植物激素调控橡胶树产排胶机制研究进展

郭冰冰 刘明洋 代龙军 杨 洪 王立丰

（农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室，特种天然橡胶加工技术创新中心，中国热带农业科学院橡胶研究所，海口 571101）

植物激素是植物体内合成的多种微量内源激素的总称，对于植物生长发育、初生/次生代谢、生物胁迫和非生物胁迫响应等过程具有关键作用［1］。主要植物激素有茉莉酸（Jasmonic acid，JA）［2］、乙烯（Ethylene，ET）［3］、脱落酸（Abscisic acid，ABA）［4］、赤霉素（Gibberellin，GA）［5］、油菜素内酯（Brassinosteroids，BRs）［6］、生长素（Auxin）、水杨酸（Salicylic acid，SA）、细胞分裂素（Cytokinins，CTK）和独脚金内酯（Strigolactones，SLs）九大类［7］。每大类植物激素又包含很多细分种类，例如，生长素包含吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）以及二氯苯氧乙酸（2，4-D），GA 包括GA1、GA3、GA4和GA7等。植物激素既可单独对植物产生调控作用，又可以交互作用形式协同对植物起到叠加或者拮抗作用［8-9］，为激素精细调控植物各类生理反应奠定基础。

天然橡胶（NR）主要是在橡胶树（Hevea brasiliensis）乳管细胞中合成、具有高价值且目前不可替代的高分子量生物聚合物，作为原材料生产轮胎和医用手套等多种橡胶产品。因其具有许多合成橡胶不具备的拉伸特性，所以对交通运输、医药和国防事业等至关重要［10］。中国是天然橡胶最大消费国、进口国和橡胶制品第一生产大国。截至2022年底，中国橡胶种植面积为112.3万hm2，居世界第四位，产量85.3 万吨，居世界第五位［11］。目前，植物激素在橡胶树幼苗组织培养［12］、生长发育、乳管分化、产胶［13］和排胶［14］等研究领域中均具有重要作用，但是内在生理和分子调控机制研究相对于模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和杨树（Populus tremula）等相对滞后。笔者首先简要介绍ET、ABA、BRs和GA4种植物激素生物合成和信号转导途径的最新研究进展；针对橡胶产业近年来面临的从产量需求到品质提升这一产业关键问题，结合笔者的研究基础，详细介绍植物激素在橡胶产业各应用领域的研究现状和存在问题；最后展望植物激素生理与分子生物学研究在橡胶产业升级中的应用领域，以期为橡胶树中的激素研究提供理论基础。

1 橡胶树中乙烯信号途径研究进展

1.1 乙烯合成和信号转导途径

ET 是第一个以气体分子被确定的植物激素，其功能主要是调节植物的生长、防御、成熟、繁殖和衰老过程。其合成是以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为原料，经1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）反应合成ET。在植物中，ACC 合成酶（ACS）和ACC 氧化酶（ACO）是ET 生物合成途径中的2 个关键酶，它们在转录和转录后都受到严格的调控，调节乙烯的生物合成［15］。植物中可以感知乙烯的受体蛋白有5个：ETR1、ETR2、ERS1、ERS2及EIN4，对ET 信号转导过程起负调控作用，主要定位在内质网膜上［16］。CTR1 是ET 信 号 途 径 中 的 抑 制 因 子［17］，EIN2是乙烯信号转导中的关键组分［18］，EIN3/EIL1蛋白存在于细胞核中，是乙烯信号途径中的关键转录因子［19］，可对下游的乙烯应答因子（Ethylene response factor，ERF）进行调控［20］。

1.2 乙烯利对橡胶树的作用机制解析

作为乙烯的释放剂，乙烯利（Ethephon 或Ethrel，ETH）是被广大胶农认可的一种非常有效的橡胶树采胶刺激剂，也是国际上增加橡胶树胶乳产量的常用化学试剂。在橡胶树中相继鉴定了EIN3/EIL1基因家族和下游靶蛋白，HbEIN3 蛋白可以与含有ERE 及G-box 顺式元件的启动子结合调控下游应答基因，并且不同浓度ETH 刺激可以短时间内提高胶乳中HbEIN3蛋白积累量［21-22］。作为乙烯信号途径的ERF 转录因子，其保守结构域AP2 可以识别下游靶基因来激活乙烯信号通路。巴西橡胶树中具有完整AP2 结构域的转录因子有142个，参与乳管细胞分化及胁迫反应。乳管细胞水循环、活性氧的产生和清除、糖代谢，以及乳胶肌动蛋白细胞骨架的组装和解聚可能在乙烯诱导的乳胶产量增加中起重要作用。蔗糖是天然橡胶的合成底物，外用ETH 可以增加蔗糖转运蛋白基因的表达量以及蛋白活性，提高了光合产物向乳管的运输，为天然橡胶的合成增添更多的底物。同时，ETH 还能提高NR 生物合成相关基因的表达量［23］，提高乳管中水通道蛋白基因HbPIP2；1及HbTIP1；1的表达量，促进乳管从周围组织中吸水稀释胶乳浓度，促进胶乳流动，降低胶乳堵塞指数，延长排胶时间，提高胶乳产量［24-25］。

但是，ETH 刺激不当和低温易引起橡胶树胶乳过度长流。我国的天然橡胶主栽区在10～12 月处于低温季节，橡胶树胶乳过度长流会导致橡胶树养分的大量流失，甚至引发死皮等生理障碍。割胶后胶乳和水分的大量流失，首先导致割面受到失水胁迫，引发内源逆境相关激素合成，进一步导致活性氧增加，最终诱导橡胶树细胞程序性死亡，导致胶乳橡胶烃分子量减少和品质下降［14］。张华林等［26］研究发现，橡胶树新品种‘湛试327-13’兼具抗寒和高产的特性。以体积分数1.5%ETH处理橡胶树‘湛试327-13’开割树，连续割6刀后，证明橡胶树活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因在树皮表达量高于其在胶乳中表达量。随着割次的增加，‘湛试327-13’树皮脂肪氧化酶基因（HbLOX1）和过氧化物酶基因（HbPOD1）的表达量显著上调，表达峰值为对照的22.15 倍和31.95 倍；蔗糖转运蛋白基因HbSUT1和HbSUT2a的表达量与对照相比分别提高66.11 倍和58.50 倍；几丁质酶基因HbCHI、葡聚糖酶基因HbGLU和橡胶素基因HbHEV的表达量分别比对照提高16.93 倍、8.09 倍和10.37 倍；橡胶生物合成关键酶基因HbGGPPS和HbHMGS1的表达量分别比对照提高14.71 倍和15.05 倍。说明ETH 刺激橡胶树后，‘湛试327-13’胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳防卫蛋白和橡胶生物合成关键酶基因表达量提高且持续时间长达6 刀（18 d），是其抗寒性和产量形成的分子基础，亦可作为橡胶树种质资源评价指标，用于分子辅助育种［26］。

2 橡胶树中脱落酸信号研究进展

2.1 脱落酸合成和信号转导途径

ABA 是植物内源激素，调控植物脱落与休眠，控制植物生长发育及种子萌发等，因其可以使植物叶片脱落而得名，又因参与植物的非生物胁迫过程也被称为“胁迫激素”［27］。脱落酸主要在植物的叶绿体和细胞质中合成，分为C15 直接途径和C40 间接途径。高等植物中主要存在的脱落酸合成路径是C40 途径。逆境胁迫会在不同程度上刺激植物体内ABA合成，通过促进叶片气孔关闭，促进相关基因的表达，随后诱导抗逆特异蛋白的合成来响应逆境胁迫。ABA 依赖型信号通路主要包括四大核心组件：ABA 受体PYR/PYL/RCAR、负调控蛋白磷酸酶PP2C 家族的A 亚族成员、正调控蛋白激酶SnRK2 和转录因子ABRE/ABF。正常生长条件下，PP2C 通过磷酸化来抑制SnRK2 的表达；环境胁迫条件下，胞内ABA 含量升高被PYR/PYL/RCAR 受体蛋白识别，PP2C 与受体蛋白互作抑制PP2C 蛋白磷酸化，使得SnRK2 处于激活状态，触发下游ABA 应答元件与bZIP 转录因子结合调控下游靶基因的表达。因植物抗旱性与ABA的积累量呈正相关，内源ABA 含量被作为鉴定抗旱性的指标之一。

2.2 脱落酸与橡胶树排胶的机制研究

本课题组相继鉴定了橡胶树ABA信号途径中的HbPP2C家 族［28］、HbSnRK2家族［29］和HbbZIP家族成员［30］。其中，HbPP2C家族有60 个成员，划分为13 个亚家族。表达分析表明，40 个HbPP2C基因在橡胶树枝条中表达量最高，在胶乳中表达量最低。此外，A 亚家族HbPP2C基因在ABA、干旱和草甘膦处理下的表达显著增加，A、B、D 和F1 亚家族成员在高温、低温胁迫下的表达显著增加。A和F1 亚家族成员的表达在植株受白粉病（Oidium heveae）感染后显著上调，与对照相比，HbPP2C6基因的表达显著增加33 倍。说明不同的HbPP2C亚家族基因可能在橡胶树对植物激素的调节及对非生物和生物胁迫的反应中具有不同的作用［28］。HbSnRK2家族有6 个成员，分为3 个亚家族。通过对所有HbSnRK2基因的顺式调控元件序列分析，在所有HbSnRK2基因的启动子中发现了ABRE 和TC 富集元件，表明HbSnRK2可以被ABA 和胁迫反应调节。RT-qPCR 分析显示，HbSnRK2.2基因在ABA 处理下的表达尤为显著。此外，HbSnRK2.2基因对草甘膦、白粉病、热胁迫和冷胁迫等过程均有响应，表明HbSnRK2.2基因在橡胶树的植物激素信号传导和应激反应中发挥重要作用［29］。HbbZIP家族成员有33个，分为10个亚家族。RT-qPCR 分析发现33 个HbbZIP主要在花中表达，其次是叶和根，在胶乳和树皮中表达最低。ABA 处理后，这些基因表达量差异显著，最高的HbbZIP38基因表达水平增加了约21倍，最低的HbbZIP56水平下降了21 倍。以上研究为进一步解析ABA 信号途径的关键家族成员奠定了基础。

3 橡胶树中油菜素内酯信号研究进展

3.1 油菜素内酯合成和信号转导途径

目前已知有60 多种BR 类似物，根据侧链C-24 位置上的烷基分为C-27，C-28 和C-29 三大类群。C-28 类群是植物中含量最丰富、分布最广的BRs。BRs 的生物合成涉及平行和高度分支的通路，彼此之间呈现交互作用［31］。在拟南芥中，BRs被质膜结合的富含亮氨酸重复序列（LRR）的RLKs、BRI1及其同源物BRL1和BRL3感知。在缺乏BRs 的情况下，BRI1 激酶抑制剂1（BKI1）的负调控因子可阻止BRI1 与其共受体——BRI1 相关受体激酶1（BAK1）/体细胞胚胎发生受体样激酶3（SERK3）的结合，从而抑制其活性。在这种情况下，1种GSK3/shaggy样蛋白激酶，即油菜素内酯敏感蛋白2（BIN2）激活并磷酸化2 个转录因子，油菜素内酯抗性蛋白1（BZR1）和BRI1 EMS 抑制蛋白1（BES1）/BZR2，导致它们经蛋白酶体介导的路径降解。结合BR 后，BRI1 与BAK1 相互作用导致它们通过磷酸化相互激活。这种反式磷酸化激活了BRI1 的激酶活性，磷酸化并激活BR 信号激酶（BSK1、BSK2和BSK3），调控下游基因响应BR［31］。

3.2 油菜素内酯促进橡胶树排胶机制及其调控

BR 是调控植物生长发育和产量形成的重要植物激素之一。本课题组［32-34］以橡胶树品种‘热研73397’为研究对象，分析橡胶树中BR 缓解水分亏缺和提高乳胶产量的效应。结果表明：BR 通过提高光合作用速率、减少渗透调节物质的渗透、增加能量物质的合成和改善抗氧化系统，提高了水分亏缺条件下橡胶树的活力。此外，BR 在不降低胶乳硫醇、蔗糖和无机磷的情况下，通过降低堵塞指数和提高黄色体破裂指数来提高乳胶的产量和品质。RNA-Seq 分析进一步表明，差异基因编码蛋白主要富集在MAPK 信号通路、植物激素信号转导和蔗糖代谢这3个通路。BR 还可诱导反式玉米素、ET、SA、激动素和细胞分裂素含量提升，而对于生长素、ABA和GA无诱导作用［32-34］。

4 橡胶树中赤霉素信号研究进展

4.1 赤霉素合成和信号转导途径

GA 是存在于植物中的四环二萜类化合物，具有以四环或者五环进行排列的碳骨架结构，可变的第五环是内酯，其合成分别在质体、内质网膜和细胞质3个亚细胞结构中进行。在植物、细菌和真菌中鉴定到的赤霉素有130多种，可以调节植物生长发育的有活性赤霉素只有4种：GA1、GA3、GA4和GA7［35］。赤霉素信号转导由GA 信号受体GID1 和负调控因子DELLA 蛋白组成。GID1 是一种可溶性赤霉素受体，在细胞质上感受到GA 信号后直接与GA 相结合形成GA-GID1 复合物。然后GAGID1 复合物与DELLA 相结合，此过程有SCFGID2E3泛素连接酶复合物参与快速降解DELLA，引发下游GA 响应基因的表达。GID 编码类似激素敏感相关的脂肪酶HSL 蛋白，含有HSL 保守基序HGG和GXSXG，但是不具有水解酶的活性，其与DELLA 的互作也要依赖GA 的存在。DELLA 对GA 信号途径起阻遏作用，N 端具有保守DELLA 和VHYNP 结 构 域 来 推 动GID1 和DELLA 的 互 作，C 端为GRAS 结构域，包含2 个亮氨酸重复序列LHR。已知的DELLA 蛋白有RGA、RGL1、RGL2、RGL3及GAI［36］。

4.2 赤霉素促进橡胶树排胶机制及其调控

吴绍华等［37］采用RT-PCR 与RACE 技术从橡胶树‘热研73397’胶乳中克隆了2 个DELLA 蛋白（HbGAI 和HbRGA1）。HbGAI的cDNA 序列全长2 050 bp，包含1 842 bp 的完整ORF，HbRGA1的cDNA 序列长为2 136 bp，含1 839 bp 的ORF，两者的氨基酸序列都含有DELLA 和GRAS 结构域，属于无跨膜结构域的亲水性蛋白。HbGAI 和HbRGA1 蛋白与麻疯树（Jatropha curcas）和蓖麻（Ricinus communis）中两者同源蛋白的亲缘关系较近。RT-qPCR 分析发现胶乳中HbGAI基因的表达受割胶和茉莉酸甲酯（MeJA）处理下调，ETH 处理4 h 内显著上调胶乳中HbGAI基因的表达，表明HbGAI基因可能在橡胶树割胶、JA、ET 响应中发挥作用［37］。HbRGA1在橡胶树叶片中表达量高，在树皮和胶乳中表达量极低。叶片中HbRGA1表达量受喷施GA 和ABA 等诱导显著上调。HbGAI和HbRGA1与橡胶树GA 等激素信号密切相关，为深入研究其在橡胶树生长发育中的结构和功能打下良好基础［38-39］。

5 橡胶树植物激素机制研究展望

5.1 建立新型橡胶树基因功能验证体系

鉴于植物生理和分子生物学技术进展迅速，将新型激素生理研究方法引入橡胶树研究领域对推动橡胶产业发展具有积极作用。例如，VIGS 及转基因技术可更加精确地定向改变植物的基因表达调控特定性状。目前，可以用基因枪轰击瞬时转化橡胶树的胚状体与愈伤组织，并且已经在橡胶树中以花青素为主体构建了可视化转基因高效筛选系统。同时，VIGS 技术可以特异性降低内源基因的表达，快速诱导植物沉默基因来特异性表征基因功能。作为一项成熟快速有效的表征基因功能的技术，VIGS 可以应用到橡胶树产排胶过程中激素信号转导路径关键基因的功能验证研究。

5.2 橡胶树中植物激素信号的交互作用机制解析

橡胶树产排胶是一个复杂的生理生化过程，不是单一激素的作用，而是多种激素相互作用的结果。外源喷施MeJA 及ETH 处理都可以提高激素信号网络途径关键因子HbGSK1的表达，说明两者具有协同调控的作用。ABA 信号途径转录因子基因HbSnRK响应ET、JA、GA 和SA 等激素的诱导，乙烯信号途径转录因子基因HbERF响应ABA、SA 和JA 等激素的调控，BR 信号途径转录因子基因HbBES1响应ET、JA、GA、SA和ABA等激素的诱导，GA信号途径的DELLA基因响应ABA、SA、ETH和生长素等的诱导，说明植物激素以交互方式对橡胶树的生长发育进行调控。可以预见，橡胶树激素生理的主要研究内容为：分析不同外源激素单独、联合施用或同步施用抑制剂证明激素调控胶乳产量的效应；分析不同激素信号途径基因表达量与胶乳产量之间的相关关系；完善橡胶树遗传转化体系，采用转基因技术解析激素协同调控胶乳产量的作用机制。

5.3 挖掘和鉴定橡胶树激素信号调控的关键转录因子

挖掘和鉴定橡胶树激素信号调控的关键转录因子是研究激素生理与分子机制的关键环节。例如，在其他植物中已证明MYB-bHLH 分子模块在调控植物次生代谢和生长发育中发挥重要作用［40］。Qin 等［41］前期研究发现橡胶树HbMYB44基因受多种激素诱导，在橡胶草（Taraxacum kok-saghyz）中过表达HbMYB44能显著提高转基因植株的根部NR 含量，同时上调橡胶草中TkMYB44同源基因和bHLH13等转录因子基因表达。推测Hb-MYB44 蛋白既可以通过直接与NR 合成酶基因启动子结合调控NR 合成酶基因的表达，又与HbbHLH13启动子结合从转录水平调控HbbHLH13的表达，同时通过蛋白互作形成HbMYB44-HbbHLH13 复合体调控NR 生物合成。可采用BiFC、LUC 和GST pull-down 等技术验证HbMYB44与HbbHLH13 的蛋白互作。创制过表达Hb-MYB44、HbbHLH13及共表达橡胶草进行功能验证。采用转录组、代谢组、ChIP-Seq 技术系统地解析转基因植株中NR等代谢物积累及NR合成基因表达的关系，阐明HbMYB44-HbbHLH13 分子模块调控NR生物合成的分子机制。

总之，将植物激素信号机制原理与技术引入橡胶树胶乳产量和品质形成的研究中，将为进一步阐明NR 生物合成的分子调控网路提供重要理论依据，为创制和选育高产优质橡胶树新品种和研发新技术提供重要的理论基础。