棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯复配杀蝇蛆的增效作用

李倩楠,马 园,郝陆瑶,张艳妮,郭志凯,丁玉林,杜 山,王 瑞

(内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室/国家级动物医学实验教学中心,内蒙古呼和浩特 010010)

棕色绿僵菌(Metarhiziumbrunneum)作为重要的生防菌之一,不仅可用于农林害虫的防治,还对家畜外寄生虫的生物防治有着良好的效果[1],具有巨大的生防潜力和开发前景[2]。作为一种来源于自然界的昆虫病原真菌,棕色绿僵菌具有不污染环境、无残留,对人畜无害等优点,被认为是一种环境友好型杀虫剂。昆虫病原真菌在侵染靶昆虫时,分生孢子附着于昆虫体壁,萌发为芽管或者形成附着孢[3],分泌蛋白酶和几丁质酶等对昆虫体壁具有降解作用的物质[4-8];当芽管穿透昆虫体壁进入血腔后,在寄主体内可以形成虫菌体,同时进行增殖,最终形成大量的虫菌体导致寄主的死亡[9-10]。由于从侵染虫体到诱导其发病需要较长的时间,导致其生物防治时间长、见效慢,因而未能在临床得到大规模应用。

高效氯氰菊酯是一种拟除虫菊酯类药物,常用于农业杀虫,主要防治农作物上发生的鳞翅目害虫,具有强毒性。因其具有较好的环境相容性、生物活性及对人畜安全性较好而被广泛使用,但长期使用不可避免的产生了一系列问题,如在污染环境的同时进入水源后具有较高生物毒性,同时也对某些益虫产生一定伤害,且长期反复使用还会使害虫产生大面积抗药性。近年来不同环境中频繁检出拟除虫菊酯,这也给水生生态系统造成重大风险。2017年欧洲暴发的氟虫氰“毒鸡蛋”事件引起了人们广泛关注。孙玲等[11]对叶菜进行了33种农药残留评估分析,结果检出22种农药残留,其中包括氯虫苯甲酰胺、联苯菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯等拟除虫菊酯类。化学杀虫剂的广泛使用导致抗药性的产生,而以昆虫病原真菌为活性成分的生物农药已经成为一种很有前景的替代策略。研究显示,使用化学药物与微生物制剂联合使用,可有效地提高病原菌的致死速度,如低剂量联苯菊酯对金龟子绿僵菌具有协同增效作用[12]。昆虫病原真菌与化学杀虫剂的联合使用可以弥补真菌杀虫剂作用效果相对较慢、致死率较低的缺点。鉴于此,在实验室前期研究基础上以单一棕色绿僵菌组和棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯复配制剂组进行杀蝇蛆毒性试验,验证高效氯氰菊酯是否对杀蝇蛆效率有增效作用,旨在为提高棕色绿僵菌对害虫的致死速度提供有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 棕色绿僵菌(Metarhiziumbrunneum),由内蒙古农业大学兽医学院寄生虫学研究室提供,保存于-80 ℃低温冰箱备用。

待试蝇蛆幼虫采自内蒙古四子王旗健康羊只新鲜粪便。

1.1.2 试剂与溶液 高效氯氰菊酯原药,青岛润农化工有限公司,丙酮、吐温-80、孢子洗脱液、生理盐水,天津市科盟化工工贸有限公司产品。

1.1.3 仪器设备 超净工作台(CW-CT-27-D),苏州净化设备有限公司产品;全自动高压锅(XFH-30CA),上海天美仪拓实验室设备有限公司产品;生化培养箱(SP-02),上海赫田科学仪器有限公司产品;分析天平(AY120),岛津企业管理(中国)有限公司产品;双目体式显微镜(PXS-100),上海光学仪器六厂产品。

1.2 方法

1.2.1 高效氯氰菊酯对蝇蛆的毒力测定 将高效氯氰菊酯原药用丙酮溶解后,用0.5%吐温-80把原药稀释为0.1～12.8 mg/L的溶液(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/L),然后采用浸渍法测定其对蝇蛆的100%致死浓度(LC100)及50%致死浓度(LC50)。试验时,将蝇蛆3日龄幼虫和蝇蛆6日龄幼虫,在不同浓度药液中浸渍5 s,然后放入培养皿中观察,2 h后检查供试蝇蛆的死亡数量。每浓度处理试虫10只,并重复3次,并设置对照组。

1.2.2 棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯的相容性测定

1.2.2.1 高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌菌丝生长情况影响 将1.2.1中高效氯氰菊酯毒力测定结果中3日龄蝇蛆100%致死的浓度(LC100)为剂量,按配方配制PDA固体培养基,121 ℃高压灭菌20 min,等其温度降至50 ℃左右时加入上述剂量高效氯氰菊酯,混匀后将配制好的培养基倒入平板中,冷却封口,然后4 ℃保存备用。以不含高效氯氰菊酯的PDA培养基为对照组,在培养基中央接种5 μL棕色绿僵菌,在25 ℃条件下恒温培养,测定其21 d菌丝生长直径。

1.2.2.2 高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌孢子萌发率影响 用含0.05%吐温-80的孢子洗脱液,将孢子粉配成浓度为1×107个孢子/mL的孢子悬液,按体积比1∶1加入等量既定浓度配制好的高效氯氰菊酯,将混合液滴入PDA固体培养基中于(25±1)℃相对湿度(95±1)%的智能恒温培养箱中培养,培养24 h和48 h后镜检孢子萌发情况,芽管长度超过孢子直径长度一半记为已萌发,每个重复统计200个以上孢子。以加不含农药的孢子悬液做为对照。分别统计孢子萌发率。

1.2.2.3 高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌产孢情况影响 将1.2.1中高效氯氰菊酯毒力测定结果中3日龄蝇蛆100%致死的浓度(LC100)为剂量,按配方配制PDA固体培养基,121 ℃高压灭菌20 min,等其温度降至50 ℃左右时加入上述剂量高效氯氰菊酯,混匀后将配制好的培养基倒入平板中,冷却封口,然后4 ℃保存备用。以不含高效氯氰菊酯的PDA培养基为对照组,在培养基中央接种5 μL棕色绿僵菌,在25 ℃条件下恒温培养,分别在第7、14、21、28天用0.5%孢子洗脱液冲洗培养皿,收集棕色绿僵菌的分生孢子,然后以血细胞计数板计数孢子产量,统计4个时间点的产孢情况。

1.2.3 棕色绿僵菌对蝇蛆毒力测定 以蝇蛆幼虫为试验对象,分别设置5种浓度的棕色绿僵菌分生孢子悬液处理组(1×104、1×105、1×106、1×107、1×108个/mL)和对照组(生理盐水)。把蝇蛆幼虫放入不同浓度的分生孢子悬液和生理盐水中停留10 s,然后放入无菌培养皿中,组内10个重复,每个浓度3次重复,在26 ℃恒温培养箱中培养7 d,每天按时观察幼虫活力,统计死亡率。

1.2.4 棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯复配制剂制备及对蝇蛆毒力测定 通过高效氯氰菊酯蝇蛆毒力测定结果,以及高效氯氰菊酯与棕色绿僵菌相容性情况综合分析,以高效氯氰菊酯对3日龄蝇蛆的致死中浓度(LC50)1.42 mg/L添加高效氯氰菊酯,与棕色绿僵菌孢子悬液混合制得棕色绿僵菌-高效氯氰菊酯联合制剂。杀蝇蛆毒性测定操作同1.2.3。

1.2.5 数据处理 运用Microsoft Excel 2013软件整理试验数据,以“平均值±标准差”表示;采用SPSS 21.0软件进行显著性检验,P>0.05表示差异不显著,P<0.05表示差异显著。蝇蛆死亡率在组间作2检验分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 高效氯氰菊酯对蝇蛆毒力的测定结果

通过高效氯氰菊酯对不同日龄蝇蛆毒力试验发现,高效氯氰菊酯对3日龄和3日龄蝇蛆的LC50分别为1.42 mg/L、3.43 mg/L,LC100分别为3.06 mg/L、7.26 mg/L。与6日龄蝇蛆相比,3日龄蝇蛆对高效氯氰菊酯更为敏感(表1)。

表1 高效氯氰菊酯对蝇蛆毒力的测定结果

2.2 棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯的相容性测定

2.2.1 高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌菌丝生长情况的影响结果 在高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌菌丝生长是否产生影响的试验中,对添加高效氯氰菊酯和未添加高效氯氰菊酯作用下的PDA固体培养基上菌丝生长情况进行了比较,结果见表2。结果显示菌丝生长情况差异不大,在第21天时,高效氯氰菊酯组和对照组菌丝体直径均可达到8 cm以上。对生长到第21天的高效氯氰菊酯组和对照组进行统计学分析,发现高效氯氰菊酯组菌丝体生长直径与对照组相比差异不显著(图1,P>0.5)。

图1 第21天高效氯氰菊酯组和对照组菌丝体生长直径统计结果

表2 菌丝体生长直径

2.2.2 高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌孢子萌发率影响结果 高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌孢子萌发率影响试验中,对添加高效氯氰菊酯和无高效氯氰菊酯作用下的孢子萌发率进行了比较,结果见表3。结果显示在第3天孢子萌发率均可达90%以上。

表3 孢子萌发测定结果

2.2.3 高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌产孢量影响结果 在高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌产孢量影响试验中,对孢子产量进行了比较,结果见表4。由表4中数据可知,从时间和产孢量两个因素看,两组产孢量均相差较小。对第28天高效氯氰菊酯组以及对照组累计孢子产量进行统计学分析,发现高效氯氰菊酯组的孢子产量与对照组差异不显著(P>0.5)。

表4 孢子产量测定结果(1×107个/mL)

综上所述,对高效氯氰菊酯组和对照组在菌丝体生长情况、孢子萌发率和孢子产量等方面进行比较,所得结果显示均差异不显著(P>0.5),表明棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯有较好相容性。

2.2.4 棕色绿僵菌对蝇蛆毒力测定结果 棕色绿僵菌侵染蝇蛆幼虫时,多先于头部、尾部侵染产生菌丝,逐步向体中部蔓延,最后扩展至蝇蛆整个体部,表面完全被白色菌丝包裹,随后菌丝由白色变为绿色,蝇蛆表面被绿色颗粒状孢子包围,部分蝇蛆被严重感染后,由于棕色绿僵菌的作用未能化蛹,尾部发生溃烂,并形成“僵虫”,导致死亡。

棕色绿僵菌对蝇蛆的杀灭作用结果见表5。在作用60 h时,即有蝇蛆开始死亡,死亡率与时间的增长成正比。分生孢子浓度越高,蝇蛆死亡所需时间越短,死亡率增长越快,累计死亡率也越高。当棕色绿僵菌分生孢子悬液的浓度达到1×106个/mL时,蝇蛆累计死亡率能够达到86.7%,说明此时的浓度对蝇蛆具有良好的杀灭效果。对蝇蛆死亡率在组间作2检验分析可知,当分生孢子悬液浓度为1×107、1×108个/mL时,蝇蛆的累计死亡率与1×106个/mL相比差异不显著(P>0.05),浓度增高但杀虫效率没有增高。浓度为1×104个/mL、1×105个/mL时杀虫效率较低,需要较长时间才能杀灭蝇蛆。因此确定棕色绿僵菌杀灭蝇蛆的分生孢子浓度为1×106个/mL时杀虫效果的性价比最高。

表5 棕色绿僵菌对蝇蛆的杀灭作用结果

2.2.5 高效氯氰菊酯与棕色绿僵菌联合对蝇蛆毒力测定 高效氯氰菊酯与棕色绿僵菌联合对家蝇幼虫的毒力测定结果见表6,通过结果分析可知1.42 mg/L高效氯氰菊酯与棕色绿僵菌联合使用确实可以增加棕色绿僵菌对蝇蛆的致死率,其中孢子浓度为1×108个/mL、1×107个/mL对蝇蛆的累计死亡率分别从90.0%、86.7%提高到100%;孢子浓度为1×106个/mL、1×105个/mL、1×104个/mL的累计死亡率分别从86.7%、50%、36.7%提高到93.3%、70%、63.3%。添加了高效氯氰菊酯的各孢子浓度杀虫效果均有所提高。统计分析发现(图2),添加了高效氯氰菊酯后比未添加高效氯氰菊酯组累计死亡率均有显著提高,特别是低浓度组(1×105个/mL、1×104个/mL)添加高效氯氰菊酯后致死率提高较多,与单独使用棕色绿僵菌时差异极显著(P<0.01)。

相邻字母之间差异显著(P<0.05),字母相间差异极显著(P<0.01)

表6 高效氯氰菊酯与棕色绿僵菌的联合对蝇蛆的毒力测定结果

3 讨论

研究发现,棕色绿僵菌在与高效氯氰菊酯联合应用时,对蝇蛆整体的防治效果更佳。通过测量棕色绿僵菌的菌丝生长情况、孢子萌发率和孢子产量等指标,发现即使在较高浓度高效氯氰菊酯的作用下,也不会对棕色绿僵菌产生不良影响,说明两者相容性良好,可以一起使用。这为棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯联合使用提供了理论支持。联合应用进行生物防治可以避免单纯依靠生物防治导致时间长、见效慢的问题。这一实践为今后研究棕色绿僵菌的生防制剂打下了基础,同时也为家畜寄生虫病的防治提供了新的选择和方向。

试验结果表明,与单独使用棕色绿僵菌相比,棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯联合使用对3日龄蝇蛆的毒性有显著增强,特别是添加低剂量的高效氯氰菊酯后,棕色绿僵菌对蝇蛆的致死作用更加明显。这可能是因为低剂量的高效氯氰菊酯降低了蝇蛆对外界刺激的敏感度,从而促进了分生孢子对昆虫体的附着。再者,高效氯氰菊酯导致蝇蛆的防御性结构发生改变,进而导致棕色绿僵菌分生孢子更容易侵入虫体,从而提高了致死效率。观察致死过程时,我们发现棕色绿僵菌感染蝇蛆可能是先从外部感染再向内部蔓延,最后再从内部向外扩散的过程。棕色绿僵菌最初侵染的部位常为头部和尾部,有可能是由于这些部位比其他部位更加脆弱。对于蝇蛆幼虫来说,低剂量的高效氯氰菊酯可以抑制幼虫的发育,使其发育时间延长,这也会给孢子侵入幼虫留下足够的时间,进而提高昆虫病原真菌的致死效率。其他研究,如球孢白僵菌和低剂量化学杀虫剂联用防治小菜蛾[13]、联苯菊酯和金龟子绿僵菌的配合使用[14],以及白僵菌和氟铃脲联合使用对甜菜夜蛾幼虫的毒力效果[15],这些研究表明低剂量的化学药物与昆虫病原真菌联用可以降低化学药物的使用量,并可提高生物防治效果。在此过程中发现,由于昆虫病原菌的存在,仅需使用低剂量甚至微量的化学药物便可达到防控目的。这样既减少了化学药物用量,又能够优于单独使用病原真菌或化学药物的防控效果。此外,加入真菌还可以在一定程度上避免长期反复使用化学药物导致产生耐药性等若干问题。高效氯氰菊酯不会对棕色绿僵菌的萌发和生长产生影响,但能够致死蝇蛆。这一研究结果解决了生物防治见效慢的问题,为今后研究棕色绿僵菌的生物防治制剂提供了新思路。在使用化学药物与昆虫病原真菌混合时,必须注意调整化学药物的用量,以免对环境中的天敌产生影响[16]。因此,要尽可能地控制化学药物的使用浓度。