氯氰菊酯降解菌的分离鉴定及降解特性研究

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(1.浙江工业大学 生物与环境工程学院,浙江 杭州 310014；2.中国水稻研究所，浙江 杭州 310006)

氯氰菊酯(cypermethrin)作为一种广谱高效的拟除虫菊酯类杀虫剂，因其高效用和低哺乳动物毒性而广泛用于农业病虫害的防治，是茶树、果树、蔬菜等农作物病虫害防治的主要农药之一.研究表明：氯氰菊酯对一些水生生物、蜜蜂等非靶标生物有较大毒性，对人的生殖健康有严重危害[1-4].由于氯氰菊酯稳定性高，半衰期长，在果蔬、食品、环境中残留量大，影响农产品的质量及人类的身体健康.随着人们对生活质量的要求不断提高，解决农药残留，提高食品和环境安全已经成为一个亟待解决的课题.

微生物降解是指利用微生物将存在于环境中的毒害污染物降解或转化为其他无害物质，被公认为是一种有效、廉价、无二次污染的方法.同时，利用微生物进行农药降解还具有操作简便、繁殖快、生态恢复性好等优点.有关氯氰菊酯的降解菌主要在假单胞菌属(Pseudomonassp.)[5-6]、沙雷氏菌属(Serratiasp.)[7]、芽孢杆菌属(Bacillussp.)[8]等微生物种类中被发现.本研究筛选分离到1株能高效降解氯氰菊酯的恶臭假单胞菌(Pseudomonsaputida)LQK-14，研究其降解特性，并对其降解酶定域，为其在生物修复中的应用提供了实验数据和理论基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 培养基

基础培养基(MM)：NaCl 1.0 g，K2HPO41.5 g，NH4NO31.0 g，KH2PO40.50 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌备用.

筛选培养基：基础培养基中按试验设计要求添加20～800 mg/L的氯氰菊酯作为惟一碳源.氯氰菊酯溶解在少量丙酮中，与灭菌后放置冷却于45 ℃的基础培养基相混合.

1.1.2 供试农药与标样

95%氯氰菊酯农药原药，南京荣诚化工有限公司；氯氰菊酯标样，北京康林科技有限公司生产，纯度≥98.5%.

1.2 实验方法

1.2.1 菌种筛选和纯化

采集受氯氰菊酯污染的茶园和农药厂废水处理池附近的土壤.称取一定量土壤，制成菌悬液，无菌稀释后涂布含有100 mg/L氯氰菊酯的分离培养基上，30 ℃下培养48～72 h，待长出单菌落后，采用平板划线法分离纯化，纯化时逐步增大培养基中所加的氯氰菊酯质量浓度，直至达到800 mg/L.

1.2.2 菌种鉴定及系统发育研究

参照文献[9]进行菌株形态观察.挑取氯氰菊酯降解菌的单菌落于20 μL ddH2O中，漩涡混匀后，置于PCR仪中99 ℃，10 min，12 000 r/min离心30 s，上清液直接作为PCR反应的模版.扩增引物为一对通用引物，正向引物F27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物R1492：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海生物工程有限公司合成.50 μL反应体系：10×buffer(with 15 mmol/L MgCl2)5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，5 μmol/L引物各2 μL，基因组DNA模板3 μL，ddH2O 36.5 μL，Taq酶0.5 μL.PCR反应条件为95 ℃预变性4 min；95 ℃反应1 min，56 ℃反应30 s，72 ℃反应90 s，循环35次；72 ℃反应5 min.采用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增产物后，由上海华大基因公司测序.将测得的基因序列通过NCBI-BLAST进行序列比对分析.菌体形态的电镜观测照片委托浙江大学生物技术研究室电镜中心拍摄.

1.2.3 氯氰菊酯的降解试验

选取纯化后的单个菌株，以初始接种量OD600≈0.3接种以氯氰菊酯为唯一碳源的基础培养基中，设不接菌为对照，每处理重复3次，于30 ℃，摇床200 r/min，培养7 d.培养液中残留的氯氰菊酯用2倍体积的石油醚抽提，10 000 r/min离心5 min，吸取上层有机相，用HPLC检测.检测条件：高效液相色谱仪型号为Agilent PH1100型(带工作站)，色谱柱Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm)，柱温30 ℃，流动相V(乙腈)∶V(水)= 85∶15，流速1 mL/min，检测波长235 nm，进样量20 μL.外标法定量，本检测方法样品中氯氰菊酯的含量以两峰的峰面积总量计.氯氰菊酯降解率计算式为

1.2.4 降解条件

1) 培养基初始pH对LQK-14降解氯氰菊酯的影响

将基础盐培养基的pH值分别调节为为5，6，7，8和9(含100 mg/L氯氰菊酯)，以5%的接种量接种，30 ℃，摇床200 r/min培养7 d，测定其生长状况和农药含量.

2) 温度对菌株生长和降解氯氰菊酯的影响

以5%的接种量接种于含100 mg/L氯氰菊酯基础培养基，分别于20，25，30，35，40 ℃，摇床200 r/min培养7 d，测定其生长状况和农药含量.

3) 碳源种类对氯氰菊酯降解的影响

按照0.1%(m/v)的比例在基础培养液中分别添加葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉和甘油作为外源碳源，以5%的接种量接种后置于30 ℃，200 r/min摇床培养7 d，测定降解率.

4) 氮源种类对氯氰菊酯降解的影响

按照0.1%(m/v)的比例在MM培养液中分别添加牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、氯化铵和硫酸铵作为外源氮源，以5%的接种量接种后置于30 ℃，200 r/min摇床培养7 d，测定降解率.

5) 氯氰菊酯初始浓度对降解的影响

在基础盐培养基中加入氯氰菊酯，使其终质量浓度分别为25，50，100，200，300 mg/L，按5%的接种量接入降解菌种子液，于30 ℃，摇床200 r/min培养7 d，测定其生长状况和农药含量.

1.2.5 降解酶的定域

应用渗透休克方法进行研究，具体试验方法参见洪源范等[10]，略修改后进行氯氰菊酯降解酶的定域.

1.2.6 粗酶液的制备和酶活力的测定

将已经培养好的菌液6 000 r/min离心10 min，去上清，具体用20 mmol/L磷酸缓冲液洗涤2次，在冰浴中超声波破碎，12 000 r/min离心5 min，弃沉淀，上清液冻存备用.取20 mmol/L磷酸缓冲液1 800 μL(含甲醇溶解的50 mg/L氯氰菊酯)，200 μL粗酶液，30 ℃条件下反应20 min，用200 μL的6 mol/L HCl终止反应，加入2倍体积的石油醚，涡旋振荡1 min，于12 000 r/min下离心3 min，取上层有机相进行HPLC检测.通过氯氰菊酯的标准曲线，求得氯氰菊酯的减少量.

2 结果与分析

2.1 降解菌的分离和菌种鉴定

从长期、大量施用拟除虫菊酯农药的杭州茶园土壤中分离获得1株能以氯氰菊酯为惟一碳源生长的细菌，命名为LQK-14.该菌株在LB固体培养基上生长时，菌落呈规则圆形、边缘整齐，菌落白色、略透明、有光泽、较粘稠、略有臭味.取LB培养基上生长至对数期的培养物拍摄电镜照片见图1.图1中菌体呈卵圆形，长约1.2 μm，宽约0.8 μm，单端丛生鞭毛.革兰氏染色阴性，接触酶反应和吲哚试验呈阳性，VP试验、苯丙氨酸脱氨酶试验和甲基红试验均为阴性，不能水解淀粉，能耐受10%氯化钠，生长最适pH为7.0等.

图1 氯氰菊酯降解菌LQK-14电镜负染图(30 000×)

菌株LQK-14 16S rRNA基因序列全长为1 439 bp.将其与已登录的16S rRNA基因序列进行同源性比较，结果发现，与已经报道的恶臭假单胞菌PseudomonasputidaIS82(登陆号FJ596989)和32zhy(登陆号AM411059)等菌株的同源性达到100%.因此，根据上述相似性比较结果，结合菌株的生理生化特性将其鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida).图2为应用软件mega 5.0做出的系统发育树.

图2 氯氰菊酯降解菌LQK-14的系统发育树

2.2 菌株降解效能的测定

2.2.1 降解菌LQK-14的降解曲线

降解菌LQK-14以5%的接种量接种到氯氰菊酯起始浓度为100 mg/L的基础培养基中，于30 ℃摇床上200 r/min培养7 d，每隔12 h取样，检测其降解率，结果见图3.

图3 降解菌LQK-14对氯氰菊酯的降解曲线

由图3可看出：在84 h以内，细胞处于积极生长状态，繁殖迅速，菌液的OD460最高达到0.856，同时氯氰菊酯的降解也稳步增加.84 h后LQK-14的生长速度开始变缓，但其降解能力并未降低，仍然保持线性的增长速度，最终于168 h能将100 mg/L的氯氰菊酯降解67%，而对照组的降解率很低，上述结果表明LQK-14菌株对氯氰菊酯具有降解作用.

2.2.2 培养基初始pH值对LQK-14降解氯氰菊酯的影响

培养基的pH是影响微生物生长繁殖和生理活动的重要因素之一.pH除了对细胞发生直接影响外，还可产生通过改变培养基中营养物质的离子化程度从而抑制微生物对营养物质的吸收等的间接影响.pH的变化对于菌株LQK-14降解性能的影响很显著.在pH5.0～9.0的范围内，氯氰菊酯的降解效率出现先升高后降低的现象，其最大降解率出现在pH7.0，降解率达70.25%，pH上升至8.0时，其降解率仍能维持在62%以上.同时试验证明LQK-14菌株在pH6.0～8.0的范围内生长情况良好，细胞数量多，其生长最适pH为7.0，但在pH≤4的条件下不生长.表明降解菌LQK-14的细胞数量与其降解能力密切相关.

2.2.3 温度对LQK-14降解氯氰菊酯的影响

温度也是影响微生物生长繁殖和生理活动的重要因素之一.适宜的温度下微生物能快速生长繁殖，低温可导致细胞膜凝固，引起物质运送困难；高温则使蛋白质变性，影响酶活性.在温度为25～35 ℃时，降解菌LQK-14均保持较好的降解能力；当温度升至40 ℃时，降解能力显著下降.通过检测不同温度下其菌液的浑浊度，发现40 ℃时降解菌生长情况较差.30 ℃时菌液的OD460值为0.810，而40 ℃时菌液OD460值为0.055，因此推断可能是由于LQK-14菌株不适应在较高温度下生长造成氯氰菊酯降解率下降.降解菌LQK-14在常温下表现出较好的降解能力，为以后在土壤修复过程中施用提供了有利条件.

2.2.4 碳源对LQK-14降解氯氰菊酯的影响

添加外源碳源以考察降解菌LQK-14对氯氰菊酯的降解，结果见图4.从图4中可以看出：除了在添加了麦芽糖后，氯氰菊酯降解率提高外，其余的碳源的添加均降低LQK-14对氯氰菊酯的降解.其中，甘油和淀粉对氯氰菊酯的降解影响较大，降解率下降约50%.检测发现LQK-14利用淀粉的能力很弱(生理生化检测)，推测淀粉的添加对LQK-14菌株的生长产生了一定的影响，其生长情况不好，导致其降解氯氰菊酯的能力下降.甘油一般可以作为微生物生长的迟效碳源，且易于获得大量的菌体(和葡萄糖作为碳源相比)，但是甘油的加入，可能导致LQK-14优先利用较易利用的碳源甘油，造成对氯氰菊酯降解率的下降.

2.2.5 氮源对LQK-14降解氯氰菊酯的影响

土壤中有机质的含量及其肥力情况影响了微生物的种类和分布，故在土壤的生物修复过程中，通过调整土壤的施肥比例可强化其修复过程.氮源对微生物生长和生理活动的影响显著，故添加外源的氮源以考察降解菌LQK-14对氯氰菊酯的降解，结果如图5所示.从图5中可以看出：牛肉膏、蛋白胨和酵母膏的添加减缓了氯氰菊酯的降解，但尿素、氯化铵和硫酸铵的添加促进了氯氰菊酯的降解，尤其是两种无机氮源的添加促使其7 d的降解率均超过了88%.这与李青云等的研究结果不同，其分离获得的PseudomonasaeruginosaGF31在外加氮源的情况下，其降解氯氰菊酯的效能提高，且有机氮比无机氮更有利于农药降解[11].

图4 碳源对降解氯氰菊酯的影响

图5 氮源对降解氯氰菊酯的影响

2.2.6 氯氰菊酯初始质量浓度对LQK-14降解的影响

降解菌LQK-14接种到不同氯氰菊酯起始质量浓度的培养基，30 ℃，200 r/min摇床培养7 d后检测其农药降解率.结果表明：随着氯氰菊酯起始浓度从25 mg/L增加到300 mg/L，其降解率呈现降低的趋势.其中，在300 mg/L氯氰菊酯的条件下，降解菌LQK-14生长情况较差，降解率快速降低.推测氯氰菊酯降解过程中产生的中间代谢产物的毒性抑制了降解菌的生长和降解活性.例如，Rhodococcussp.CDT3降解氯氰菊酯过程中产生的中间代谢产物3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)对降解菌CDT3的降解效能产生一定的抑制作用，且其降解速率与3-PBA的浓度呈负相关[12].

2.3 降解酶的定域试验

应用渗透休克方法获得降解菌LQK-14胞内外和周质空间的粗酶液，测定其酶活力.其中，胞内酶活力最高，可达18.42 μmol/(min·L)，周质空间(1.83 μmol/(min·L))次之，胞外的酶活力最低，可能是菌体细胞死亡后的释放，或者胞内酶泄露到周质空间和胞外.由此推定，降解菌LQK-14降解氯氰菊酯的酶属于胞内酶.文献报道氯氰菊酯降解酶多为胞内酶，如Liang等从AspergillusnigerZD11中纯化得到分子量为56 kDa的胞内酶[13]；Tallur等从Micrococcussp. CPN1提取到诱导型的胞内酶[14].

3 结 论

从施用氯氰菊酯的土壤中分离获得一株能以氯氰菊酯为惟一碳源生长且能分解氯氰菊酯的细菌LQK-14，根据其生理生化特征结合其16S rDNA相似性比较，鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonsaputida).该菌株对300 mg/L的氯氰菊酯仍具有一定的降解作用，其降解氯氰菊酯的最适pH值为7.0，最适温度为25～30 ℃，添加适量无机氮源氯化铵和硫酸铵对其降解氯氰菊酯具有促进作用，在7 d内对100 mg/L氯氰菊酯的降解率最高可达88%.酶的定域试验表明，降解酶为胞内酶.

本文得到了浙江工业大学重中之重学科开放研究基金项目(20080104)的资助.

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