云南省部分地区牛的3种肠道原虫分子检测与鉴定

谢昕言,王开胜,徐翠蓉,陈俊蓉,邓梦玲,杨建发,贺君君,邹丰才,黄建新

(1.云南农业大学动物医学院,云南昆明 650201;2.玉林师范学院,广西玉林 537000;3.大理农林职业技术学院动物科学院,云南大理 671003)

十二指肠贾第虫(Giardiaduodenalis)、芽囊原虫(Blastocystissp.)和毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoonbieneusi)是能够造成人和动物腹泻的常见肠道寄生虫,且能通过食物和水源进行传播。通过基因分型,十二指肠贾第虫目前共被分作9种集聚体,集聚体A和集聚体B是人畜共患集聚体,而牛通常感染集聚体E[1];芽囊原虫共发现了17种基因型,牛作为芽囊原虫的宿主之一,可感染7种基因亚型的芽囊原虫[2],其中ST1、ST3亚型为人畜共患基因亚型[3];通过ITS分型目前将发现的240种毕氏肠微孢子虫基因型分为9个组(Group1～9),其中Group1内大部分为人畜共患基因型,但目前研究证明具有物种特异性的Group2中的部分基因型(如BEB6,BEB4,J等)也具有人畜共患潜力[4]。

而在牛养殖业中,通常会产生大量的粪便以及生产废物,导致污染周围水体环境,如果这些污染物中存在十二指肠贾第虫等能人畜共患肠道寄生虫,则会对周边的人或动物造成感染[5]。云南省在我国的牛肉供给中占有重要地位,但关于该地区的牛十二指肠贾第虫、芽囊原虫以及毕氏肠微孢子虫感染及基因型分布报道较少。本研究拟对云南省2个地区的肉牛和奶牛规模养殖场内牛肠道寄生虫感染情况以及基因型的分布进行调查,为云南省养牛业的人畜共患肠道寄生虫防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 在云南省大理市和楚雄市的奶牛养殖场以及肉牛养殖场采集新鲜牛粪便样品共140份,其中奶牛场共采集到69份,包括犊牛35份,成年牛34份;肉牛场共采集到71份牛粪便样品,包括犊牛14份,成年牛57份。采集后将每份粪便样品单独置于一次性塑封袋中,标记样品信息并带回实验室置于4 ℃冰箱保存待检。

1.1.2 主要试剂 牛粪便样品DNA提取试剂盒,Omega Bio-tek公司产品;琼脂糖粉、dd H2O、1×TAE缓冲液,天根生化科技有限公司产品;2× SanTaqPCR Mix 预混液、DNA标准DL 2 000,宝生物工程有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 数显恒温水浴锅HH-1,江苏杰瑞尔电器有限公司产品;台式微量离心机Microfuge®20,贝克曼库尔特有限公司产品; Applied Biosystems SimpliAmpTM热循环仪,赛默飞世尔科技公司产品;电泳仪WIX-EP600,韦克斯科技有限公司产品;凝胶成像仪Gelview 5000,广州博鹭腾生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 将采集到的牛粪便样品按照粪便样品提取试剂盒使用说明提取所采集粪便样品中的DNA,并将DNA保存在-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 肠道原虫的PCR扩增

1.2.2.1 十二指肠贾第虫bg基因的PCR扩增 参考黄玫瑰[6]的十二指肠贾第虫β-贾第素(bg)基因引物序列。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。第1轮使用外引物G7F(5′-AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC-3′)和G7R(5′-GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC-3′),反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35个循环;72 ℃再延伸10 min。第2轮PCR使用内引物GF(5′-GAACGAACGAGATCGAGGTCCG-3′)和GR(5′-CTCGACGAGCTTCGTGTT-3′),退火温度为60 ℃,其他反应条件与第1轮相同。

1.2.2.2 芽囊原虫SSUrRNA基因的PCR扩增 根据Scicluna S M等[7]的文献中给出的芽囊原虫小亚基核糖体RNA(SSUrRNA)基因引物序列,使用RD5(5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)和BhRDr(5′-GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3′)引物对芽囊原虫SSUrRNA基因进行PCR扩增和检测,反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 45 s,57 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35个循环;72 ℃终延伸10 min。

1.2.2.3 毕氏肠微孢子虫ITS基因的PCR扩增 参照Buckholt M A等[8]的毕氏肠微孢子虫的ITS基因扩增程序合成引物。套式PCR第1轮使用的外引物为NEBF1(5′-GGTCATAGGGATGAAGAG-3′)和NEBR1(5′-TTCGAGTTCTTTCGCGCTC-3′),反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35个循环;72 ℃再延伸10 min。第2轮使用的内引物为NEBF2(5′-GCTCTGAATATCTATGGCT-3′)和NEBR2(5′-ATCGCCGACGGATCCAAGTG-3′),延伸时间为40 s,其他反应条件与第1轮相同。

1.2.3 PCR产物测序及序列分析 将符合预期大小的阳性PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序,测序结果进行拼接,并于NCBI进行Blast在线比对分析;通过MEGA7软件中的领接法将NCBI数据库中的参考序列与本研究获得的基因序列进行比较,构建遗传发育进化树,并利用Bootstrap的方法进行1 000次重复验证。

1.2.4 数据处理 使用分析软件SPSS20对不同年龄阶段以及不同品种的牛检出的十二指肠贾第虫、芽囊原虫和毕氏肠微孢子虫阳性率进行统计学分析,当P<0.05时具有统计学意义。

2 结果

2.1 感染情况

2.1.1 十二指肠贾第虫检测结果 对140份牛粪便样品进行十二指肠贾第虫bg基因套式PCR扩增,结果显示(表1),奶牛场牛粪粪样中共11份样品PCR扩增后出现530 bp的条带,部分电泳结果如图1所示。所有阳性样品均成功测序,阳性率为7.86%,所有阳性样品序列在Blast上进行同源性比对后相似率均在98%以上。从年龄上看,犊牛共有9份阳性样品,成年牛共有2份阳性样品。其中10份样品鉴定为集聚体E,其中犊牛8份,成年牛2份;1份犊牛粪样鉴定为集聚体A。肉牛场牛粪粪样中均未检出十二指肠贾第虫。

M.DNA标准DL 2 000;P.阳性对照;N.阴性对照;1.阳性样品

表1 规模化牛场牛粪便样品十二指肠贾第虫检测结果

统计学分析显示,本研究调查地区规模化奶牛养殖场中不同年龄阶段的十二指肠贾第虫阳性率差异均极显著(P<0.01)。

2.1.2 芽囊原虫检测结果 芽囊原虫的PCR检测结果(表2)显示,有36份样品扩增出600 bp的阳性条带,部分电泳结果如图2所示。将阳性样品进行测序后所有样品均成功测序,经Blast同源性比对后均在98%以上,阳性率为25.71%。奶牛场共检出20份为阳性,其中犊牛8份,成年牛12份;肉牛场共检出16份为阳性(犊牛4份,成年牛12份)。将阳性样品序列在NCBI中Blast比对后,共6份鉴定为ST5,其中奶牛场犊牛2例,成年牛2例,肉牛场成年牛2例; 28例鉴定为ST10,其中奶牛场犊牛5例,成年牛10例,肉牛场犊牛2例,成年牛11例; 3例鉴定为ST14,其中奶牛场犊牛1例,肉牛场犊牛2例。统计学分析发现,云南部分地区规模化牛养殖场中不同年龄阶段牛以及不同养殖场的芽囊原虫阳性率差异均不显著(P>0.05)。

M.DNA标准DL 2 000;P.阳性对照;N.阴性对照;1.阳性样品

表2 规模化牛场牛粪便样品芽囊原虫检测结果

2.1.3 毕氏肠微孢子虫检测结果 通过PCR扩增共有12份样品在毕氏肠微孢子虫ITS基因扩增出392 bp阳性条带,部分电泳结果见图3。毕氏肠微孢子虫检测结果如表3所示,所有阳性样品均成功测序,经Blast同源性比对后均在97%以上,阳性率为8.57%,其中奶牛场共检出11份阳性(犊牛10份,成年牛1份),肉牛场共1份成年牛牛粪检出阳性。将阳性样品测序后经Blast比对后共11例鉴定为BEB4型,其中奶牛场犊牛10例,成年牛1例;1例肉牛场成年牛鉴定为J型。统计学分析发现,云南部分地区规模化牛养殖场中不同年龄阶段与不同养殖场牛的毕氏肠微孢子虫阳性率差异均极显著(P<0.01)。

M.DNA标准DL 2 000;P.阳性对照;N.阴性对照;1、2.样品

表3 规模化牛场牛粪便样品毕氏肠微孢子虫检测结果

2.2 进化树的构建

2.2.1 十二指肠贾第虫测序结果 基于十二指肠贾第虫bg基因构建进化树,由进化树(图4)可见:集聚体E阳性样品与意大利流行虫种(KR075939)位于同一分支上,说明与本研究中的十二指肠贾第虫亲缘关系较近;集聚体A阳性样品与MZ822159位于同一分支上,说明二者亲缘关系较近。

●.本研究中所获得的序列●.The sequence obtained in this study

2.2.2 芽囊原虫测序结果 基于芽囊原虫SSUrRNA构建进化树,进化关系(图5)显示,鉴定为ST5基因型阳性的样品与伊朗流行虫种(MN315647)、德国流行虫种(MK801383)以及菲律宾流行虫种(KP233725)位于同一分支,有较为相近的亲缘关系,鉴定为ST14基因型的样品与孟加拉国流行虫种(MN338087)、伊拉克流行虫种(LT594969)处于同一分支,关系较为接近;鉴定为ST10基因型样品与马来西亚流行虫种(MG831489)位于同一分支上,关系较为接近。

●.本研究中所获得的序列●.The sequence obtained in this study

2.2.3 毕氏肠微孢子虫测序结果 基于毕氏肠微孢子虫ITS基因构建进化树,由进化树(图6)可知,检测为BEB4基因型的样品与中国流行虫种(MH732750 、OK393647)的亲缘关系较为接近,检测为J基因型的样品与中国流行虫种(AF135837、OK393646、MN704931)亲缘关系较为接近。

●.本研究中所获得的序列●.The sequence obtained in this study

3 讨论

3.1 牛肠道3种原虫的检测结果分析

本研究调查的规模化牛场十二指肠贾第虫总感染率为7.86%(11/140),其中犊牛的阳性率为16.33%,(8/49),高于成年牛的阳性率3.30%(3/91),且根据卡方检验可知,不同年龄之间十二指肠贾第虫阳性率差异极显著(P<0.01);Meng X Z等[9]对中国地区的牛十二指肠流行情况进行分析后发现中国牛群存在普遍的十二指肠贾第虫的感染,且不同季节、不同地区的感染率有显著差异;Trout J M等[10]发现犊牛的十二指肠贾第虫感染率要高于成年牛。本研究的结果与前人的研究相符,说明牛十二指肠贾第虫的感染可能与牛的年龄有关,这可能是由于犊牛尚在发育阶段,抵抗力较成年牛较弱,因此更容易被感染。而本研究中肉牛场尚未检测出十二指肠贾第虫阳性样品,仍需更多研究对该地区肉牛场进行十二指肠贾第虫检测。

本研究中的牛芽囊原虫的总感染率为25.71%(36/140),其中犊牛的芽囊原虫阳性率为22.45%(7/49),成年牛阳性率为27.47%(3/91),虽然成年牛的阳性率略高于犊牛阳性率,但卡方检验结果显示不同年龄之间芽囊原虫阳性率并不显著(P>0.05),说明本研究中的牛芽囊原虫阳性率与牛的年龄无关;奶牛场的芽囊原虫阳性率为28.99%(20/69),肉牛场的芽囊原虫阳性率为24.22%(16/71),卡方检验结果显示不同养殖场之间芽囊原虫的阳性率也不显著(P>0.05),说明两者之间并无关系,研究结果与普丽花等[11]和王莎莎[12]的研究结果一致,这可能说明芽囊原虫对任意年龄以及品种的牛均易感。

本研究调查云南省两个地区牛场毕氏肠微孢子虫的总感染率为8.57%(12/140),调查结果低于世界范围的毕氏肠微孢子虫阳性率5.00%[13]。从不同年龄段来看,犊牛的毕氏肠微孢子虫阳性率为20.41%(10/49),高于成年牛阳性率(2.20%,2/91),经卡方检验可知,不同年龄段牛的毕氏肠微孢子虫感染率差异极显著(P<0.01),这可能说明所调查地区牛毕氏肠微孢子虫的流行与牛的年龄有关,且年龄越小越容易被感染,这可能与犊牛的抵抗力较弱有关。从不同类型养殖场来看,奶牛场的毕氏肠微孢子虫阳性率为15.94%(11/69),高于肉牛场阳性率(1.41%,1/71),且经过卡方检验可知该地区不同类型养殖场的阳性率差异极显著(P<0.01),这可能说明奶牛相较于肉牛更容易感染毕氏肠微孢子虫,也可能说明所调查的奶牛养殖场周围环境或水源存在污染。

3.2 肠道3种原虫基因分型情况以及对人感染风险分析

本研究共在云南省2个地区养殖场的牛粪中检测出集聚体A和集聚体E 2种十二指肠贾第虫基因型,其中以集聚体E为主,且占总阳性数的90.91%(10/11),集聚体A占总阳性数的9.09%(1/11)。十二指肠贾第虫又包括9种集聚体,其中集聚体A、B为人兽共患型集聚体,对人及多种哺乳动物易感,集聚体E是牛、羊家畜中最常感染的集聚体[14]。我国牛贾第虫感染以集聚体A和E的感染为主,其中E为优势感染基因型。本研究的感染情况检测结果与前人的研究结果相符。集聚体A作为人畜共患型集聚体能够感染绝大部分脊椎动物包括人类,被认为是最重要的人畜共患集聚体[15],感染十二指肠贾第虫集聚体A的患者通常会出现间歇性腹泻的症状,严重者可能因腹泻引起脱水[16];而近期也有研究称在人体内发现了集聚体E型,这可能说明之前被认为具有宿主专一性的十二指肠贾第虫集聚体型也存在人畜共患的可能性[17]。

本研究中共检测出3种芽囊原虫SSUrRNA基因型(ST5、ST10、ST14),其中优势基因型为ST10,与付寅等[18]的研究结果相符合。目前共发现芽囊原虫的17种基因型,不同的基因型在不同类型的宿主中有明显的分布差异[19]。牛和人都是芽囊原虫的宿主之一, 两者可共同感染ST1、ST3亚型,人感染后会出现如呕吐、腹泻等消化道症状,严重者甚至会发烧[20]。虽然本次研究中所鉴定出的基因型目前并未发现能够感染人类,但已经有报道指出牛可携带芽囊原虫的人畜共患基因型,例如Chen H等[21]在中国黑龙江省人与家畜芽囊原虫的流行病学的调查中发现牛与人之间存在共患亚型;Abdo S M等[22]在埃及北都对牛、羊等家畜以及人类感染的芽囊原虫基因亚型进行比对后发现这些不同基因型的芽囊原虫间具有密切的进化关系,这可能说明牛、羊等家畜感染的芽囊原虫也具有人兽共患潜力,因此防控牛芽囊原虫具有公共卫生意义。

本研究调查共检测出2种毕氏肠微孢子虫ITS基因型(BEB4、J),其中BEB4型仅在奶牛场被检测出,J型仅在肉牛场中被检测出。毕氏肠微孢子虫目前全球共发现260多种基因型,牛是毕氏肠微孢子虫包括I、J、BEB4、BEB6等Group2基因型的主要宿主[23],目前已在牛上发现超过40种基因型,且存在J型、I型和BEB21型等人畜共患基因亚型的感染,而人在感染毕氏肠微孢子虫后会出现腹泻的症状[24]。据调查,牦牛、肉牛、奶牛均可感染基因型BEB4和J,且这两种基因型也已经有感染人类的相关报道[25-26],可能对畜牧业工作人员以及相关肉质产品的消费者的健康造成危害,因此该地区应当重视对牛毕氏肠微孢子虫的防控。

综上所述,本研究中受调查地区的牛场中存在十二指肠贾第虫、芽囊原虫和毕氏肠微孢子虫的流行,阳性率分别为7.86%,25.71%和8.57%,且检测到了十二指肠贾第虫和毕氏肠微孢子虫的人畜共患基因型,因此应当加强调查地区牛场肠道寄生原虫的重视,并采取有效防控措施,保障地区的公共卫生安全。