仰口线虫PCR检测方法的建立及应用

周璐露,要慧中,刘天缘,张佳琳,马 丽,任洪英,杨钰莹,林 青*

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100; 2.炉霍县农牧农村和科技局,四川炉霍 626500)

仰口线虫(Bunostomumspp.)是一种全球范围内反刍动物消化道寄生虫,潮湿多雨的环境有利于其生长,具有一定季节性[1-2],主要寄生于反刍动物的小肠内,其中,寄生于羊的仰口线虫种类主要为羊仰口线虫(B.trigonocephalum),但有时牛仰口线虫(B.phlebotomum)也可感染羊只[3]。仰口线虫的幼虫在宿主体内移行时引起的组织炎症反应会导致宿主出现咳嗽等呼吸系统症状,严重时,肺脏出现淤血性出血和点状出血等机械性损伤。成虫吸食宿主血液,还可分泌毒素,不仅使损伤局部血液不断流失,引起贫血,还引起宿主中毒,导致幼畜生长发育缓慢。仰口线虫利用口囊吸附在宿主小肠壁上,导致小肠多点状出血,黏膜炎性肿胀,严重感染时,宿主发生稀血病及恶病质,常因衰竭死亡[4]。

传统的线虫形态学诊断常用方法是光学显微镜镜检法,其具有操作简单、结果直观且成本低廉等特点。仰口线虫病除了通过特征性的临床病变以及尸检时发现胃肠道中的虫体来确诊外,还可在生前从粪便中检测出仰口线虫虫卵来确诊。临床中常采用检测每克粪便中的虫卵数(eggs per gram of faeces,EPG)对线虫感染进行定性和定量测定[5]。但受限于镜检敏感度,有时也存在漏检情况。

近年来,各种分子生物学技术发展迅速,逐渐完善的分子生物学诊断方法也使得其成为寄生虫病诊断的一种重要手段。聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术具有快速、高效、便捷和特异性强等优点[6-7],现已逐渐推广应用于胃肠道线虫的诊断、种属鉴定和系统发育学研究等多个方面[8-9]。本研究将基于羊源仰口线虫核糖体DNA的ITS基因序列设计属特异性引物,建立一种可在粪便样品中检测仰口线虫卵的PCR技术,从而为仰口线虫病的诊断提供一种可选择的方法,该方法也可应用于仰口线虫病的监测和预防。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体样品 仰口线虫30条,其中,采自于陕西咸阳地区的山羊29条,采自于秦岭羚牛1条;食道口线虫、毛圆线虫、毛尾线虫、细颈线虫、奥斯特线虫、夏伯特线虫、捻转血矛线虫、美丽筒线虫等虫体阳性DNA样品,均由西北农林科技大学兽医寄生虫学实验室保存并提供。

1.1.2粪便样品 新鲜山羊粪便样品200份,均采自陕西省咸阳及周边地区奶山羊场。

1.1.3主要试剂 本试验所用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304-02),宝日医生物技术(北京)有限公司产品;高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107)和DNA纯化回收试剂盒(DP214),天根生化科技(北京)有限公司产品;OMEGA粪便基因组DNA提取试剂盒(D4015),北京索莱宝生物科技有限公司产品。其他主要试剂:溴化乙锭(ethidium bromide,EB)、琼脂糖以及TaKaRa ExTaqDNA聚合酶®(RR001A)、T-vector pMD 19(Simple)载体(3271)、DNA标准DL 2 000(3427A),宝日医生物技术(北京)有限公司产品;大肠埃希氏菌JM109感受态细胞(G6014-20)、氨苄青霉素贮存液(A1170)、LB固体培养基干粉(L1015)、LB液体培养基干粉(L1010),北京索莱宝生物科技有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 光学生物显微镜(Eclipse 50i),日本尼康公司产品;高速离心机(HC-2514),安徽中科中佳科学仪器有限公司产品;微量分光光度计(Nano-100),杭州奥盛仪器有限公司产品;梯度PCR仪(PR-96E),杭州米欧仪器有限公司产品;全自动凝胶成像分析系统(ChampGel5000),北京赛智创业科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 仰口线虫虫体DNA的提取 仰口线虫的基因组DNA使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒,参考说明书操作,所得DNA置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR检测方法的建立

1.2.2.1 引物设计 参考GenBank中的羊源仰口线虫序列(登录号为MG182022、GQ859497等),基于仰口线虫ITS基因序列,运用ClustalX1.83、MEGAX等软件来筛选属内保守、属间高变的碱基序列位点,利用Oligo7以及NCBI内置的Primer-Blast等引物设计软件,设计羊源仰口线虫的属特异性上、下游引物,引物信息见表1。

表1 仰口线虫(Bunostomum)PCR引物

1.2.2.2 仰口线虫PCR反应体系的建立 反应总体系为25 μL:10× ExTaqPCR buffer(Mg2+free)2.5 μL,dNTP Mixture 2 μL,MgCl2(25 mmol/L)2 μL,上、下游引物(10 μmol/ L)各1 μL,ExTaqDNA聚合酶 0.125 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 15.375 μL。反应条件设定为:94℃ 5 min;94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 1 min,共35个循环;72℃ 7 min。

退火温度优化:设置温度梯度分别为60、59、58、57、56、55、54、53、52℃,以探究最佳退火温度。

Mg2+浓度优化:将Mg2+浓度梯度设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mmol/L,以探究最佳Mg2+浓度。

1.2.2.3 特异性试验 通过对仰口线虫、食道口线虫、毛尾线虫、捻转血矛线虫、细颈线虫、奥斯特线虫、夏伯特线虫、筒线虫和毛圆线虫等羊常见胃肠道线虫的DNA样本进行PCR扩增,以ddH2O为阴性对照。为确保结果的可重复性,每个试验重复3次。扩增后将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,电压设为120 V,电泳时间26 min,电泳结果用凝胶成像分析系统进行观察,并将结果为阳性的PCR原液送测序公司进行测序验证,以确保扩增结果的准确性。

1.2.2.4 敏感性试验 用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对仰口线虫的PCR扩增目的产物进行纯化与回收,将回收产物连接到pMD-19T SimpleⅠ载体上,并将连接产物转化到大肠埃希氏菌JM109感受态细胞。37 ℃条件下,在LB固体培养基上过夜培养12～14 h,挑取单个菌落接种于盛有1 mL LB液体培养基(含1.5 μL氨苄青霉素)的离心管内,置于摇床中(设定转数为220 r/min),恒温37 ℃条件下培养12 h。利用所建立的PCR对菌落进行鉴定后,对测序结果正确的阳性质粒扩摇并提取质粒(高纯度质粒小提中量试剂盒)。原始质粒模板测定核酸浓度后按10倍倍比稀释,用建立的PCR对不同浓度的DNA模板行PCR扩增,以探究最低可检出的浓度。为确保试验的可重复性,每个试验需进行3次重复。

1.2.3 临床样品的检测

1.2.3.1 光学显微镜检查 采用饱和食盐水漂浮法对山羊新鲜粪便样本进行常规的形态学检查,通过观察虫卵的大小、颜色、卵壳厚度、形状及卵内容物等形态特征来鉴定其种类并记录结果。

1.2.3.2 粪便样品PCR检测 参照OMEGA粪便基因组DNA提取试剂盒说明书提取山羊粪便样品DNA并进行PCR扩增,通过电泳凝胶观察后将所有阳性PCR产物送测,以确保目的基因片段的准确性。

2 结果

2.1 PCR反应退火温度优化结果

优化PCR反应条件中的退火温度,结果显示,当退火温度为57 ℃时,扩增出最亮的目的条带且无杂带出现(图1),即该PCR反应的最佳退火温度为57 ℃。

M.DNA 标准 DL 2 000;1～9.退火温度分别为60、59、58、57、56、55、54、53、52 ℃;10.阴性对照

2.2 PCR反应Mg2+浓度优化结果

对PCR反应条件中的最佳Mg2+浓度进行优化,扩增结果无杂带出现,且当Mg2+浓度为2.5 mmol/L时,目的条带最亮(图2),即该PCR反应的最佳Mg2+浓度为2.5 mmol/L。

M.DNA 标准 DL 2 000;1～9.Mg2+浓度梯度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mmol/L;10.阴性对照

2.3 PCR特异性试验结果

PCR特异性试验电泳检测结果显示,除仰口线虫DNA模板扩增出一条500 bp大小的特异性条带外,其他线虫的DNA模板扩增结果均为阴性(图3)。且出现阳性条带样品的测序结果,经在NCBI上Blast比对显示,与GenBank数据库中仰口线虫基因的多条参考序列相似度均达99%以上,表明该PCR方法特异性良好。

M.DNA 标准 DL 2 000;1～9.DNA模板依次为仰口线虫、食道口线虫、毛尾线虫、捻转血矛线虫、细颈线虫、奥斯特线虫、夏伯特线虫、筒线虫、毛圆线虫;10.阴性对照

2.4 PCR敏感性试验结果

原始DNA质粒模板浓度为1 276 ng/μL,10倍倍比梯度稀释后的PCR扩增结果显示,该PCR最低能检测到的仰口线虫DNA浓度为3.6×103copies/μL(图4),表明其敏感性较高。

M.DNA 标准 DL 2 000;1～11.质粒模板稀释倍数依次为100、101、102、103、104、105、106、107、108;10.阴性对照

2.5 临床样品检测结果

2.5.1 山羊粪便样品显微镜检查结果 200份奶山羊粪便样品中,通过显微镜镜检法共检出仰口线虫卵阳性20份,即阳性检出率为10%。

2.5.2 山羊粪便样品PCR检测结果 通过本研究建立的PCR方法,从200份奶山羊粪便样品中共检出20份阳性样品,阳性检出率为10%。将全部阳性粪便样品的PCR产物送北京擎科生物科技股份有限公司测序后进行相似性比对,结果显示,20份阳性样品中的测序结果与GenBank数据库内收录的多条仰口线虫基因参考序列相似度均达99%,故可判定这20份粪便样品均为仰口线虫阳性。经比对,以上2种方法检出的20份阳性样本完全一致。

3 讨论

在线虫的种属鉴定中,广泛应用的特异性PCR一般均具有较高的敏感性和特异性,因此,PCR在线虫种类鉴定、新物种发现以及种群遗传结果关系等方面的研究具有重要意义[10-12]。此外,由于ITS核糖体DNA在物种进化中拥有较快的进化速率,且受到的选择压力较小,被认为是可靠的分子遗传标记[12]。本研究设计并筛选了一对仰口线虫ITS区域基因的特异性引物,优化了退火温度和Mg2+浓度等反应条件,初步建立了一种特异性的仰口线虫PCR检测方法。

试验中选取了羊的几种胃肠道线虫作为对照,结果显示仅仰口线虫基因组DNA能扩增出500 bp的特异性单一条带,其他几种线虫的DNA模板扩增结果均为阴性,说明该PCR检测方法的特异性良好,可确保完成对仰口线虫进行特异性鉴别。在反应体系和反应条件优化的试验中可见,52～60 ℃的退火温度梯度中均能成功扩增出单一条带,且在57 ℃时电泳条带最亮;另外,在1.5～4.0 mmol/L的Mg2+浓度梯度中均可见单一条带,且在Mg2+浓度为2.5 mmol/L时条带最亮,由此,本研究将PCR反应体系中的最佳Mg2+浓度确定为2.5 mmol/L,并将该PCR反应条件中的最佳退火温度确定为57 ℃。优化反应体系后在最佳PCR扩增条件下,将梯度稀释的不同质粒DNA样品进行PCR扩增,检测该方法的敏感性,结果显示其最低可检出的浓度为3.6×103copies/μL,表明该PCR具有较高的敏感性。

仰口线虫感染宿主后通过粪便向外排出虫卵,因此,可在临床中通过对粪便DNA进行PCR扩增来检测仰口线虫卵是否存在于粪便中,进而确定羊只是否感染了仰口线虫,以达到确诊的目的[13]。传统粪便检查中,使用显微镜进行虫卵的检测与辨别,需要依靠检验人员长期积累的经验来识别和区分,往往导致主观判定的结果准确性与可靠度不高[14]。为弥补光学显微镜镜检方法的不足,本研究将所建立的PCR优化后,通过对山羊粪便样品的仰口线虫感染情况进行检测,并与显微镜镜检结果进行比对,结果显示2种方法检测的仰口线虫阳性率均为10%,且阳性样品完全一致,表明PCR检测粪便样品中是否含有仰口线虫的虫卵,其结果具有一定的可靠性。邹敏等[15]建立的捻转血矛线虫PCR检测方法,在直接检测粪便虫卵时感染率准确度高于传统光学显微镜镜检。在甘南牦牛3种消化道线虫多重PCR检测方法的建立中,郝明超等[16]将其应用于临床粪便虫卵检测,验证结果准确度较高。那璐等[17]建立的PCR检测方法在东方次睾吸虫感染的粪便检测中具有较高的特异性和灵敏性。本研究所建立的PCR检测方法在结果上与镜检结果一致,这可能是受限于镜下虫卵形态,粪便保存状态,环境温度而导致。

本研究结果表明,所建立的羊源仰口线虫特异性PCR具有良好的特异性和较高的敏感性,可将其应用于临床中羊粪便样品的检测,这为羊仰口线虫病的临床诊断提供了一种新的可靠的技术选择。