基于经筋理论探讨针刀髌周松解法对膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的影响*

连晓文 曾维铨 陈廷辉 庄雅馨 郭泽兴 刘 晶 黄丙勇

膝骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一种渐进性的退行性疾病,随着疾病进展常常累及软骨、软骨下骨及周围滑膜的病变[1],临床主要表现包括膝关节肿胀、疼痛、活动不利,甚者出现活动功能障碍。最新流行病学研究结果显示,预计到2050年,全球的KOA人数将比2020年增加74.9%[2]。因此,积极探寻能够改善膝关节功能、延缓疾病进展且作用机制明确的干预手段具有重要意义。中医提出“膝者,筋之府”“筋骨同源”的经筋理论,“从筋施治”,松解膝关节“筋”与“骨”结合部的“筋结”可作为治疗KOA的切入点[3]。针刀治疗可以通过松解膝关节周围的高张力点,进而缓解疼痛、改善关节功能[4],近年来被多个临床指南推荐[5,6]。笔者团队前期研究应用针刀髌周松解法治疗早期膝骨性关节炎取得了较好疗效[7]。本研究通过观察针刀髌周松解法对KOA兔膝关节行为学、软骨形态学及软骨细胞凋亡率的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物6个月龄健康雄性新西兰兔18只,体质量2.0～2.25 kg,由杭州富阳红凤养兔场提供[生产许可证号:SCXK(浙)2020-0004)],委托福建中医药大学动物实验中心[动物实验设施许可证号:SYXK(闽)2020-0003]订购、喂养。实验室自然光照,保持温度22～25 ℃、湿度35%～65%。单笼喂养、自由进水、摄食。此实验已通过福建中医药大学动物实验伦理委员会批准(批件文号:FJTCMIACUC2022202)并全程遵照《关于善待实验动物的指导性意见》进行。

1.2 实验试剂HE染色试剂盒、番红O固绿染色试剂盒、TUNEL细胞凋亡试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)、10%EDTA(天津聚恒达化工有限公司)、4%多聚甲醛(北京兰捷科技有限公司)、0.9% NaCl 注射液(四川科伦药业股份有限公司)、3%戊巴比妥钠。

1.3 实验仪器一次性0.4 mm×40 mm 无菌针刀(马鞍山邦德医疗器械有限公司);高分子石膏(河北邦恩斯医疗器械有限公司);手术刀片及相关器械(苏州市开元医疗器械有限公司);一次性包埋模具(海门市宁创实验器材有限公司);脱水机、包埋机(孝感市亚光医用电子技术有限公司);石蜡切片机(LEICA);正置光学显微镜(MSHOT)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组与造模适应性喂养1周后,采用随机数字表法将实验兔分为空白组、模型组和针刀组,每组6只。模型组和针刀组均使用改良的Videman法造模[8],使实验兔的左后肢保持伸膝 0°位,并在其髌骨前方放置石膏托,然后用高分子石膏单层缠绕左后肢,将踝关节固定至背屈 60°位,最后在最外层缠绕防咬绷带。实验兔连续固定6周,拆除石膏后,应用Lequesne MG法进行评价,以总分≥4分作为造模成功的标准[9]。空白组常规饲养6周,无干预。造模实验期间各组兔饮水、进食量基本一致,体质量无明显差异,精神良好,无死亡。

1.4.2 干预方法造模成功后对针刀组实验兔进行针刀干预,参考《中国经筋学》[10]选取股内侧肌、股外侧肌、髌内侧支持带、髌外侧支持带、髌韧带在髌骨上的附着点以及鹅足腱胫骨内髁附着点。常规消毒后,使用一次性无菌针刀于治疗点进行针刀松解治疗,结束后无菌棉球按压。每隔7 d干预1次,共4次。其余2组常规饲养4周,无干预。

1.4.3 取材干预结束后1周,使用3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉,耳缘静脉空气栓塞处死。将兔放于冰上,迅速解剖左膝关节,观察并记录软骨、滑膜表面的大体变化。随后切取股骨髁软骨组织投入4%多聚甲醛中固定。

1.5 观察指标及检测方法①行为学观察:干预结束后1周对3组实验兔进行Lequesne MG行为学评分[11],包括局部疼痛反应、步态改变、患肢关节活动度和肿胀情况4个维度评价。总分为0～11分,得分越高,表明关节功能障碍程度越重。②苏木精-伊红(HE)染色:股骨髁软骨组织经4%多聚甲醛固定48 h后行脱钙处理。再进行脱水、石蜡包埋并制备切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水。苏木精染色,流水冲洗;1%盐酸乙醇分色,流水冲洗;PBS返蓝,流水冲洗;伊红染色,封片,镜下观察。③番红O固绿染色:切片经脱蜡至水后,用铁苏木素染色液3～5 min;再以1%盐酸酒精分化;而后加入固绿染色液5 min,经1%乙酸酸化后,再加入番红染色液5 min。最后脱水透明,封片,镜下观察。④ TUNEL染色观察:取各组实验兔石蜡组织标本切片,脱蜡、脱水后,应用蛋白酶K、TdT酶、Streptavidin-HRP反应,DAB显色;苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封片。镜下观察,棕黄色细胞为阳性。在软骨层随机选取5个视野,采用FIJI细胞计数并计算凋亡率,计算公式:凋亡率=阳性细胞数/软骨细胞总数×100%。

2 结果

2.1 Lequesne评分与空白组相比,模型组左膝关节Lequesne评分显著升高(P<0.05);与模型组相比,针刀组左膝关节Lequesne评分显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 3组实验兔左膝关节Lequesne评分比较 (分,

2.2 关节软骨 滑膜与空白组相比,模型组关节面较粗糙,部分不完整,软骨面无光泽,髌前滑膜增厚,色泽发黄;与模型组相比,针刀组关节面较为光滑、软骨面光泽感增加,病变情况得以改善。

2.3 HE染色空白组软骨面平滑,厚度正常,软骨细胞结构正常、排列有序;模型组软骨面不平整,存在部分缺损,软骨厚度变薄,软骨细胞数量减少,排列松散,可见空泡细胞;针刀组软骨面比模型组平滑、厚度增加,细胞数量增加,排列较为有序。见图1。

注:①软骨面平滑;②正常软骨细胞;③潮线;④软骨面存在缺损;⑤空泡细胞;⑥软骨面恢复平滑。图1 软骨组织HE染色图

2.4 番红O固绿染色空白组软骨面平整,软骨和软骨下骨厚度正常,软骨细胞排列规整;模型组软骨面存在缺损,软骨层厚度变薄,软骨下骨增厚,软骨细胞数量减少,排列紊乱;针刀组软骨面比模型组平整、软骨厚度增加、软骨细胞数量增多、排列较为整齐。见图2。

注:①软骨面平整;②潮线;③软骨面缺损;④软骨面恢复平整。图2 软骨组织番红O固绿染色图

2.5 TUNEL染色与空白组相比,模型组可见较多的软骨细胞凋亡(P<0.05);与模型组相比,针刀组的软骨细胞凋亡数量明显减少(P<0.05)。见图3,表2。

注:箭头所示为凋亡的软骨细胞。图3 软骨组织TUNEL染色图

表2 3组实验兔软骨细胞凋亡率比较 (只,

3 讨论

2021—2030年是全球进入健康老龄化的10年,骨关节炎往往与其他慢性疾病共存于老年患者身上,影响其生活质量和整体功能。与其他类型的关节炎相比,KOA的患病率更高,世界卫生组织指出这10年需要重点关注解决骨关节炎等严重影响患者生活质量和活动功能的疾病[12]。因此,寻找高效易行的治疗KOA方法十分重要。

针刀疗法是通过针刀纵疏、横拨KOA病变的软组织,减轻局部异常高张力,进而调整膝关节的应力分布,改善局部组织代谢,从而达到缓解疼痛、改善关节活动的效果[4]。近年来,随着针刀疗法在临床上的不断应用和验证,已被多个临床指南推荐用于KOA治疗[5,6]。

KOA属于中医“痹证”范畴,“筋伤”和“骨病”是其重要病机,两者相互影响,互为因果,在疾病的发生发展中发挥着重要作用。“筋”强方可束“骨”,“骨”坚而“筋”有所附,两者相互依存。KOA是随着年龄增加而逐渐进展的疾病,KOA早期、中期往往以“筋伤”表现为主,“筋”损伤之后多表现为局部疼痛、软组织长度短缩、双侧软组织牵拉力不同。在站立和行走的过程中,骨与骨之间的压力不均,关节面出现应力集中,促使“骨病”发生发展。“筋伤”和“骨病”两者在疾病进展方面互相促进,后期逐渐发展到“筋骨同病”的状态,出现膝关节周围大量骨赘形成、软组织短缩、关节畸形的严重表现[13]。经筋理论指导下的针刀疗法,是医者根据膝关节周围的经筋循行路径,通过拇指寻按查找筋结点,对其进行松解,近年来在KOA的临床治疗中广泛应用。研究表明,在各种经筋针刺疗法中,针刀疗法在治疗KOA中具有较佳优势[14]。

本研究运用了改良Videman法建立了KOA兔模型,造模过程模拟了KOA的自然发病过程,避免了创伤造模方式带来的炎性物质释放,可以较好地模拟临床上针刀疗法对KOA的治疗效应。股四头肌作为下肢最强壮的肌肉,“一体四头”形成伸膝装置,其结构功能与KOA的发病具有密不可分的联系[15]。髌周软组织作为股四头肌肌腱的延伸部分,其软组织的张力变化会同步影响髌股关节和胫股关节的应力分布,影响KOA的发生发展。因此,本研究基于经筋理论、依据《中国经筋学》[10]中的治疗位点和KOA筋结点的触诊规律,结合笔者团队前期临床研究结果,围绕髌骨周围软组织选取了股内、外侧肌,髌内、外侧支持带,髌韧带在髌骨上的附着点以及鹅足腱胫骨内髁附着点,作为本次针刀治疗松解点开展治疗,研究针刀疗法的作用机制[16]。软骨细胞是关节软骨中的惟一细胞类型,在生理条件下,它保持着增殖与凋亡的动态平衡,从而维持着关节软骨的正常生理状态。当KOA发生时,异常机械应力刺激打破了动态平衡,促使软骨细胞过度凋亡,进而出现软骨退化。近年来有学者发现,KOA软骨细胞凋亡率明显高于正常软骨细胞,软骨细胞凋亡数量与软骨退化程度、KOA严重程度呈正相关[17]。本实验结果表明,与空白组相比,模型组左膝关节Lequesne评分显著升高,软骨面无光泽,关节面较粗糙,软骨表层不平整,厚度变薄,软骨细胞数量减少,软骨细胞凋亡率明显提高。针刀组与模型组相比,Lequesne评分显著降低,软骨厚度增加,软骨细胞数量增多,细胞凋亡率明显降低,这表明基于经筋理论针刀髌周筋结松解法能够有效降低KOA软骨细胞凋亡,为临床针刀疗法治疗KOA提供实验研究依据。