瓜石汤联合当归芍药散对多囊卵巢综合征合并胰岛素抵抗小鼠的影响

郑凤雀 林佳静 刘 欣 杨炜炜 陈赛琼 苏汝旺 何 萍 李晶晶

(1 广西医科大学第四附属医院妇科,柳州,545007; 2 柳州市人民医院检验医学科,柳州,545026; 3 柳州市妇幼保健院妇科,柳州,545001)

多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是常见的一种妇科内分泌疾病,在育龄期女性中发病率为6%～10%[1],常表现为月经周期不规律、排卵障碍、高雄激素血症、胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)等症状[2]。PCOS发病机制尚未明确,研究表明44%～70%的PCOS患者合并IR,以IR为中心的代谢紊乱是PCOS患者重要的病理生理改变[3]。POCS与轻度慢性炎症密切相关,并且这种慢性炎症状态因合并IR而加重[4]。瓜石汤出自刘奉五先生的经典药方,在治疗月经病中有丰富的临床经验,在PCOS中也有较多报道。瓜石汤可调节卵巢激素水平,提高PCOS不孕患者的妊娠率[5]。当归芍药散在妇科炎症治疗中得到广泛应用,其通过下调炎症蛋白表达水平来改善内膜炎症[6]。目前暂无瓜石汤合当归芍药散治疗PCOS-IR的报道。本研究利用来曲唑联合高脂饮食构建PCOS-IR小鼠模型,并探讨瓜石汤合当归芍药散对小鼠性激素及内膜炎症介质的影响,旨在为临床治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级C57BL/6L雌性小鼠50只,体质量20～25 g,8周龄,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(SCXK(湘)2019-0004),饲养于22 ℃恒温条件下,06：00-20：00为光照周期持续约14 h,黑暗10 h,给予充足洁净饲料和饮水。该研究动物实验经过广西医科大学第一附属医院动物伦理委员会审批(伦理审批号：202207001)。

1.1.2 药物 瓜石汤合当归芍药散由瓜蒌15 g(批号：P220873)、石斛12 g(批号：P221108)、玄参10 g(批号：P220884)、麦冬10 g(批号：P220043)、生地黄12 g(批号：P220193)、瞿麦12 g(批号：P220313)、车前子10 g(批号：P220702)、益母草12 g(P221050)、黄连3 g(批号：P220373)、牛膝12 g(批号：P220701)、当归10 g(批号：P224001)、川芎6 g批号：P221583)、赤芍12 g(批号：220801)、茯苓20 g(批号：P220602)、泽泻12 g(批号：P220106)、苍术6 g(批号：P221466)、白术12 g(批号：P221943)组成,均购自广西仙茱中药有限公司;来曲唑片(规格：2.5 mg/片,江苏恒瑞医药股份有限公司,批号：H19991001)。

1.1.3 试剂与仪器 小鼠卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)、黄体生成素(Luteinizing Hormone,LH)、睾酮(Testosterone,T)、胰岛素酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)试剂盒(伊莱瑞特生物科技股份有限公司,批号：E-EL-M0511c、E-EL-M3053c、E-OSEL-M0003、E-EL-M1382c)、小鼠白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α;TNF-α)ELISA试剂盒(武汉三鹰生物技术有限公司,批号：KE10003、KE10007、KE10002);TRIzol(Invitrogen,美国,批号：15596026)、逆转录试剂盒(ThermoFisher,美国,批号K1682)、SYBRGreen Mix(ThermoFisher,美国,批号A25742);酶标仪(ThermoFisher,美国,型号：FC)、实时荧光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR,RT-qPCR)仪(ABI,美国,型号：7500)、倒置显微镜(Nikon,日本,型号：TS-10F)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 按照简单随机化原则,通过随机数字表将小鼠随机抽取编号,按1∶3的比例随机分为对照组(13只)和造模小鼠(37只),对照组给予普通饲料喂养,不予以任何药物干预。

1.2.2 给药方法 模型组小鼠每天给予来曲唑1 mg/kg溶于1 mL1%的羧甲基纤维素钠灌胃,同时给予高脂饲料(基础饲料59.50%,猪油10%,蛋黄粉10%,蔗糖20%,胆酸钠0.50%)喂养。每天给药1次,连续给药21 d。造模第15天开始通过阴道涂片(瑞氏染色)观察小鼠动情周期连续10 d,动情周期紊乱为PCOS模型成功。造模21 d后分别取5只对照组及模型组小鼠,眼眶取血后处死,采用血糖仪测小鼠空腹血糖,2 500 r/min离心时间15 min,离心半径10 cm,收集血清,采用ELISA法,按照试剂盒说明书操作测定血清空腹胰岛素的水平。计算稳态模型胰岛素抵抗指数(Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance,HOMA-IR),HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mIU/L)/22.5。HOMA-IR>2.69提示IR模型成功。随机挑选8只造模组小鼠作为模型组,8只作为中药组。中药组每天给予瓜石汤合当归芍药散10 mL/kg,对照组和模型组小鼠给予等体积的纯净水,连续给药21 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 性激素测定 给药21 d后,在动情间期,异氟烷麻醉小鼠,眼眶取血后处死,2 500 r/min,离心半径10 cm,离心时间15 min,收集血清,-80 ℃保存;采用ELISA法,按照试剂盒说明书操作测定FSH、LH、T的水平。

1.2.3.2 内膜组织TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的测定 采取ELISA法测定组织上清液的炎症介质。取下小鼠子宫,用预冷的磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)冲洗组织以去除残留的血液,剥离子宫内膜组织,称取50 mg的组织,其余组织放入液氮保存,按组织重量(mg)：体积(μL)=1∶9的比例加入9倍体积的PBS,用组织匀浆器匀浆组织,3 000 r/min,离心半径10 cm,离心时间10 min,收集组织上清,采用ELISA法,按照试剂盒说明书检测TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.2.3.3 内膜组织TNF-α、IL-1β、IL6 mRNA的测定 取上述液氮保存的小鼠子宫约20 mg,采用Trizol裂解法提取组织总RNA,用分光光度计评估RNA的质量和总量。按照逆转录试剂盒说明书分别去除DNA及逆转录。采用SYBR Green法进行RT-qPCR。GAPDH作为内参。引物见表1。

表1 小鼠炎症介质和内参的引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析,计量资料采用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析检验。以P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCOS-IR模型成功的判断

2.1.1 动情周期 造模第15天开始通过阴道涂片观察小鼠动情周期,对照组动情周期存在,动情前期以大量有核细胞为主,可见少量角化细胞,动情期以大量角化上皮细胞为主,少量有核细胞,动情后期可见角化上皮细胞、少量白细胞和有核细胞,动情间期以大量白细胞为主;模型组动情周期消失,大部分处于动情间期,提示PCOS模型成功。见图1。

图1 对照组和模型小鼠动情周期(瑞氏染色,×200)

2.1.2 空腹血糖、空腹胰岛素水平 造模21 d后对照组小鼠空腹血糖为(4.52±0.45)mmol/L,空腹胰岛素为(7.12±2.11) mIU/L,模型组空腹血糖为(7.24±1.68)mmol/L,空腹胰岛素为(39.65±6.27) mIU/L,对照组HOMA-IR均<2.69,而模型组均高于2.69,提示IR模型成功。

2.2 各组小鼠干预后性激素水平的变化 干预21 d后,3组小鼠FSH水平差异无统计学意义(P=0.666)。模型组LH、T、LH/FSH水平高于对照组,而中药组LH、T、LH/FSH水平低于模型组(P=0.000)。见图2。

图2 小鼠血清性激素水平

2.3 各组小鼠干预后TNF-α、IL-1β、IL-6的表达 干预21 d后,RT-qPCR结果显示模型组TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平高于对照组,而中药组TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平低于模型组;模型组TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平高于对照组,而中药组TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平低于模型组。见图3。

图3 小鼠内膜组织TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平

3 讨论

PCOS是一种以促性腺激素分泌异常为特征的疾病,包括FSH、LH以及卵巢类固醇激素分泌增加,并且与胰岛素抵抗有关。胰岛素刺激雄激素合成,增加LH作用[7]。IR和高雄激素血症的治疗改善了激素、代谢和生殖功能。PCOS的发病机制尚未明确,明确其发病机制,寻找个体化治疗方案对该疾病诊治有重要意义。本研究成功构建PCOS-IR小鼠模型并给予瓜石汤合当归芍药散治疗,得到了较好的效果。

PCOS与慢性炎症密切相关。PCOS的常见症状如高雄激素血症、胰岛素抵抗、肥胖是引起炎症反应的因素。肥胖是一个慢性炎症,其特征是具有较高的炎症介质、趋化因子和氧化应激标志物水平[8]。雄激素可以刺激前脂肪细胞向脂肪细胞分化,促进肥胖的发展。TNF-α是一种炎症介质,由颗粒-黄体细胞、卵巢巨噬细胞和免疫细胞分泌。研究发现,TNF-α可能与PCOS的IR和雄激素过量有关,其在肥胖和IR模型中过度表达,干扰胰岛素信号转导,诱导IR[9]。有研究已将PCOS患者血清TNF-α水平变化作为治疗效果观察指标[10],因此探索TNF-α与PCOS之间的联系对于PCOS的诊治具有重要意义。IL-6是由各种细胞产生的内分泌细胞因子,如单核细胞和脂肪组织细胞。有研究显示IL-6在PCOS女性中较高,并且与体脂百分比增加有直接关系[11-13]。PCOS女性血浆TNF-α和IL-6水平升高反映了一种慢性炎症,可能是通过降低脂肪细胞中脂联素的表达,参与了IR的发展[14]。IL-1β是炎症反应的重要介质,参与细胞增殖、分化和凋亡。CAI等[15]分析了PCOS女性和健康妇女血清,结果显示,PCOS女性血清IL-1β水平均高于健康对照组。本研究中构建的小鼠PCOS-IR模型的内膜组织TNF-α、IL-6、IL-1β高于对照组小鼠,支持PCOS-IR与炎症相关这一观点。

PCOS的治疗方式包括如改变生活方式、促排卵、高睾酮治疗、胰岛素增敏剂、补充肌醇、叶酸和维生素D、辅助生殖技术治疗和手术治疗[16]。由于药物的不良反应,对PCOS患者更倾向于使用天然抗氧化剂、抗炎药调节代谢、高胰岛素血症和高血脂[17]。WANG等[18]的一项Meta分析表明目前没有足够的证据证明中西医结合治疗PCOS的疗效优于单纯西药治疗。中医、多靶向治疗、抗炎、抗氧化药物以及生活方式的改变可以通过减轻炎症反应使PCOS女性受益[19]。中药通过促甾体激素反应来表达雌激素受体蛋白,从而减少雄激素和增加葡萄糖摄取,改善PCOS患者的症状。瓜石汤作为一个经典药方,有滋补肾阴及清热活血功效。其能够调节月经、稳定体内性激素水平、改善子宫和卵巢的血液循环,从而调节生殖内分泌。除此之外,还具有抗炎、抑菌功效。研究发现瓜石汤可改善非肥胖型PCOS患者LH、T、LH/FSH比值等指标[20]。另一项研究发现瓜石汤可降低血清LH、T、LH/FSH比值及胰岛素水平,并且体质量及体质量指数有下降趋势[21]。当归芍药散有补血活血、清热解毒、消肿排脓、健脾祛湿功效,在改善妇科炎症方面也得到广泛应用。研究证实当归芍药散通过影响大鼠慢性子宫内膜炎模型的炎症蛋白表达及炎症通路来改善大鼠子宫内膜炎症[6,22]。本研究利用瓜石汤联合当归芍药散治疗PCOS-IR小鼠,认为瓜石汤联合当归芍药散可降低血清LH、T,通过降低子宫内膜TNF-α、IL-1β、IL-6的表达来改善子宫内膜炎症。

综上所述,本研究认为PCOS-IR与TNF-α、IL-1β、IL-6的升高有关,是一种慢性炎症性疾病。瓜石汤联合当归芍药散可调节性激素,改善高雄激素血症,同时可降低子宫内膜TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,改善内膜炎症状态。但本研究存在一定的局限性,未进行药物治疗后小鼠生育能力的评估。

利益冲突声明：本文所有作者声明没有利益冲突。