mL，微波消解仪（CEM Mars6，Hanson Research Co.，Ltd. USA）消解45min，然后在140℃电热板上赶酸缩至1mL备用。参考《食品安全国家标准食品中多元素的测定》中的方法，用超纯水分别将镉（Cd）、砷（As）、铅（Pb）、汞（Hg）标准液进行质控处理，平行误差＜5%，重金属回收率>95%。采用电感耦合等离子体光谱仪（ICP-MS，ICAPQc，ThermoFisher Scientific，USA）测定子实体中Cd、As、Pb、Hg和Se含量。

1.3.3 白灵芝子实体生物活性成分含量测定

白灵芝子实体多糖含量测定参考《食用菌中粗多糖含量的测定》中的方法进行；粗蛋白含量测定参考《食用菌中粗蛋白含量的测定》中的方法进行：总氨基酸含量测定参考《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中的方法进行；黄酮含量采用亚硝酸钠浸提、硝酸铝-氢氧化钠比色法测定；三萜酸含量测定参考2020版《中国药典》中灵芝三萜含量测定方法进行：灵芝酸组分采用高效液相色谱（HPLC）法测定，具体步骤见吴鸿雪等研究中所述。

1.3.4 白灵芝DNA甲基化测定

子实体雏形期，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法对子实体基因组DNA进行快速提取，详细步骤参考Hua等研究中所述。采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Nanodrop 2000分光光度计（Thermo SCientific，Wilmington，DE）分析其纯度和质量，纯化后的DNA用于后续甲基化敏感扩增多态性分析（MSAP）。

MSAP分析中酶內切、连接、预扩和选扩参照李忠爱等研究中所述，即采用EcoR Ⅰ/Msp Ⅰ和EcoR Ⅰ/HpaⅡ组合酶作为限制性内切酶及接头，连接接头和引物序列，采用Primer Express 3.0软件设计引物、接头及扩增引物，引物信息见表1。通过PCR仪（CFX96Touch BIO-RAD1，ABI，USA）和聚合酶链式反应混合液2xPCR masterMix[B639295-0005，生工生物工程（上海）股份有限公司]扩增。PCR程序：95℃5min：95℃30s，58℃40 s，72℃90 s，35个循环；72℃延伸10min。将扩增产物采用溴化乙锭染色，然后于50bp分子量标记下采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后在Gelscanner软件中分析MSAP凝胶图像，并在两组中识别每个样品获得的分子片段。将得到的峰图转化为条带，有峰位点“Yes”记为“1”，无峰位点“No”记为“0”，根据条带信息进行相应的甲基化状态分析。

1.4 数据处理与分析

用Microsoft Excel 2010对相关试验数据进行初步整理，SPSS 25.0软件进行方差分析与显著性检验，用Microsoft Excel 2010、Origin 2021软件制图。试验数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度硒对白灵芝生长发育的影响

由表2可知，除Se400处理外，其他处理菌丝生长速率均高于CK，其中Se100处理最高，显著高于其他处理。菌柄长表现为Se400＜CK＜Se200＜Se100＜Se300＜Se50，处理问差异不显著。Se50、Se100处理菌盖横径较大，分别较Se400显著增加12.80%、12.44%，而CK、Se200、Se300与其他处理均无显著差异。Se100处理菌盖纵径最大，为6.16cm，Se300处理次之，二者均与CK无显著差异且皆显著大于Se50、Se200、Se400处理。CK菌盖厚度最大，施硒处理较其降低7.66%-24.26%，其中Se50处理显著小于CK。各处理间子实体鲜重表现为Se400＜Se100＜CK＜Se300

2.2 不同浓度硒对白灵芝子实体硒及重金属含量的影响

由表3可知，成熟期白灵芝子实体中砷（As）、镉（Cd）、铅（Pb）、汞（Hg）含量表现为Hg＜As＜Pb、Cd，且均以CK含量最高。其中，CK子实体As、Pb、Hg含量显著高于其他处理，各处理间均表现为CK>Se50>Se100>Se200>Se300>Se400，各施硒相关处理分别较CK降低15.91%-61.36%、16.90%-64.79%、17.86%-71.43%；CK、Se50处理子实体Cd含量显著高于Se200、Se300、Se400，各处理间表现为CK>Se50>Se100>Se200>Se400>Se300，各施硒相关处理较CK降低5.80%-57.97%；与相关国家标准（GB2762-2017）及2020版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）中灵芝子实体As、Cd、Pb、Hg含量参考值相比，仅Se300、Se400处理能同时达标。各处理子实体Se含量表现为CK

2.3 不同浓度硒对白灵芝子实体生物活性成分含量的影响

由图1A可知，各处理子实体多糖含量表现为CK＜Se100＜Se50＜Se200＜Se300＜Se400，施硒相关处理较CK增加9.61%-59.81%，其中CK与Se100、Se50与Se200、Se300与Se400均无显著差异，施硒相关处理（Se100除外）显著高于CK。

由图1B可知，各处理子实体粗蛋白含量表现为CK＜Se50＜Se400＜Se100＜Se200＜Se300，其中CK显著低于其他处理，Se300处理含量最高，Se50、Se100、Se200、Se400处理分别较其显著降低17.11%、8.73%、6.16%、10.60%。

由图1C可知，与CK相比，施硒相关处理子实体黄酮含量变幅为-1.23%-12.27%，其中Se50与Se200差异显著，二者与CK差异不显著：Se300与Se400显著高于其他（Se100除外）处理，二者差异不显著。

由图1D可知，施硒相关处理子实体总氨基酸含量较CK显著增加17.30%-55.88%：Se200处理含量最高，与Se100、Se300差异不显著，Se50、Se400处理则分别较其显著降低24.75%、14.77%。

2.4 不同浓度硒对白灵芝子实体三萜酸组分含量的影响

由图2可知，白灵芝子实体三萜酸组分含量表现为灵芝酮三醇＜灵芝酸G＜灵芝酸B＜灵芝酸DM＜灵芝烯酸B＜灵芝酸F＜灵芝酸A，其中灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸DM、灵芝酸F、灵芝酸G、灵芝烯酸B及灵芝酮三醇分别占总三萜酸含量的24.83％-29.42%、9.57%-11.01%、11.24%-13.06%、21.13%-23.32%、7.64%-9.19%、7.47%-14.84%及7.05%-8.38%。

各处理总三萜酸含量表现为CK＜Se50＜Se400＜Se100＜Se200＜Se300，Se300处理较其他处理提高2.93%-25.54%。其中，Se300处理灵芝酸A、灵芝酸DM、灵芝酸F及灵芝酮三醇含量均较高：Se200处理灵芝烯酸B、灵芝酸G含量较高，其他处理较其分别降低0.07%-58.74%、10.17%-21.65%；Se400处理灵芝酸B含量最高，CK较其显著降低12.18%，各处理灵芝酸B组分含量表现为CK＜Se50＜Se100＜Se300＜Se200＜Se400。

2.5 不同浓度硒对白灵芝子实体DNA甲基化的影响

甲基化位点比例越高意味着环境胁迫程度越大。为检测不同浓度硒处理下子实体的表观遗传多样性，利用敏感扩增多态性分析（MSAP）引物分析白灵芝子实体DNA的甲基化特性。由图3可知，在所有处理中，全甲基化模式表现出最多的重复条带，其次是半甲基化模式，而胞嘧啶内甲基化水平最低。

由表4可知，Sel00处理子实体未甲基化位点比例最高（25.76%），其次是Se300、Se50，CK、Se400处理未甲基化位点比例较低。甲基化位点特征中，Se200、Se300处理下各位点比例表现为胞嘧啶内甲基化<完全甲基化<半甲基化，其他处理表现为胞嘧啶内甲基化<半甲基化<完全甲基化。各处理子实体半甲基化位点比例差异较大，Se200处理下最高（43.93%），其次是Se300处理，Se400处理下最低（25.76%）：各处理胞嘧啶内甲基化位点比例表现为Se200＜Se300、Se100＜CK＜Se50、Se400：CK、Se400、Se100处理子实体完全甲基化位点比例较高，Se300处理最低（21.82%）。CK、Se400处理总甲基化比例较高，Se100、Se300处理较低。

2.6 硒施用浓度与子实体重金属组分含量的线性分析

由硒施用水平与子实体重金属组分含量的线性相关分析结果（图4）可知，Se施用水平与白灵芝子实体中As含量的线性模型为v=-0.0007x+0.4196（R2=0.9799，P=0.0339），与Cd含量的线性模型为y=-0.0011x+0.7（X）5（R2=0.9423.P=0.0491），与Ph含量的线性模型为v=-0.0011x+0.6662（R2=0.9736.P=0.0405），与Hg含量的线性模型为v=-0.0005x+0.2592（R2=0.9534.P=0.0468）。表明施硒水平与成熟子实体中4种重金属的含量均呈显著负相关。

3 讨论与结论

菌丝发育及农艺性状是食药用菌菌丝活力和后期收获的重要表征。本研究结果表明，外源硒整体促进了白灵芝菌丝的生长速率，其最佳的菌丝发育施用水平为100μg/g，400μg/g施用水平时菌丝生长速率最慢，表明在菌丝发育前期施用外源Se存在阈值效应。Coval等研究表明赤灵芝菌丝发育对Se敏感，Se可使菌丝变细、分枝数增加，但孢子形态会发生改变，较高浓度的无机硒不利于菌丝生长。本研究结果显示，外源Se明显使白灵芝子实体的菌盖变薄，而对菌柄长度和菌盖大小影响较小。灵芝产量是决定食用菌效益的重要指标，子实体鲜、干重整体以Se300处理较高，其中干重较CK显著提高11.36%。

Se是生物体功能代谢不可缺少的微量元素，对人体的健康起着重要作。食药用菌是良好的硒积累体，利用菌类进行硒的生物强化是提高人体Se摄入量的有效策略。本研究结果表明，随着Se施用水平的提高，白灵芝子实体Se含量呈先升高后降低趋势。这与前人的研究结果不一致，Serafin等的研究表明，随着Se施用水平的提高，赤灵芝子实体硒含量逐渐增加。上述结论不一致的原因可能是硒施用浓度及灵芝种类对硒的敏感度差异所致。大多数食用菌（如灵芝）皆具有很强的矿物元素富集能力，目前灵芝主要采用覆土栽培，而覆土易造成灵芝重金属富集。本研究中，采用袋栽覆土栽培，白灵芝子实体的重金属含量（As、Cd、Pb、Hg）均较高，随着外源硒施用水平提高，子实体重金属含量整体呈显著降低趋势。此外，参考GB2762-2017及《中國药典》中重金属含量标准，Se300、Se400处理子实体重金属含量均符合要求。

灵芝子实体多糖、黄酮及灵芝酸等生物活性物质含量是决定其药用价值的重要参数。本研究结果表明，白灵芝子实体多糖、粗蛋白、黄酮、总氨基酸及总三萜酸含量的峰值整体出现在Se200、Se300、S400处理，即较高水平的Se用量更有利于刺激生物活性成分的合成。灵芝三萜酸物质的结构复杂，子实体中灵芝酸的种类和含量是评价其品质的重要指标之一。本研究中，对白灵芝子实体中7种三萜酸化合物含量的分析表明，灵芝酸A是白灵芝子实体含量最高的三萜酸组分，其占总三萜酸含量的24.83%-29.42%，此结论与赤灵芝、紫灵芝等灵芝种类的相关报道结果一致。有研究表明，灵芝酸A、灵芝酸DM、灵芝酸F及灵芝酮三醇在护肝、降血脂、抗肿瘤、抗病毒及调控细胞凋亡中具有显著疗效。就硒处理而言，整体以Se200、Se300处理三萜酸组分含量较高，其中Se300处理下子实体灵芝酸A、灵芝酸DM、灵芝酸F及灵芝酮三醇含量最高。

植物在面对各种胁迫环境时会做出多重反应以应对环境变化，表观遗传状态是反映植物应对策略的重要表征。DNA甲基化是一种天然的表观修饰过程，甲基化位点比例越高意味着环境胁迫程度越大。在植物体中，甲基化发生在胞嘧啶第5位碳原子上，在DNA甲基转移酶催化下，将S-腺苷-L-甲硫氨酸的甲基转移给DNA胞嘧啶，形成5-甲基胞嘧啶，其可通过敏感扩增多态性分析技术检测。本研究结果表明，CK与Se400处理具有较为相似的DNA甲基化特征，即具有较低的未甲基化位点比例和较高的完全甲基化位点比例，而Se100、Se300未甲基化位点比例较高、总甲基化位点比例较低。

综上所述，施用外源硒能够促进白灵芝早期菌丝生长，提高子实体生物量累积和生物活性成分品质，降低相关重金属含量，改变DNA甲基化比例。但外源硒施用水平存在剂量效应，本研究中以Na，Se03 300μg/g用量最佳。

基金项目：云南省重大科技专项计划项目（202102AE090051-2-02）；云南省乡村振兴科技专项（202204BP090023）