抗根肿病长柄芥育种材料的创制与鉴定

李崇娟 杨鼎 吕凤仙 和江明 兰梅 杨红丽 徐学忠 胡靖锋 张丽琴

摘要：通過远缘杂交及回交将白菜的抗病基因导入到芥菜中，创制获得优质的抗根肿病长柄芥（Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen）育种材料。采用人工接种鉴定和分子标记鉴定相结合法，对10份抗根肿病白菜材料进行抗性分析，筛选出1份可作为长柄芥抗根肿病育种材料创制的抗性资源CCR21002。利用CCR21002分别作为父本、母本提供抗根肿病基因，与长柄芥进行远缘杂交，结合胚挽救技术获得正反杂交种F1，选取植株形态偏向芥菜的F1与长柄芥回交获得BC1，对BC1植株进行形态学、细胞学分析及抗病性鉴定。结果表明，回交一代比杂种一代更难获得，胚挽救成活的13株BC1中，仅筛选出1株基因型为AABB且抗根肿病的植株，经分子标记鉴定所含抗病基因为CRb，在植株形态上保留有长柄芥的大部分性状。证明经过与抗根肿病白菜远缘杂交及回交，获得对4号生理小种表现抗性的长柄芥新种质1份，可用于继续回交转育。

关键词：长柄芥（Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen）； 抗根肿病； 胚挽救； 正反杂交； 创制与鉴定

中图分类号：S436.3         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）04-0082-08

Creation and identification of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen breeding materials resistant to clubroot

Abstract： The high quality breeding and clubroot disease resistance material of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen was created by introducing the clubroot disease resistance gene of Brassica rapa into Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen through distant and reciprocal hybridization. The resistance of 10 Chinese cabbage materials to clubroot disease was analyzed by the combination of artificial inoculation identification and molecular marker identification， and one material CCR21002 was selected as the resistant resource to be created as the breeding material for clubroot disease resistance of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen. CCR21002 was used as the male parent and female parent to provide anti-clubroot disease genes， and the hybrid F1 was obtained with the embryo rescue technique. F1， whose plant morphology was more favorable to Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen， was backcrossed to obtain BC1， and the BC1 generation plants were analyzed by morphology， cytology and disease resistance identification. The results showed that the backcross generation was more difficult to obtain than the hybrid generation. Among the 13 strains of BC1 that survived by embryo rescue， only 1 strain was screened with genotype AABB and resistance to clubroot disease. The resistance gene was identified by molecular markers as CRb， and most of the traits of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen were retained in plant morphology. It was proved that a new germplasm resistant to physiological race 4 was obtained through remote cross and backcross with anti-clubroot disease Chinese cabbage， which could be used for backcrossing breeding.

Key words： Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen； resistance to clubroot； embryo rescue； reciprocal crosses； creation and identification

长柄芥（Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen）是十字花科芸薹属叶用芥菜中的一个变种类群，主要起源于四川省，因其叶柄细长而得名，可鲜食或加工成酸腌菜［1］，因叶肉肥厚、质地脆嫩、纤维较少而深受人们的喜爱，在云南省被广泛种植，形成了一个以长柄芥种植、加工、消费为中心的产业体系［2］。随着长柄芥在云南省的栽培面积逐年扩大， 4号生理小种导致的根肿病危害也日益严重，威胁着长柄芥产业的可持续发展。为解决根肿病对长柄芥生产的限制，培育抗根肿病长柄芥品种是最经济有效的途径，而筛选优质的抗根肿病种资质源，创制抗根肿病的长柄芥育种材料，可为培育抗根肿病长柄芥品种奠定基础。

根肿病是由根肿菌侵染植株根部皮层细胞所引起的一种土传病害［3］，Williams鉴别系统将根肿菌划分为16个生理小种，其中4号生理小种的致病力最强。沈向群等［4］、陈静等［5］对云南省发病地区的菌样进行鉴定，发现致病菌主要以4号生理小种为主。江莹芬等［6］的研究发现，与C基因组相比，芸薹属A基因组内所含的抗源较丰富，而B基因组则尚未见相关报道，因此在十字花科芸薹属蔬菜抗根肿病育种中，选用的抗性基因主要来源于A基因组。白菜已报道的抗性位点多达23个［7］，其中CRb基因对根肿菌生理小种2、4和8均具有良好抗性，并表现为单基因显性遗传特性［8］。罗延青等［9］通过甘蓝型油菜种质与根肿病高抗白菜品种“康根51”杂交，获得对云南省特定根肿病生理小种具有抗性的甘蓝型油菜新种质2份。彭丽莎等［10，11］采用胚挽救技术筛选到抗根肿病的甘蓝×大白菜和甘蓝型油菜新材料，利用种间杂交获得抗根肿病茎瘤芥育种材料。李倩等［12］以含有CRb抗根肿病位点的白菜为供体亲本，通过与甘蓝型油菜杂交、回交及自交，成功选育了中国首个抗根肿病杂交油菜新品种华油杂62R。

白菜与芥菜同为芸薹属蔬菜，具有相同的染色体组AA。利用筛选出对4号生理小种表现抗性、含聚合抗病基因的白菜抗源材料CCR21002与长柄芥进行远缘正反杂交及回交，通过胚挽救结合抗根肿病基因的背景选择技术，将白菜的CRb基因转育到芥菜中，获得抗根肿病芥菜种质资源，从而改良芥菜的抗根肿病性状，为培育抗根肿病长柄芥品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

白菜肿根来自云南省昆明市，由云南省农业科学院园艺作物研究所实验室分离获得根肿菌，使用Williams鉴定系统将其病原菌鉴定为4号生理小种。供接种试验材料为云南省农业科学院园艺作物研究所叶菜类团队从全国各地收集的10份抗根肿病白菜资源，1份感病白菜资源，材料名称及来源见表1；长柄芥JC21001为云南省农业科学院园艺作物研究所选育的高代自交材料。

1.2 方法

1.2.1 休眠孢子悬浮液的制备 将白菜肿根用研磨机研磨成匀浆，过滤后3 100 r/min离心15 min，弃上清液，加入50%的蔗糖溶液，再次离心后弃上清液，使用无菌水将孢子悬浮液浓度调至1×108个孢子/mL。

1.2.2 人工接种鉴定 接种材料于2020年5月1日播种，长至2片真叶时，以孢子浓度为1×108个孢子/mL的4号生理小种根肿菌菌液在根际周围进行接种，每穴1 mL，每处理15穴，3次重复，同时设置空白对照。30 d后拔出幼苗，洗净根部杂质，参考司军等［13］、杨晓云等［14］的方法进行病情调查统计。

1.2.3 分子标记鉴定 以植株幼嫩叶片为材料，使用北京全式金生物技术有限公司试剂盒提取DNA，利用与白菜抗根肿病CRb［3］、CRa［15］、CRk［16］、Crr1［17］、CRd［18］、CRbkato［19］基因紧密连锁的6个分子标记引物组（表2）进行PCR扩增，产物采用1.8%琼脂凝胶电泳检测，在Bio-rad凝胶成像系统上进行观察。

1.2.4 种间杂交及不同培养方式 将白菜与长柄芥进行正反交，配制2个杂交组合。于授粉后13 d选取部分植株胚珠进行胚挽救，另一部分植株胚珠留在母本植株上继续生长。观察自然生长条件下的杂交结实率，并与胚挽救的结实率进行比较。

1.2.5 选择回交及胚挽救 将正反交杂种F1定植于基地大棚内，于抽薹前观察植株的生长形态，选择保留较多芥菜性状的植株与长柄芥进行回交。授粉后13 d选取部分植株胚珠进行胚挽救，另一部分留在母本植株上继续生长，统计回交自然结子率。

1.2.6 杂种植株F1代及BC1代的鉴定

1）形态学鉴定。对杂种植株生长势、株型、株高、叶片、花蕾等特征特性进行观察记录，并利用亚历山大染色液随机抽取花药镜检，分析育性情况。

2）染色体分析。将雌蕊置于0.002 mol/L的8-羟基喹啉中暗处理3～4 h，转入卡诺固定液中固定12 h，于1 mol/L的HCl中60 ℃水浴7 min，在载玻片上捣碎，卡宝品红染色30 s，于显微镜下观察。

3）倍性鉴定。取幼嫩叶片100 mg冲洗干净，加入600 μL裂解液解离，切碎后用0.22 μm的滤膜过滤，加入1 μL的裂解液、5 μL的PI（碘化丙啶，Propidium iodide）染料、2.5 μL的RnaseA混匀，冰上避光孵化30 min后移至上样管上机检测。

1.2.7 数据统计与分析 采用Microsoft Excel 2010软件对相关数据进行初步统计分析，用 SPSS 23.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同白菜材料抗根肿病鉴定结果

2.1.1 人工接种鉴定结果 抗病性鉴定结果如图1所示，未接种菌液的空白对照均未发病，感病对照CCR21010表现为高感病（HS），病情指数为75.64。由表3可知，表现为免疫（I）的材料2份，为CCR21001、CCR21002，病情指数和发病率均为0，显著低于其他8份材料。表现为高抗（HR）的材料  2份，为CCR21000、CCR21009，病情指数分别为5.01、4.46。表现为抗病（R）的材料3份，为CCR21004、CCR21005、CCR21006，病情指数为19.71～30.14。CCR21003、CCR21007表現为感病（S），在病情指数和发病率方面无显著差异。

2.1.2 分子标记鉴定结果 利用与白菜抗根肿病常见基因紧密连锁的6个分子标记对上述材料进行鉴定，结果表明5个分子标记具有多态性，分别是TCR02a、SC2930、HC688、BRMS-088、KBrH129J18，对应的基因分别为CRb、CRa、CRK、Crr1、CRbkato。由表4可以看出，10份抗根肿病白菜材料均检测到1个或多个与CR基因连锁的分子标记抗性条带。其中CCR21001、CCR21002涉及到CRb、CRbkato、CRk    3个基因；CCR21000涉及到CRb、CRbkato 2个基因；CCR21003、CCR21006分别涉及到CRk、Crr1基因；CCR21004涉及到Crr1和CRb 2个基因；CCR21005涉及到Cra和CRk 2个基因；CCR21009涉及到CRb和CRk 2个基因；CCR21007涉及到Crr1和Cra 2个基因，CCR21008涉及到Crr1和CRbkato  2个基因；感病对照CCR21010未涉及到以上抗病基因。

结合人工接种鉴定结果，分析发现含有抗病基因相对较多的白菜材料对接种的根肿菌表现的抗性水平相对较高，如CCR21001和CCR21002含有3个抗病基因，抗性表现为免疫，含2个或1个抗病基因的白菜材料抗性表现为抗病或感病。含有相同的抗病基因，不同白菜材料间抗性水平也存在差异，如CCR21003与CCR21001、CCR21002含有相同的抗病基因CRk，但CCR21003表现为感病。此外，含有CRb基因的5份材料在不同程度上表现为抗病，说明CRb基因对4号生理小种表现为抗病，故筛选出  2份可以作为长柄芥抗根肿病材料创制的抗性资源，分别是CCR21001、CCR21002。由于CCR21001是雄性不育材料，无法在后续正反交试验中提供花粉，因此选择CCR21002作为抗性资源进行转育。

2.2 不同杂交组合及培养方式的杂种获得率

对正反交以及不同培养方式的结实率进行比较，由图2可知，正反杂交结实率有一定的差异，以长柄芥为母本的正交组合，在田间常规培养即可获得F1代种子，而以白菜为母本的反交组合，田間常规培养时种荚会出现焦黄干瘪或假膨大的现象，导致胚败育不结子，需要通过胚挽救技术才能获得杂交种F1代幼苗。统计结果（表5）显示，长柄芥×白菜的正交组合田间常规培养共获得501粒F1代种子，颜色偏向母本长柄芥，体积小于两亲本，成苗率仅达19.76%；通过胚挽救共获得F1代幼苗313株，成苗率为37.49%，胚挽救的成苗率是田间授粉常规培养的1.90倍，利用胚挽救技术获得种间杂种的比例明显高于人工授粉。白菜×长柄芥的反交组合，田间常规培养未获得种子，通过胚挽救成苗率为14.13%，是田间常规培养的14.13倍。比较不同杂交组合胚挽救的成苗率，发现以长柄芥为母本的成苗率是以白菜为母本成苗率的2.65倍，表明长柄芥与白菜正反杂交亲和性有差异，以染色体数目多的长柄芥作母本时更容易获得杂交种。

2.3 种间杂交种F1鉴定结果

2.3.1 形态学鉴定 将正反杂交获得的F1材料移栽到大田后植株生长状况良好，形态观察结果如图3所示。正交F1（图3C）生长势旺盛，开展度较大，叶下表面无刺毛，在叶片、花蕾、植株高度等方面具有明显的超亲优势，在株型、叶数、叶柄长度以及蜡粉量方面偏向母本长柄芥（图3B），叶形、叶柄宽度及颜色偏向父本白菜（图3A），花瓣的颜色及大小介于双亲之间，有微量花粉，可染率为3.2%（图3G），育性较低。反交F1（图3D）保留了母本白菜的大部分性状，植株较矮小，叶背具有刺毛，叶片卵圆形且呈环抱状态，叶缘波状，叶面绿色微皱，叶柄背部有微量蜡粉，侧生分枝量及花的形态与父本长柄芥相似，叶数、叶柄长度及宽度介于亲本之间，花粉可染率为0（图3H），表现为完全不育。正反杂交所获得F1植株形态差异较大，有明显的母本偏向性，育性检测结果表明均存在不同程度的败育。

2.3.2 染色体分析 在亲本和正反杂交F1减数分裂过程中，观察雌蕊染色体数目及形态，压片的镜检结果（图4）表明，正交F1（图4C）和反交F1（图4D）雌蕊染色体数目相等，均为28，是亲本长柄芥（图4B）（AABB，2n=36）产生的配子AB与亲本白菜（图4A）（AA，2n=20）产生的配子A染色体数目之和，与预期染色体数目相符，为异源三倍体植株。进一步分析发现不同的联会染色体在细胞中随机分布，没有表现出一定程度的分群现象，说明白菜A基因组染色体的导入可能打破了长柄芥A基因组和B基因组之间相对的局域性分布，白菜A基因组可能与芥菜B基因组染色体存在着部分同源性。综合以上结果表明获得的种质为长柄芥与白菜的杂交种（AAB，2n=28）。

2.3.3 倍性鉴定 以亲本作为参照，利用流式细胞仪检测正反杂交种F1的倍性，结果如图5所示，亲本长柄芥（图5B）的荧光强度高峰位于50，白菜（图5A）的荧光强度高峰位于30，正交F1（图5C）的荧光强度高峰位于40，为亲本的平均值，为异源三倍体，反交F1（图5D）的荧光强度高峰位置与正交F1相同，位于40，为异源三倍体。经验证，30株杂交种后代中无自然加倍的双三倍体或其他倍性植株，均为异源三倍体。鉴定结果与染色体观察结果一致，表明正反杂交得到的F1植株是基因型为AAB的三倍体杂交种。

2.3.4 抗病性鉴定 对杂交种进行人工接种根肿菌抗性鉴定，结果如图6所示，对照亲本长柄芥（图6C）主根膨大，侧根出现肿块，存在弱苗以及萎蔫现象，表现为感病。正交组合F1（图6D）和反交组合F1（图6B）的须根发达细长，根系未出现肿大部分，与抗病对照亲本白菜（图6A）相似，均表现为抗病。以上结果表明，远缘杂交已将白菜的抗性基因导入杂交种后代中，正反交F1对4号生理小种均表现为抗病。

对杂交种进行分子标记鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图7所示，正交F1和反交F1扩增出特异性条带的位置均与抗病亲本白菜保持一致，其中引物TCR02a扩增的条带大小在400 bp左右，引物KBrH129J18扩增的条带大小在230 bp左右，引物HC688扩增的条带大小在1 000 bp左右，感病亲本长柄芥均未扩增出明显的特异性条带。以上结果表明，正反交杂交种F1中均含有CRb、CRbkato、CRk基因，通过远缘杂交成功将白菜中的抗病基因转育到杂交种后代中，创制出了抗根肿病的种间杂交种，此结果与人工接种鉴定结果一致。

2.4 回交后代BC1鉴定结果

回交一代比杂交种一代更难获得，授粉后田间自然生长的BC1胚完全败育不结子，未获得BC1种子；授粉13 d后取300个胚珠进行胚挽救，仅获得13株BC1，定植后最终成活9株BC1。7、8、9（图8）在株型与株高上近似轮回亲本长柄芥，7在叶形、叶数以及叶色方面都与轮回亲本长柄芥高度相似。雌蕊染色体观察结果表明，保留部分白菜性状的1、2、3、4、5、6有26条或28条染色体；8、9有38条染色体；7有36条染色体，可以推断该株的基因型为AABB，在植株形态上符合选育长柄芥的目标。抗根肿病分子标记鉴定结果（图9）表明，1、5、7中含有CRb基因，F1中的CRbkato、CRk基因均未遗传到BC1中。综合植株形态与基因型分析，9株BC1中只有7是抗根肿病的芥菜材料。

3 小结与讨论

在创制抗根肿病新种质的研究中，对收集的抗病品种和资源进行抗性评价，是筛选抗病亲本的重要依据。种质材料的抗性评价采取人工接种鉴定和分子标记鉴定相结合的方法，可明确种质材料对不同生理小种的抗性及含抗病基因的類型，有利于提高抗病育种的效率。张淑霞等［20］通过人工接种鉴定和分子标记鉴定相结合的方法，对收集的94份抗根肿病大白菜资源进行抗性分析，筛选到56个含CRb基因的品种，与人工接种鉴定结果一致。杨征等［21］利用2个与抗根肿病基因紧密连锁的分子标记，对78份大白菜材料进行鉴定，发现有23份材料同时含有CRa和CRb基因，为抗病育种提供了材料选择依据。本试验通过对10份抗根肿病白菜材料进行人工接种和分子标记鉴定，获得2份含CRb、CRk、CRbkato基因、对4号生理小种表现抗病的白菜材料，可作为后续抗根肿病长柄芥材料创制的抗性资源。此外，本研究在2种方法结合鉴定的过程中发现，即使含有相同的抗病基因CRb，白菜材料的抗性水平也存在差异，这一结果与黄新彪等［22］的研究结果相似，分析产生差异的原因，可能是这些白菜材料还含有其他CR位点，或是其携带的CR基因不纯合。此外，在检测的10份抗根肿病白菜种质中，CCR21003、CCR21008表现出了特殊性，检测到了CRk、CRbkato基因的连锁标记，但又表现出对4号生理小种的感病，其解释可能需要进一步试验验证和研究。

远缘杂交可以实现异属、种间的遗传物质引入和转移， 达到改良农艺性状以及创制新作物类型的目的，是拓宽种质资源遗传基础的重要手段，但获得远缘杂交种通常需要克服杂交不亲和、杂交种幼胚败育等问题。王丹等［23］、周庆红等［24］的研究表明芥菜型油菜与白菜无论正交、反交都存在一定程度的受精不亲和性，以芥菜型油菜作母本的正交组合能获得种子，反交组合的杂交种胚则全部败育。徐书法等［25］在不同芥菜和白菜配制的多对正反杂交组合中，发现有6对反交组合的亲和指数高于正交组合，说明以白菜作母本、芥菜作父本也能获得杂交种。本试验以长柄芥分别作为父本、母本与白菜进行杂交，长柄芥×白菜的正交组合获得种子，反交组合的杂交种胚败育，这与王丹等［23］的结果一致，与徐书法等［25］的结果有差异，这可能与亲本的基因型有关。胚挽救技术可以克服远缘杂交不亲和的问题，提高远缘杂交种的获得率。Diederichsen等［26］通过胚挽救技术获得了西兰花与白菜杂交的F1，为后续将A基因组CR基因转育到C基因组中奠定了基础。曾爱松等［27］在抗根肿病甘蓝新种质研究中发现，胚挽救技术获得远缘杂交种比例最高为常规人工授粉的35倍。在本试验中，对反交组合白菜×长柄芥授粉13 d后的胚珠进行离体培养，成功获得了F1代幼苗，杂交种获得率是大田常规培养的14.12倍，该结果证明了胚挽救技术能克服远缘杂交不亲和导致的胚败育问题。对能正常结子的正交组合进行胚挽救研究，发现获得幼苗率是大田常规培养的1.89倍，说明利用胚挽救技术获得种间杂交种的比例显著高于人工授粉，这与曾爱松等［27］的研究结果一致。

本试验通过远缘正反杂交及选择回交法将白菜的抗病基因转育到芥菜中，选育出1株抗根肿病的长柄芥育种材料，该材料可为选育长柄芥抗根肿病新品种奠定基础。

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