基于聚A单链DNA模板合成金纳米簇快速检测化妆品中的氯霉素*

曾希珂，易 姿，杨丽霞，黄小贝，2，赵 佳

(1 长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410036；2 国家酒类产品质量检验检测中心，湖南 长沙 410036)

氯霉素(CAP)是一种广谱抗生素，具有杀菌消炎的作用，使用后能明显改善皮肤状态[1]。然而，长期使用添加氯霉素的化妆品会产生严重的副作用，可能引起皮疹、过敏等不良反应，表现为红斑、水肿、糜烂、灼热、脱屑等，还会诱发再生障碍性贫血、骨髓抑制[2-5]等疾病，对人体健康构成严重危害。因此，我国《化妆品安全技术规范》[6]规定氯霉素为化妆品禁用组分。目前，检测化妆品中氯霉素的常用方法有高效液相色谱法[7-8]、液相色谱-质谱联用法[9-10]、酶联免疫法[11]等，这些方法可以实现对氯霉素高灵敏度检测，但大都依赖大型精密贵重仪器，样品前处理复杂，基质干扰较强，分析时间长，不利于快速筛查。因此，寻找一种简单快速且可靠的方法检测氯霉素具有重要意义。

贵金属纳米簇由于其发光效率高、合成简便、低毒性及生物相容性好等优点，为生物传感领域提供了一种新型高效的分析方法[12]。其中，金纳米簇光学稳定性好、发光性能优良，具有广泛的应用前景。Wang等[13]以聚A(腺嘌呤)为模板的单链DNA可以简单快速的合成金纳米簇，且发光性能良好。欧丽娟等[14]利用聚A单链DNA为模板合成金纳米簇，建立了一种检测汞离子的荧光方法，该方法简单快速，灵敏度高，选择性好。

基于此，本文利用聚A单链DNA为模板合成的金纳米簇作为荧光探针，构建一种新的荧光生物传感方法用于检测化妆品中的氯霉素，以期为化妆品中氯霉素的快捷检测提供参考。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

A30-DNA单链、氯金酸(HAuCl4)、10×PBS缓冲液：生工生物工程(上海)股份有限公司；

青霉素、头孢氨苄、链霉素、卡那霉素、盐酸林可霉素：USP级，生工生物工程(上海)股份有限公司；

五水合硫酸铜、柠檬酸三钠、甘氨酸、精氨酸、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、氯化钙、氯化镁等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

试验用水：超纯水(电阻率>18.2 MΩ·cm)，超纯水系统SMARTPLUS-N；

LS-55型荧光分光光度计，珀金埃尔默股份有限公司；

ME204电子天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 金纳米簇的合成

取10 μmol/L A30-DNA模板40 μL，1 mmol/L氯金酸溶液60 μL，50 mmol/L柠檬酸钠溶液100 μL混合后，加入800 μL超纯水，最终反应总体积为1 mL。将混合液置于90 ℃水浴锅里反应30 min后迅速放入4 ℃冰箱里避光保存，得到荧光金纳米簇溶液。

1.3 检测条件的优化

由于反应温度、加入氯霉素的反应时间、缓冲液pH值是影响氯霉素检测的重要参数，采用单一变量原则，对3个参数进行了优化。

1.3.1 反应温度的优化

取AuNCs溶液80 μL，3 mmol/L氯霉素溶液10 μL，10×PBS缓冲液10 μL混合均匀成100 μL体系，考察反应温度(5，15，25，35，45，55 ℃)对体系荧光强度的影响。

1.3.2 反应时间的优化

取AuNCs溶液80 μL，3 mmol/L氯霉素溶液10 μL，10×PBS缓冲液10 μL混合均匀成100 μL体系，考察加入氯霉素反应时间(0，1，2，3，4，5，6，7，8 min)对体系荧光强度的影响。

1.3.3 缓冲液pH值的优化

取AuNCs溶液80 μL，3 mmol/L氯霉素溶液10 μL，10×PBS缓冲液10 μL混合均匀成100 μL体系，考察缓冲液pH值(5，5.5，6，6.5，7，7.5，8)对体系荧光强度的影响。

1.4 氯霉素的检测

按照1.2的方法合成荧光金纳米颗粒，再按照1.3最优条件对终浓度为0，0.01，0.1，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，80.0，100.0，150.0，200.0，300.0，400.0 μmol/L的氯霉素进行测定。使用荧光分光光度计测量荧光，激发波长290 nm，狭缝宽度10 nm，扫描范围400～560 nm，发射波长475 nm。

1.5 氯霉素检测的特异性

为了验证方法的特异性，按照1.4的试验方法对浓度为50 mmol/L的青霉素、头孢氨苄、链霉素、卡那霉素、盐酸林可霉素、甘氨酸、精氨酸等多种目标物进行测定，使用荧光分光光度计测量荧光。

1.6 样品中氯霉素的测定

化妆品样品前处理方法参照标准GB/T 24800.1-2009[15]略作修改：称取1 g化妆品样品置于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇，超声提取20 min后于涡旋混匀仪上混匀1 min，以6 000 r/min离心5 min，吸取1 mL上清液氮吹至干，加纯水定容至10 mL，过0.22 μm滤膜后用于样品分析。采用标准加入法进行化妆品样品中氯霉素的分析。

2 结果与分析

2.1 实验原理

试验方法的检测原理如图1所示，以聚A单链DNA为模板，氯金酸为金源，柠檬酸钠为还原剂，将金离子还原成零价金后富集在聚A-DNA单链上，形成强荧光的金纳米簇稳定存在于溶液中。加入氯霉素后，氯霉素与金纳米簇结合，通过强吸电子作用阻碍电子转移进程，从而淬灭金纳米簇荧光强度，实现对氯霉素的检测[16]。

图1 基于聚A单链DNA模板金纳米簇检测氯霉素的原理图Fig.1 Schematic of CAP detection based on A30-DNA template AuNCs

2.2 检测方法的可行性

为了检验该方法用于化妆品中氯霉素检测的可行性，即判断氯霉素的加入对金纳米簇荧光强度的影响，分别测定了氯霉素存在与不存在时金纳米簇的荧光值。如图2所示，不存在氯霉素时，检测到强荧光值(a)，而加入氯霉素后，荧光值显著降低(b)。由此表明该方法适用于氯霉素的检测。

图2 不同条件下A30-DNA模板金纳米簇的荧光发射光谱图Fig.2 Fluorescence emission spectra of AuNCs under different conditions

2.3 试验条件优化

2.3.1 反应温度的优化

如图3所示，金纳米簇的荧光强度随温度的升高先下降后升高，当温度为25 ℃时，荧光强度最低。因此，选择25 ℃为最佳反应温度。

图3 温度对金纳米簇荧光强度的影响Fig.3 The effect of temperature on the fluorescence intensity of AuNCs

2.3.2 反应时间的优化

如图4所示，加入氯霉素后金纳米簇的荧光强度迅速下降，当反应时间超过5 min后荧光强度趋于平稳。因此，选择5 min为最佳反应时间。

图4 时间对金纳米簇荧光强度的影响Fig.4 The effect of time on the fluorescence intensity of AuNCs

2.3.3 缓冲液pH值的优化

如图5所示，缓冲液pH值为5.5时，加入氯霉素后，金纳米簇的荧光强度降到最低，因此，选择pH值为5.5作为后续试验的缓冲体系。

图5 pH值对金纳米簇荧光强度的影响Fig.5 The effect of pH on the fluorescence intensity of AuNCs

2.4 检测方法的性能

在优化的试验条件下，对0.01～400 μmol/L范围内的氯霉素浓度进行了检测，结果见图6。由图6(a)所示，随着氯霉素浓度的增加，金纳米簇荧光强度逐渐降低。图6(b)显示了氯霉素浓度与475 nm处的荧光强度之间的关系。在0.01～80 μmol/L的浓度范围内，金纳米簇荧光强度和氯霉素浓度之间呈良好的线性关系，线性回归方程为：y=-3.419 5CCAP+318.88，线性回归系数R2=0.996 6，根据空白响应的3倍标准偏差原则确定检测限为7.0 nmol/L。

图6 不同浓度氯霉素的荧光发射光谱图Fig.6 Fluorescence emission spectra with different concentration of CAP

2.5 检测方法的特异性

为了验证检测方法的特异性，检测了其他可能产生干扰的抗生素、氨基酸、金属离子、糖类等对金纳米簇荧光强度的影响，结果如图7所示。从图7可以明显看出，只有氯霉素能有效的淬灭金纳米簇的荧光，其他干扰物对荧光强度基本无影响，说明该方法对氯霉素的检测具有高选择性。

图7 传感器的特异性Fig.7 Specificity analysis of the sensor for CAP

2.6 实际样品分析

为探讨化妆品实际样品中氯霉素测定方法的可行性，对爽肤水、面膜、玻尿酸三种化妆品样品采用标准加入法评价该方法的实用性，结果见表1，爽肤水样品中，3个加标水平的平均回收率在98.22%～108.40%，相对标准偏差(RSD，n=6)为3.28%～8.82%；面膜样品中，3个加标水平的平均回收率在98.12～105.28%，相对标准偏差(RSD，n=6)为2.32%～8.57%；玻尿酸样品中，3个加标水平的平均回收率在98.55%～107.23%，相对标准偏差(RSD，n=6)为3.21%～7.57%，方法的准确度和精密度较好，可以用于样品中氯霉素的检测。

表1 实际样品中氯霉素的加标回收率Table 1 Recovery of CAP in real samples

3 结 论

本研究以A30单链DNA为模板，制备了具有强荧光的金纳米簇探针。基于氯霉素和金纳米簇之间强的结合作用可以猝灭金纳米簇的荧光，提出了以金纳米簇为荧光探针快速检测化妆品中氯霉素的方法。该方法选择性好，灵敏度高，操作简单快速，检测成本低，时间短，在化妆品实际样品中的检测具有良好的应用前景。