7种诃子多酚透皮吸收试验研究*

杨旭婷，郝 季，张浩颖，张玉霞，李 琪，王 巍

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

中药诃子为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.或绒毛诃子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果实，其味苦、酸、涩，性平，归肺、大肠经，具有涩肠止泻、敛肺止咳的功效。诃子在蒙药和藏药中应用极为广泛，被称之为“众药之王”。在我国卫生部公布的114种可用于保健食品的原料中诃子的抗氧化活性高居第一[1]。文献研究报道，诃子含有丰富的植物多酚，其总多酚含量可达320.5 mg/g，是其抗氧化活性的物质基础[2]。不同化学成分由于结构、分子量和脂溶性等多种因素的影响，通常具有不同的透皮性能，使用透皮吸收促进剂可以减低皮肤屏障，改善透皮效果[3]。

本研究探讨诃子中7种多酚类成分透皮吸收性能，研究不同质量浓度的透皮吸收促进剂(氮酮、丙二醇)对诃子中7种多酚类成分的体外透皮吸收的促进效果，为研究诃子外用制剂及具有抗氧化性能的护肤品开发奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

SD大鼠，12只，体质量为(250±20)g，购自辽宁长生生物技术有限公司。大鼠饲养于(25±2)℃、相对湿度55%±10%的环境内，期间自由进食、饮水，适应性喂养7天。

1.2 实验药材

诃子药材购自河北安国药材市场，产地为云南，经辽宁中医药大学药学院宋慧鹏副教授鉴定为使君子科植物诃子T.chebulaRetz.的干燥成熟果实。

1.3 主要试剂

诃子次酸、鞣花酸、没食子酸购自成都曼思特生物科技有限公司(批号MUST-22112801、MUST-14031010、MUST-13040103)，安石榴苷对照品购自大连美仑生物技术有限公司(批号J0201AS)，柯里拉京、诃子酸、诃黎勒酸购自成都普瑞法科技开发有限公司，(批号PRF9101742、PRF8071201、PRF8112302)，所有对照品纯度均大于98%；氮酮、丙二醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批号K2203035、I2226367)；乙醇为分析纯，乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水。

1.4 主要仪器及设备

LC-16高效液相色谱仪，岛津仪器(苏州)有限公司；TP-6型智能透皮实验仪，天津市鑫洲科技有限公司；YQD-6B型氮吹仪，上海亭山仪表厂；FA1004B型分析天平，上海精密科学仪器有限公司；410HTD数码超声波清洗机，深圳市洁拓超声波清洗设备有限公司；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 上样液的制备

取诃子药材，砸取果肉，粉碎(过65目筛)，取30.00 g，置具塞三角瓶中，加入60%乙醇420 mL，超声提取(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，过滤，滤液浓缩并定容制250 mL作为上样液，备用。取该上样液，分别按1%、3%、5%加入氮酮、丙二醇，混合均匀，作为含透皮吸收促进剂的上样液。

2.2 离体鼠皮的制备

将SD大鼠以20%乌拉坦麻醉，以8%Na2S溶液涂布腹部皮肤，去毛，12 h后处死，剪取腹部去毛皮肤，剔除皮下脂肪及黏膜，以生理盐水冲洗至皮肤洗液不再白色浑浊，置于生理盐水中浸泡约30 min，取出，用滤纸吸干表面，锡箔纸包好置于冰箱-20 ℃保存，备用。

2.3 体外透皮吸收实验

取制备好的离体大鼠皮肤，自然解冻，检视皮肤是否完整。将其自然固定在改良的Franz扩散池(有效透皮面积0.65 cm2，接收液体积5 mL)的扩散界面上，皮肤角质层朝上固定于供药池与接收池之间，接收池加入30%乙醇生理盐水作为接受液，使接收液与皮肤内表面充分接触。水浴循环(37.0±0.2)℃，待温度恒定后，供药池加入2.0 mL上样液，200 r/min恒速搅拌。分别在1、2、4、6、8、10、12、24 h取1.0 mL接收液，同时补充同温度等体积接受液并排除气泡。接收液吹干后，加入50%甲醇200 μL复溶，离心(12 000 r/min)4 min，取上清，采用HPLC法测定诃子次酸、没食子酸、安石榴苷、柯里拉京、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸含量，按公式(1)计算单位面积的药物累积透过量(Q)。

Q=(V×Cn+∑VS×Cn-1)/A

(1)

式中：Q为单位面积的药物累积透过量；A为有效透皮吸收面积；V为接收室体积；Vs为取样体积；Cn为第n个取样点测得的接收液中药物质量浓度；Cn-1为第n-1个取样点测得的接收液中药物质量浓度。以各时间点Q为纵坐标，时间t为横坐标作图，进行线性回归，得到Q-t方程，求出稳态透皮速率J。

王蒙：一切被推崇、提倡、珍爱的东西，都是祸害之源、争夺之根、虚伪之由，占有与窃取的教唆者，是一切罪恶的源头。

2.4 高效液相法测定透皮接收液中7种诃子多酚的含量

2.4.1 色谱条件

色谱柱：Dikma Platisil色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相水-甲醇-甲酸95∶5∶0.1(A)：乙腈(B)，采用梯度洗脱，洗脱程序为0～8 min，0%B；8～10 min，0%～3%B；10～15 min，3%～5%B；15～28 min，5%B；28～38 min，5%～10%B；38～75 min，10%B；75～77 min，10～17%B；77～115 min，17%B；进样量5 μL；流速1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长270 nm。

2.4.2 对照品溶液的制备

分别精密称取诃子次酸、没食子酸、安石榴苷、柯里拉京、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸、对照品适量，置于10 mL容量瓶，加入50%甲醇定容制得相应对照品溶液。吸取上述各对照品溶液适量，混合，制得每1 mL含诃子次酸181.0 μg、没食子酸157.0 μg、安石榴苷267.5 μg、柯里拉京905.0 μg、诃黎勒酸188.0 μg、鞣花酸31.35 μg、诃子酸28.60 μg的混合对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备

于不同时间点从接收池中精密吸取透皮吸收接收液1 mL，置氮吹仪吹干后，加入50%甲醇200 μL，涡旋使复溶，离心(12 000 r/min)4 min，取上清，即得。

2.4.4 专属性

图1 专属性色谱图Fig.1 Exclusive chromatogram

2.4.5 线性关系考察

精密吸取“2.4.2”项下的混合对照品溶液，稀释成系列梯度浓度的混合对照品溶液，在“2.4.1”色谱条件下进样，以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制各成分的标准曲线，并得到回归方程。结果见表1。

表1 7种多酚的回归方程及线性范围Table 1 Regression equations and linear ranges for 7 polyphenols

2.4.6 精密度试验

精密吸取24 h的透皮吸接收液，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算7种多酚成分色谱峰峰面积的RSD为1.16%～1.60%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4.7 稳定性试验

精密吸取“2.4.6”项下的供试品溶液，分别在制备后的0、2、4、6、8、12、24 h按“2.4.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。计算7种多酚成分色谱峰峰面积的RSD为0.48%～1.84%(n=6)，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.8 重复性试验

取“2.1”项下上样液6份，分别按“2.3”项下方法进行透皮吸收实验，再按“2.4.3”项下方法取24 h透皮吸收接收液制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。计算7种多酚成分色谱峰峰面积的RSD为1.27%～1.86%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.4.9 加样回收率试验

取已知7种多酚含量的透皮吸收接收液(24 h)，再按照1∶1分别精密加入7种多酚的对照品，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1”色谱条件下进样，记录色谱图，计算各成分的加样回收率。结果显示，诃子次酸、没食子酸、安石榴苷、柯里拉京、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸的加样回收率为97.93%～104.5%，RSD为0.32～1.96%(n=6)。

2.6 透皮促进剂对7种诃子多酚透皮吸收速率的影响

按“2.1”项下方法制备含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮、1%丙二醇、3%丙二醇和5%丙二醇的上样液，经“2.3”项下方法进行透皮吸收实验，按“2.4.3”项下方法制备不同时间点的供试品溶液，并按“2.4.1”项下方法检测，计算不同时间段单位面积累积透皮吸收量(Q)，以Q对不同时间(t)作图，进行线性回归，根据Q-t方程，求出稳态透皮速率J及促渗倍数ER。结果表明，1%丙二醇能有效促进诃子次酸及没食子酸的渗透，3%、5%丙二醇均能有效促进鞣花酸的渗透。除3%、5%氮酮组外，两种透皮促进剂各浓度的不同药物累积透过量Q与时间t均呈良好的线性关系R2均大于0.83，除诃子酸外3%、5%氮酮不同药物累积透过量Q与时间t均呈良好的线性关系R2均大于0.79；不同透皮吸收促进剂对诃子次酸的促进透皮效果依次为1%丙二醇>5%丙二醇>3%丙二醇>5%氮酮>未加透皮吸收促进剂>1%氮酮>3%氮酮，对没食子酸的促进透皮结果依次为未加透皮吸收促进剂>1%丙二醇>3%丙二醇>5%丙二醇>1%氮酮>3%氮酮>5%氮酮，对安石榴苷的促进透皮结果依次为未加透皮吸收促进剂>1%丙二醇>5%丙二醇>3%丙二醇>3%氮酮>1%氮酮>5%氮酮，对柯里拉京的促进透皮效果依次为1%丙二醇>3%丙二醇>5%丙二醇>未加透皮吸收促进剂>3%氮酮>1%氮酮>5%氮酮，对诃黎勒酸的促进透皮结果依次为未加透皮吸收促进剂>5%丙二醇>1%丙二醇>3%丙二醇>3%氮酮>1%氮酮>5%氮酮，对鞣花酸的促进透皮结果依次为未加透皮吸收促进剂>5%丙二醇>3%丙二醇>1%丙二醇>1%氮酮>3%氮酮>5%氮酮，对诃子酸的促进透皮效果依次为1%丙二醇>3%丙二醇>5%丙二醇>1%氮酮>3%氮酮>未加透皮吸收促进剂>5%氮酮。见图2，表3。

表3 7种诃子多酚的渗透动力学参数(n=3)Table 3 Permeation kinetic parameters of 7 polyphenols in polyphenols (n=3)

图2 不同质量浓度透皮促进剂对7种诃子多酚的Q-t图Fig.2 Q-t diagram of 7 phenolic acid components of transdermal accelerator with different mass concentrations of transdermal accelerator

使用OriginPro 9.8软件对诃子次酸、没食子酸、安石榴苷、柯里拉京、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸累计透皮量进行零级动力学模型、一级动力学模型与Higuchi模型拟合。结果表明，未加透皮吸收促进剂组诃子次酸、没食子酸和诃子酸的经皮渗透更符合一级动力学方程和Higuchi方程；安石榴苷、柯里拉京、诃黎勒酸、鞣花酸的经皮渗透更符合零级动力学方程、一级动力学方程。1%、3%丙二醇组诃子次酸、没食子酸和鞣花酸的经皮渗透更符合一级动力学方程和Higuchi方程，其他透皮吸收促进剂组更符合零级动力学方程、一级动力学方程；3%丙二醇组安石榴苷、柯里拉京的经皮渗透更符合一级动力学方程和Higuchi方程，其他透皮吸收促进剂组的经皮渗透更符合零级动力学方程、一级动力学方程；1%氮酮和3%氮酮组诃黎勒酸经皮渗透更符合零级动力学方程和一级动力学方程，5%氮酮、3%丙二醇和5%丙二醇组更符合零级动力学方程和Higuchi方程，1%丙二醇组符合一级动力学方程和Higuchi方程；5%氮酮和1%丙二醇组诃子酸的经皮渗透更符合零级动力学方程和Higuchi方程，3%氮酮和3%丙二醇更符合一级动力学方程和Higuchi方程，1%氮酮和5%丙二醇组更符合零级动力学方程、一级动力学方程。结果见表4。

表4 7种诃子多酚的体外透皮量-时间模型拟合方程(n=3)Table 4 In vitro transdermal quantity-time model fitting equation for seven polyphenols in Jiazi (n=3)

最后一个时间点取样后，将鼠皮表面残留药物洗净，将皮肤剪碎，加入甲醇溶液1 mL，超声提取30 min，离心(12 000 r/min)4 min，取上清液，得皮内滞留量样品溶液，经HPLC测定，计算皮肤中各化学成分的滞留量(Qm)。Qm=(Cm×V)/A。Cm为测得残留皮肤内药物质量浓度，V为加入甲醇体积，A为皮肤渗透面积。结果见表5。

表5 7种诃子多酚的皮肤蓄积率(n=3)Table 5 Skin accumulation rate of 7 polyphenols in Jiuzi(n=3)

3 讨 论

3.1 试验皮肤的选择

人体皮肤是透皮吸收实验中的最佳皮肤，但较难获得，有研究利用大鼠皮肤代替人体皮肤进行实验，并通过比较新鲜鼠皮和冷冻鼠皮发现渗透系数没有显著性差异，且个体差异要远小于人体皮肤[5]。因此选择大鼠皮肤进行体外透皮吸收实验。

3.2 透皮吸收接受液的选择

理想的接受液应在满足漏槽条件的基础上尽可能接近人体皮肤，对于亲水性化合物、常用的接受液为生理盐水，而脂溶性化合物，难溶于生理盐水，可加入适量的醇以增加药物溶解度，从而维持漏槽条件[6]。有文献报道醇浓度超过30%就会破坏皮肤结构，造成药物体内、外试验中经皮吸收情况不同，体内外相关性会受到影响。因此选择30%乙醇-生理盐水作为接受液。

3.3 透皮吸收促进剂的选择

由于皮肤的屏障作用，药物经皮吸收时，通常需使用透皮吸收促进剂促进其经皮吸收，氮酮、丙二醇是目前经皮给药制剂中常用的透皮吸收促进剂，价格便宜，易于获得[7-8]。本研究考察了未加透皮吸收促进剂与施加不同浓度氮酮、丙二醇后对7种诃子多酚透皮吸收的影响，发现丙二醇作为促进剂时可有效促进诃子次酸、没食子酸和鞣花酸体外透皮吸收，可能是由于丙二醇作为透皮吸收促进剂时，改变了皮肤结构，提高了药物在角质层的分配渗入，增加了药物的经皮吸收[9]。氮酮作为透皮吸收促进剂时，促渗效果不理想，有研究表明，氮酮作用下药物log Ko/w值与促透倍数对数值呈抛物线关系，对log Ko/w值约为-0.5的药物具有最佳的经皮促透作用，诃子中7种多酚多为亲脂性，log Ko/w值多大于0，导致氮酮对其促渗效果不佳[10]。氮酮组释放缓慢，但皮肤滞留量大，说明其可以长时间停留在皮肤中发挥疗效，可作为缓释透皮制剂开发[11]。

4 结 论

诃子中7种多酚类成分可以穿透表皮层、真皮层而到达皮下组织，具有较强的透皮吸收作用，为研究诃子外用制剂及奠定基础。