山东省谷子线虫病的发生状况和病原鉴定

李广岩　白兴勇　尹传坤　梁晨　宋雯雯　史倩倩　赵洪海

摘要：近年来，山东省部分地区谷子线虫病频繁发生、危害严重。为明确山东省谷子线虫病的病原种类，2021-2022年从山东省收集谷穗样本9个，采用组织破碎一贝曼漏斗法分离获得线虫，利用形态学和分子生物学方法鉴定线虫种类。结果发现，从临沂、济宁、聊城、济南和潍坊的6个谷穗样本中分离到植物线虫，经形态学鉴定为同一物种，并对其为害症状和雌、雄虫主要形态特征进行了描述。同时结合基于rDNA-ITS与28SD2/D3区序列构建系统发育树和贝西滑刃线虫（Aphelenchoides besseyi）特异性引物PCR扩增等生物学鉴定方法，最终将为害线虫鉴定为贝西滑刃线虫。鉴定结果为山东省谷子线虫病的发生、分布和危害状况的研究提供数据参考。

关键词：谷子线虫病；贝西滑刃线虫；形态特征；分子鉴定；症状

中图分类号：S435.15 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）03-0125-07

谷子（Setaria italica）系一年生草本植物，果实脱皮后俗称小米，是我国传统的粮食作物，耐旱、耐瘠、耐储存，对种植业结构调整和膳食结构改善具有重要作用。山东省谷子种植面积常年稳定在2.6万hm2以上，主要集中在鲁中山脉周边及鲁东等丘陵山区。谷子线虫病或谷子不稔线虫病，又称紫穗病，俗称“倒青”，是一种典型的种传病害。线虫寄生破坏子房，导致不能开花或花而不实，颖多张开，内含表面光滑有光泽的尖形秕粒，病穗瘦小，直立不下垂。受害谷子产量损失很大，发病严重地块可减产60%-80%，甚至绝收。由于谷子主要种植品种均为感病品种，种子调运频繁加之抗病品种培育困难，造成线虫病在我国谷子产区的危害不斷蔓延且存在逐渐加重趋势。然而，长期以来我国关于谷子线虫病发生、为害的报道数量有限，且主要集中在河北省，山东省未见报道。

基于生产中临沂市菖南县发生疑似谷子不捻线虫病，导致数个谷子田块出现不结实的情况，本研究从山东省部分地区收集谷子线虫病疑似病穗，并对分离到的线虫进行系统鉴定，旨在确定山东省谷子线虫病的发生、分布和危害状况，为其识别诊断和有效防控提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

疑似谷子线虫病病穗来自临沂市费县（LF：样本标号，下同）、临沂市莒南县（LJ）、聊城市高唐县（LG）、山东省农业科学院济南农场（JN）、济宁市邹城市（JZ）、潍坊市昌邑市（WC）、淄博市临淄区（ZL）、烟台市福山区（YF）、德州市乐陵市（DL），共9个样本。

1.2 研究方法

1.2.1 线虫分离

将病穗切成小段并将谷粒研磨破碎，采用改良的贝曼漏斗法进行线虫的定量分离。

1.2.2 线虫计数

定量分离后，用试管接取线虫悬浮液10mL，充分摇匀后用移液器吸取0.5mL滴于载玻片上，在解剖镜下计数液滴中的线虫数量，重复3次，取平均值后折算出10mL线虫悬浮液中的线虫数量，最后计算每克谷穗组织中的线虫数量，即病穗线虫群体密度。

1.2.3 形态学鉴定

将线虫温和热杀死后，在O-lympus双目实体解剖镜下挑取目标线虫，以水作浮载剂制成临时玻片标本，利用Zeiss显微镜及配套软件对线虫标本进行形态特征观察、拍照及测量。按照DeMan公式计算比值特征。

1.2.4 分子生物学鉴定

参考容万韬等的方法提取单条线虫的DNA，以引物D2A/D3B扩增线虫28S rRNA D2/D3区片段，以引物TW81/AB28扩增线虫rDNA ITS区片段。PCR反应体系为25μL：线虫DNA模板2μL，10xPCR Buff-er（Mg2+）2.5μL，dNTP MIX 2μL，上、下游引物各2μL，ddH2O 14μL，rTaq酶0.5μL。PCR扩增程序参照文献[13]。PCR扩增产物经回收克隆后交由上海生工青岛分公司测序。

1.2.5 系统发育分析

将测序后的结果在NCBI数据库中进行Blast分析，下载序列。运用MECA 7.0软件中的ClustalW进行序列比对，采用邻接法构建系统发育树。

1.2.6 特异性引物检测

参照林宇等的方法，用贝西滑刃线虫28S rRNA D2/D3区特异性引物GU-F（5'-GACACTGCAATCGCTTCGAC-3）与GU-R（5-ATCCGCAACCACAACTCACA-3'）对供试线虫群体的DNA进行PCR扩增。PCR反应体系同1.2.4，其中GU-F和GU-R各2μL。PCRkuo增程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min，35个循环：72℃7min；4℃保存。以贝西滑刃线虫DNA为阳性对照，燕麦真滑刃线虫（Aphelenchus avenae）DNA为阴性对照，ddH2O为空白对照。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2003对数据进行整理，利用SPSS软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 线虫分离

从LJ、LF、LC、JN、JZ和WC共6个样本中分离出植物线虫，初步观察发现均属于滑刃线虫属（Aphelenchoides），其他样本中未分离出植物线虫。6个样本问线虫群体密度存在很大差异，从大到小依次为JN、LG、WC、LF、IJJ和JZ（表1）。

2.2 症状观察

受害较轻的谷穗，部分颖壳松裂，局部呈紫红色，穗部顶端瘦小、蓬松，部分籽粒瘪秕，成熟期在田间一般下垂。受害较重的谷穗，整体短小、蓬松，顶部蓬松尤其严重：大部分谷粒瘪秕，秕粒尖形、光滑、有光泽：颖壳开张，呈紫红色：与健康谷穗相比重量明显较轻，成熟期在田间常常直立（图1）。

2.3 形态学鉴定

通过系统的形学观察和测量，发现6个线虫群体的形态特征基本一致，初步鉴定为贝西滑刃线虫（A.besseyi Christie，1942）。雌虫和雄虫的测量数据及其与原始文献数据和国内学者测量数据的比较分别见表2和表3。

雌虫形态特征（图2）：经温和热杀死后虫体略向腹面弯曲，虫体细长，平均长度约为720μm（图2A），侧区约占虫体宽度的1/4，具有4条侧线（图2C）。唇区嘲，稍有缢缩，口针稍细弱，长度约为12μm，基部球小。中食道球大而明显，近长方形，长约14μm，宽约9μm，瓣门明显，位于中食道球中部偏后。食道腺长叶状，从背面覆盖肠（图2B）。阴门横裂且阴门唇稍凸起。单卵巢，受精囊长卵图形。后阴子宫囊窄而长，长度约为阴门处体宽的2.5-3.5倍（图2E）。尾长约为40μm，尾呈圆锥形，末端腹突具有3-4个细小的星状尖突（图2D）。

雄虫形态特征（图3）：经热杀死后虫体略向腹面弯曲，体长较雌虫短，平均约550μm（图3A）。虫体前部特征与雌虫基本相似（图3B）。交合刺呈玫瑰刺状，长约16μm，基部无顶尖，喙突中等发达，尾末端具有2-3个星状尾尖突，尾部具3对尾乳突（图3D）。

2.4 系统发育分析

采用线虫ITS区通用引物TW81/AB28双向测序后进行序列拼接，比对后得到序列長度约为825bp，上传至CenBank获得登录号OQ476763、OQ711739。采用28S D2/D3区引物双向测序后进行序列拼接，比对后得到序列长度为787bp，上传至GenBank获得登录号OQ476877、OQ723791。基于ITS和28S D2/D3序列构建的系统发育树（图4）表明，山东谷子滑刃线虫群体与GenBank数据库中已登录的5个贝西滑刃线虫的序列聚于同一个大的分支，相似度均为100%。

2.5 特异性引物检测

采用贝西滑刃线虫特异性引物GU-F/GU-R对山东谷子滑刃线虫群体与贝西滑刃线虫群体进行PCR扩增（图5），结果显示，山东谷子滑刃线虫群体扩增条带为279bp，符合贝西滑刃线虫特异性引物扩增条带长度，而阴性对照燕麦真滑刃线虫与空白对照（ddH2O）则无条带出现。最终将山东谷子线虫群体鉴定为贝西滑刃线虫。

3 讨论与结论

贝西滑刃线虫是一种叶芽线虫，以外寄生的方式取食植物地上部分，是对水稻最具破坏性的植物线虫之一，常被称为水稻干尖线虫。其寄主范围广，包括水稻、谷子、草莓、大豆等200多种植物，被认为是世界十大最重要的植物寄生线虫之一，是非常重要的植物检疫病虫，被世界70个国家列为限定性有害生物20。20世纪50年代到60年代，陈善铭等对北京市和河北省定县、安国县谷子线虫病的病原线虫种类、寄生方式、生活史等进行了较为系统的研究，指出我国谷子线虫病的最早记载可追溯到1916年。20世纪70年代，谷子线虫病在京津冀地区有零星发生，由于长期种植感病品种，又逢发病适宜气候条件，1982年，河北青县和天津武青县谷子线虫病大发生，造成严重产量损失。王金成等对从河北省谷子中分离的滑刃线虫种群进行了形态学和分子生物学鉴定，提供了河北谷子中贝西滑刃线虫的分子数据。Chen等首次对分离白河南省谷子的贝西滑刃线虫进行了报道。目前，对山东省谷子线虫病较为系统的调查研究和报道近乎空白。

贝西滑刃线虫在谷子播种后主要在种壳和秕粒内活动，少量进入胚根和幼芽，拔节期后转移到叶鞘进行繁殖，待幼穗形成后转移至穗部为害并进行大量繁殖。目前认为，寄生谷子和水稻的贝西滑刃线虫是同种线虫的2个不同的生理型。高丙利研究表明，寄生水稻的贝西滑刃线虫可在田间的谷壳内存活4个月，但不能在土壤中长时间存活。白峰、刘维志和张丽英等认为寄生谷子的贝西滑刃线虫可以在土壤中存活。根据Christie的研究，在美国北卡罗来纳州贝西滑刃线虫的草莓型也可以在土壤中存活。陈善铭等用两种线虫在谷子和水稻上进行交互接种试验，发现原寄生于谷子上的贝西滑刃线虫对水稻侵染较少，原寄生于水稻上的贝西滑刃线虫对谷子的侵染也较少。因此关于贝西滑刃线虫不同生理型之间的关系、土壤存活性以及叶穗寄生偏好性的差异等问题尚需进一步研究。

本研究对从山东部分地区谷子病穗中分离得到的线虫群体通过形态学与分子生物学相结合的方法进行了鉴定，明确了山东省谷子线虫病的基本发生状况和病原种类，属首次针对山东省谷子线虫病的调查研究和报道。山东省是我国重要的谷子产区，本研究结果为山东省谷子线虫病的鉴定诊断提供了较为详细的数据信息，可为谷子线虫病的科学认识和防控提供指导。

基金项目：山东省重点研发计划（重大科技创新工程）项目专题（2022CXGC020710-6）；黄三角国家农高区省级科技创新发展专 项资金项目（2022SZX23）