蛋白核小球藻产油率的影响因素

李成成 刘康欣 代百乐 陈雪茹 唐红枫

摘要：采用BG-11为基础培养基，通过添加、替换不同碳源和氮源、改变碳源和氮源比例、去除磷元素或硫元素及额外添加植物生长调节剂建立不同培养体系，进行蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）培养，考察各因素对蛋白核小球藻生长情况及产油率的影响。结果表明，无论是自养体系还是异养体系，蛋白核小球藻生长量和产油率均比普通小球藻（Chlorella vulgaris）更优，异养体系下2種小球藻产油率分别为20.14%和18.66%；葡萄糖为碳源时蛋白核小球藻生长情况最好且产油率最高，产油率为26.40%；氮源为尿素时蛋白核小球藻有最大产油率，为32.70%；碳氮比为30∶1时蛋白核小球藻产油率最高，为34.42%；硫元素缺乏时蛋白核小球藻产油率比对照提高28.54个百分点；1.5 mg/L茉莉酸干扰下，蛋白核小球藻产油率最高，为40.42%。由此得出，蛋白核小球藻生长量和产油率都比普通小球藻更优；葡萄糖为最优碳源；尿素为最优氮源；碳氮比为30∶1时产油率最高；硫元素缺乏时对蛋白核小球藻影响更大；1.5 mg/L茉莉酸干扰下，蛋白核小球藻产油率最高。

关键词：蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）；碳源；氮源；植物生长调节剂；产油率

中图分类号：Q949.93         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）04-0037-04

Influencing factors of oil production rate of Chlorella pyrenoidosa

Abstract： BG-11 was used as the basic medium to establish different culture systems for Chlorella pyrenoidosa culture by adding and replacing different carbon and nitrogen sources， changing the proportion of carbon and nitrogen sources， removing phosphorus or sulfur and adding additional plant growth regulator， and the effects of various factors on the growth and oil production rate of Chlorella pyrenoidosa were investigated. The results showed that the growth and oil production rate of Chlorella pyrenoidosa were better than those of Chlorella vulgaris in both autotrophic and heterotrophic systems. The oil production rates of the two Chlorella species in the heterotrophic system were 20.14% and 18.66%， respectively. When glucose was used as the carbon source， the growth of Chlorella pyrenoidosa was the best and the oil production rate was the highest， and the oil production rate was 26.40%. When the nitrogen source was urea， the maximum oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was got， and was 32.70%. The highest oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was 34.42% when the carbon-nitrogen ratio was 30∶1. The oil production rate of Chlorella pyrenoidosa under sulfur deficiency increased by 28.54 percentage points compared with the control. Under the interference of jasmonic acid with the concentration of 1.5 mg/L， the oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was the highest， which was 40.42%. The results indicated that the growth and oil production rate of Chlorella pyrenoidosa were better than those of Chlorella vulgaris； glucose was the best carbon source； urea was the best nitrogen source； the oil production rate was the highest when the carbon nitrogen ratio was 30∶1； sulfur deficiency had a greater effect on Chlorella pyrenoidosa； the oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was the highest under the interference of jasmonic acid with a concentration of 1.5 mg/L.

Key words： Chlorella pyrenoidosa； carbon source； nitrogen source； plant growth regulator； oil production rate

伴随着全球环境污染和气候变暖，以煤炭、石油为典型代表的化石燃料正逐渐减少，找到对环境无污染的新型生物能源迫在眉睫［1］。生物柴油是一种以动植物油脂为原料制备、可替代化石柴油的新型生物燃料。然而使用动植物油脂成本过高，靠餐饮废弃油脂能够有效降低成本需求，但其来源有限且产品质量难以保证［2］。小球藻是一类体积小、结构简单、生长繁殖迅速的微型自养生物，种类繁多，可以适应于不同的生长环境，并且在人工培养基中生长良好［3］，除能利用光能自养外，还可以异养培养。小球藻细胞中含有丰富的脂类、蛋白质、藻多糖、多种色素及矿质元素等。小球藻产生的油脂与甲醇反应可制得生物柴油［4］。以小球藻为载体，通过对小球藻进行培养，筛选出生长和产油均较好的藻株，针对其进行碳氮源、碳氮比、磷或硫元素缺乏、植物生长调节剂对小球藻油脂积累影响的研究，旨在寻求既能保证小球藻的生长又能提高其油脂产量，同时还能降低小球藻培养成本的方法，为利用小球藻生产生物柴油提供理论基础［5，6］。

1 材料与方法

1.1 藻种

供试藻种为普通小球藻（Chlorella vulgaris）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂有NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、EDTA、Na2CO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、NaMoO4·2H2O、Co（NO3）2·6H2O等，试剂均为分析纯。

主要仪器有D-37520型台式离心机、BCD-247C型电冰箱、SPX-300B-G型恒温光照培养箱、CB800V型超净工作台、LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅、紫外分光光度计等。

1.3 小球藻的培养

1.3.1 小球藻的扩培及更优藻种的筛选 分别配制BG-11（添加葡萄糖）及BG-11基础培养基100 mL，高压蒸气灭菌。取普通小球藻藻种、蛋白核小球藻藻种10 mL，2 000 r/min离心15min，取沉淀接种至各锥形瓶内（每个藻种每种培养液各3组平行样，共12组），编号。23 ℃恒温培养，光照度为2 000 lx，光/暗周期为12 h/12 h，每天3次定時充分摇动［7］。

1.3.2 不同碳源、氮源下小球藻的培养 配制含不同碳源（葡萄糖、乙酸钠、碳酸氢钠，浓度均为15 000 mg/L）及不同氮源（硝酸钠、硝酸铵、尿素，浓度均为1 500 mg/L）的BG-11培养基100 mL，高压蒸气灭菌。取蛋白核小球藻藻种10 mL，2 000 r/min离心15 min，取沉淀接种至各锥形瓶内（不同碳源及氮源各3组平行样，共18组），编号。培养条件同“1.3.1”。

1.3.3 最佳碳氮比的筛选 配制不同碳氮比（30∶1、30∶3、30∶9、60∶1、60∶3、60∶9）［8］BG-11培养基100 mL，高压蒸气灭菌。取蛋白核小球藻藻种10 mL，2 000 r/min离心15 min，取沉淀接种至各锥形瓶内（不同碳氮比各3组平行样，共18组），编号，培养条件同“1.3.1”。

1.3.4 缺磷、硫元素下小球藻的培养 配制BG-11［外加碳源葡萄糖15 000 mg/L（缺磷）、外加碳源葡萄糖15 000 mg/L（缺硫）、外加碳源葡萄糖15 000 mg/L（对照）］培养基100 mL，高压蒸气灭菌。取蛋白核小球藻藻种10 mL，2 000 r/min离心15 min，取沉淀接种至各锥形瓶内（每种培养基各3组平行样，共9组），编号，培养条件同“1.3.1”。

1.3.5 不同植物生长调节剂下小球藻的培养 分别配制含0.5、1.0、1.5 mg/L共3种浓度的水杨酸、脱落酸、茉莉酸的BG-11培养基各100 mL及基础BG-11培养基100 mL（对照）［9］，高压蒸气灭菌。取蛋白核小球藻藻种10 mL，2 000 r/min离心15 min，取沉淀接种至各锥形瓶（不同浓度的各植物生长调节剂各3组平行样，共30组），编号，培养条件同“1.3.1”。

1.4 藻细胞生长量测定

在无菌环境下将培养的小球藻取样3 mL，置于无菌离心管中，标记。在波长为490 nm处测量蛋白核小球藻的吸光度，记录。在培养阶段每隔2 d测其吸光度，各平行样取平均值，制作标准曲线，得到蛋白核小球藻的生长情况［10］。

1.5 藻细胞油脂含量的测定

在无菌环境下将培养的蛋白核小球藻取样10 mL，5 000 r/min离心10 min获取藻泥，经24 h 低温干燥，获取藻粉，称重记为m0，再量取60 mL藻液，2 000 r/min离心15 min，倾去上清液，沉淀加少量去离子水洗出。将样品置于细胞破碎仪下破碎，每次10 min，重复2次。加入氯仿∶甲醇（1∶2）9 mL与样品混合均匀，取上清液加入10 g/L的NaCl，吸取氯仿层于洁净干燥的试管中，60 ℃水浴锅蒸去多余氯仿［11］。试管称重记为m2，洁净干燥试管称重记为m1，藻细胞单位干重油脂含量即产油率（C）计算式如下。

C=（m2- m1）/6m0×100%

2 结果与分析

2.1 小球藻的扩培和更优藻种的筛选

建立不同的小球藻培养体系（自养体系和异养体系），在各培养体系中培养小球藻，试验结果中普通小球藻和蛋白核小球藻在异养条件下所测得生长量和产油率都比自养条件下更优；蛋白核小球藻在2种培养体系中，无论是生长量还是产油率都比普通小球藻更优，如图1、表1所示，因此选取蛋白核小球藻进行后续试验。

2.2 蛋白核小球藻合适碳源、氮源的筛选

在基础培养基BG-11的基础上添加、置换不同种类的碳源15 000 mg/L（葡萄糖、碳酸氢钠、乙酸钠）、氮源1 500 mg/L（硝酸钠、硝酸铵、尿素）培养蛋白核小球藻。添加不同碳源情况下，蛋白核小球藻在以葡萄糖为碳源的条件下所测得的吸光度及产油率均为最优，乙酸钠次之（图2、表2）。谢林静等［12］的研究表明，相对于葡萄糖为碳源的小球藻来说，以乙酸钠为碳源的小球藻的生物量要小一些。添加不同氮源情况下，蛋白核小球藻在以硝酸钠为氮源的条件下所测得吸光度最优，硝酸铵次之，尿素最小（图2）。但是蛋白核小球藻在以尿素为氮源的条件下所测得的产油率最大，为32.70%；硝酸钠次之，为18.42%；硝酸铵最小，为17.50%。金虹等［13］的研究表明，在添加尿素的环境中，小球藻生物量和产油率明显高于其他氮源和无氮环境。

2.3 异养条件下适合小球藻生长和油脂积累的最佳碳氮比筛选

采用最适合蛋白核小球藻生长和油脂积累的碳源（葡萄糖）与氮源（尿素），设置合适碳氮比（30∶1、30∶3、30∶9、60∶1、60∶3、60∶9）培养小球藻，其中碳氮比为60∶1的培养基中蛋白核小球藻的长势最好，其他依次为30∶9、30∶1、60∶3、30∶3和60∶9（图3）。碳氮比为30∶1的培养基中蛋白核小球藻的产油率最高，为34.42%，其次为碳氮比60∶1，产油率为29.78%，其中碳氮比为30∶3的产油率最低，产油率为17.79%（表3）。

2.4 磷、硫缺乏对小球藻生长和油脂积累的影响

建立不同的培养体系，测定缺磷或硫元素情况下蛋白核小球藻生长量和油脂积累量，得出硫、磷元素缺乏对蛋白核小球藻生长和油脂积累的影响。与对照相比，当培养基中磷、硫元素缺乏时，蛋白核小球藻的生长量会有所下降，特别是缺乏硫元素的培养基会使蛋白核小球藻生长量大幅度下降，而缺乏磷元素的培养基下降幅度比缺乏硫元素的培养基小，但一段时间后仍然会大幅度下降（图4）。蔡佳佳等［14］的研究表明，缺硫对藻株生长的抑制作用要大于缺磷。虽然硫的缺乏会使蛋白核小球藻的生物量大幅度减少，但能促进蛋白核小球藻油脂的积累，其含油量最高，为48.10%，磷的缺乏只能小幅度提高藻株的含油量（表4）。

2.5 自养条件下不同植物生长调节剂对小球藻生长和油脂积累的影响

在自养培养条件下，根据植物生长调节剂种类和浓度的设置建立不同的培养体系，测定不同植物生长调节剂条件下蛋白核小球藻生长量和产油率（图5至图8、表5）。结果表明，0.5 mg/L茉莉酸、1.0 mg/L茉莉酸、1.5 mg/L脱落酸、1.5 mg/L水杨酸对蛋白核小球藻的生长有促进作用，其中1.0 mg/L茉莉酸对蛋白核小球藻生长有最大促进作用。在油脂的测定中，1.5 mg/L茉莉酸培养条件对蛋白核小球藻生长后期虽无促进作用，但对蛋白核小球藻油脂积累促进效果最好。0.5 mg/L脱落酸培养条件下，蛋白核小球藻产油率最低，随着脱落酸含量的上升，蛋白核小球藻的产油率增加。肖丹曦［15］的研究表明，脫落酸对藻类生长具有一定的影响。水杨酸浓度为0.5 mg/L时，对应的藻细胞产油率低于对照，随着水杨酸浓度的上升，蛋白核小球藻的产油率增加。以上3种植物生长调节剂中，茉莉酸对蛋白核小球藻的油脂积累促进效果最好。

3 小结

本试验通过测定蛋白核小球藻培养液吸光值间接反映蛋白核小球藻的生长情况，并通过细胞破碎法，氯仿-甲醇提取法测定蛋白核小球藻的产油率，得到结果如下。

1）不同碳源情况下，蛋白核小球藻在以葡萄糖为碳源的条件下所测得的吸光度以及产油率均最优；添加不同氮源情况下，蛋白核小球藻在以硝酸钠为氮源的条件下所测得的吸光度最优，乙酸钠次之，但是蛋白核小球藻在以尿素为氮源的条件下所测得的产油率最大。

2）碳氮比为60∶1的培养基中蛋白核小球藻的长势最好，碳氮比为30∶1的培养基中蛋白核小球藻的产油率最高。

3）培养基中缺硫比缺磷对蛋白核小球藻生长量和油脂产量影响更大。

4）茉莉酸浓度为1.0 mg/L时对蛋白核小球藻生长有最大促进作用；茉莉酸、脱落酸和水杨酸3种植物生长调节剂中，1.5 mg/L茉莉酸对蛋白核小球藻油脂积累有最大促进作用。

参考文献：

［1］ 孙 婷，杜 伟， 刘德华， 等.固定全细胞催化可再生油脂合成生物柴油的稳定性［J］ .生物工程学报，2009，25（9）：1379-1385.

［2］ CHISTI Y. Biodiesel from microalgae［J］. Biotechnology advances，2007，25（3）：294-306.

［3］ 金 城.小球藻生产生物柴油的研究［J］.微生物学通报，2010，37（8）： 1258.

［4］ 毛功平，王 威，石凯凯，等.野生小球藻生物柴油制备工艺的优化研究［J］.可再生能源，2019，37（7）：965-971.

［5］ 周 艳，汪 旭，王蕴博，等.一种户外开放式微藻培养体系优化［J］.广东海洋大学学报，2021，41（2）：33-40.

［6］ 张 勇，陈 燕，李欣阳，等.微生物混合培养生产油脂的研究进展［J］.中国油脂，2022，47（4）：133-137，152.

［7］ 张正洁， 汪 苹.自养小球藻培养条件的优化［J］.北京工商大学学报（自然科学版）， 2011， 29（1）：54-58.

［8］ 范同强，黄有军.不同碳氮比对小球藻增殖及油脂积累的影响［J］.安徽农业科学，2020，48（11）：7-10.

［9］ 蒋丽群.植物激素提高微藻在废水中的活性和生物质积累的过程及机制［D］.济南：山东大学，2019.

［10］ 潘孝妍.微藻油脂积累的环境调控及分子机制研究［D］.海口：海南大学，2020.

［11］ 刘 飞，王 超，王振瑶，等.植物激素诱导对小球藻Chlorella vulgaris细胞生物量和油脂合成积累的影响［J］.中国生物制品学杂志，2017，30（4）：390-394.

［12］ 谢林静，韩宇驰.不同有机碳源对小球藻的生长与产油量的影响［J］.湖南环境生物职业技术学院学报，2013，19（4）：8-11.

［13］ 金 虹， HONG P K A， BAO D，等.不同碳氮源对一株产油小球藻油脂积累的影响［J］.安徽师范大学学报（自然科学版），2014，37（4）：363-365，400.

［14］ 蔡佳佳，费小雯，李亚军，等.元素缺乏和外加碳源对小球藻（Chlorella sp KMMCC FC-21）生长和油脂积累的影响［J］.热带作物学报，2011，32（11）：2029-2036.

［15］ 肖丹曦.植物激素ABA和GA对紫球藻生长的影响［D］.广州：暨南大学，2009.