基于网络药理学探究柔肝愈偏饮治疗偏头痛机制*

逄人奇 胡穗发 刘夏敏 曾 泉 金艳梅

偏头痛是一种单侧或双侧、反复发作、中重度搏动性头痛,常伴有畏声畏光、恶心呕吐等症状,发作时持续4～72 h[1]。作为全球第二常见的神经系统失能性疾病,偏头痛年患病率为14.4%,男女患病比例约为1∶2.2[2]。目前西医临床治疗偏头痛以口服药物治疗为主,急性期常以非甾体类抗炎药、曲坦类等药物缓解症状,预防性治疗时常用钙通道拮抗剂、抗癫痫药等[3],但易致药物过度使用性头痛。目前中医治疗偏头痛疗效佳、不良作用小,成为新的探索方向。

偏头痛中医属“头风”范畴,病因病机多样。高巅之上,惟风可及,头痛发作与“风”联系密切,而“诸风掉眩,皆属于肝”,从而形成了独特的中医治疗理论,即从肝论治。胡穗发副主任医师认为肝脉络失和,气血逆乱是偏头痛发作的基本病机。肝失疏泄,气血逆乱,发为头痛,意为肝失柔和而逆乱。头痛发作时患者情绪失疏,肝火肝阳过亢,煎熬阴血,以致肝血不足,治当以柔肝和血,方拟柔肝愈偏饮[4]。柔肝愈偏饮组方川芎24 g,白芍20 g,黄芪15 g,酸枣仁15 g,当归12 g,柴胡4 g,白芷10 g,郁金12 g,香附4 g,甘草3 g。胡穗发等[5]通过临床观察发现柔肝愈偏饮对偏头痛患者疗效尚佳。笔者基于网络药理学方法,解析柔肝愈偏饮治疗偏头痛的作用机制,为后期柔肝愈偏饮相关研究提供指导。

1 材料及方法

1.1 柔肝愈偏饮主要成分及靶点利用TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索柔肝愈偏饮川芎、白芍、当归、黄芪、酸枣仁、柴胡、郁金、白芷、香附、甘草10味药物的活性成分,筛选出口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18的成分,根据成分找到对应靶点。

1.2 偏头痛疾病相关靶点获取在GeneCards(https://www.genecards.org)与OMIM(https://www.omim.org/)数据库以“migraine”为关键词检索收集偏头痛疾病相关靶点,使用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)完成靶点-基因名的转换。

1.3 交集靶点获取将检索出的药物与疾病相关靶点通过微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制韦恩图,得到柔肝愈偏饮治疗偏头痛交集靶点。

1.4 活性成分-靶点网络构建将柔肝愈偏饮-偏头痛交集靶点导入String数据库(https://cn.string-db.org/)中,完成PPI网络构建,使用cytoscape 3.9.1软件进行网络可视化分析,根据介数中心数(Betweenness)和节点连接度(degree)筛选核心成分及靶点。

1.5 GO富集分析及KEGG 通路富集分析将柔肝愈偏饮-偏头痛交集靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析及基因本体论(GO)分析。根据结果,选取P值排名前10数据,使用微生信平台制作成气泡图展示结果。

2 结果

2.1 柔肝愈偏饮药物成分及靶点预测结果检索得到疾病靶点3736个,药物活性成分甘草92个、川芎7个、白芍13个、当归2个、黄芪20个、酸枣仁9个、柴胡17个、郁金15个、白芷22个、香附18个,去除重复项后得到成分185个,根据成分预测并去重后得到潜在靶点264个。根据疾病及药物靶点绘制韦恩图,得到共同靶点155个。见图1。

图1 柔肝愈偏饮与偏头痛交集靶点韦恩图

2.2 PPI网络构建根据PPI网络图分析,得到155个节点(node),2774条边(edge),进行网络拓扑参数分析,根据介数中心数和节点连接度评估节点重要性,筛选得到排行前10靶点。见表1,图2。

表1 PPI网络分析前10靶点

图2 柔肝愈偏饮治疗偏头痛靶点PPI网络图

2.3 活性成分-靶点网络构建中药活性成分-靶点网络图构建,其中药物成分为正六边形,靶点为菱形,形状大小按照节点连接度排列,药物使用拼音首字母缩写,A代表药物重复成分。网络共298个节点,2088条边。根据节点连接度排名选出前10成分分别为quercetin(槲皮素)、kaempferol(山柰酚)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、Stigmasterol(豆甾醇)、isorhamnetin(异鼠李素)、naringenin(柚苷配基)、luteolin(毛地黄黄酮)、Calycosin(毛蕊异黄酮)、formononetin(芒柄花黄素)、7-O-methylisomucronulatol(7-O-甲基异微凸剑叶莎醇)。见表2,图3。

表2 柔肝愈偏饮前10成分信息表

图3 柔肝愈偏饮药物活性成分-靶点网络图

2.4 GO富集分析及KEGG通路富集分析结果DAVID数据库分析得到生物学过程(GO-BP)分析结果799条,主要包括对外源刺激的反应、基因表达的正向调控、对缺氧的反应及细胞增殖的正向调节等。细胞组成(GO-CC)结果98条,主要存在于质膜、突触后膜、细胞外空间等。分子功能(GO-MF)结果150条,主要参与了酶结合、蛋白结合、神经递质受体活性等分子功能。KEGG通路富集分析结果175条,发现柔肝愈偏饮主要通过调控IL-17、TNF信号通路治疗偏头痛。得到结果按Pvalue值选取排名前10进程使用微生信平台制作成气泡图。见图4。

图4 GO富集分析及KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

偏头痛作为常见的神经系统疾病,目前认为其发病机制是由于皮质扩散抑制促进了偏头痛先兆的发生,三叉神经血管系统被激活,进一步释放白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子,引起偏头痛发生[3]。在治疗方向,西药不良反应明显,中药因其疗效确切、不良反应、无依赖性等优势,给患者提供了新选择。笔者通过研究柔肝愈偏饮作用于偏头痛的具体机制,为偏头痛患者提供新的治疗方案。

通过网络药理学方法分析可知,柔肝愈偏饮主要成分为槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等,作用于AKT1、IL-6、TNF等核心靶点,参与酶结合、蛋白结合、神经递质受体活性等分子功能,参与对外源刺激的反应、基因表达的正向调控、对缺氧的反应及细胞增殖的正向调节等一系列生物学进程,并通过调控IL-17、TNF信号通路,改善偏头痛症状。

槲皮素是一种广泛存在的类黄酮化合物,具有抗炎、抗肿瘤及抗氧化作用,以保护神经系统。徐瑞雪等[6]发现,槲皮素通过阻断核因子-κB(NF-κB)表达,降低IL-6表达水平。研究证实,槲皮素通过抗氧化及抗炎作用改善偏头痛[7]。山柰酚作为一种黄酮单体,同样有抗炎及抗氧化作用,赵峰等[8]发现,山柰酚通过上调miR-340-5p靶向抑制AKT3/mTOR信号通路,抑制炎症反应,有效减轻神经性疼痛。β-谷甾醇是一种存在于植物细胞膜中的生物活性化合物,具有镇痛、抗炎、抗糖尿病等多种作用[9]。槲皮素为甘草、黄芪、柴胡、香附共有成分,山柰酚是甘草、白芍、黄芪、柴胡、香附共有成分,β-谷甾醇是白芍、当归、郁金、白芷、香附共有成分,说明柔肝愈偏饮中多味药物含有抗炎及镇痛成分,可改善偏头痛症状。

AKT作为PI3K通路的核心介质,AKT1是重要亚型之一,激活后可介导炎症反应,释放IL-6、TNF-α等炎症因子[10]。有研究表明,偏头痛的发生与神经炎症密切相关,头痛发作期间IL-6、TNF-α等因子表达升高[11],表明IL-6、TNF-α可能成为柔肝愈偏饮治疗偏头痛的关键靶点。

KEGG通路富集分析可知,柔肝愈偏饮可能通过IL-17、TNF信号通路调控偏头痛。偏头痛的发生与IL-17表达密切相关,其与IL-17R受体相结合激活相关信号通路,诱导IL-6、TNF-α等因子分泌,参与炎症反应[12]。TNF在炎症和免疫反应中,占据着重要作用,分为TNF-α和TNF-β 2个亚基,其中TNF-α占据大部分活性。TNF-α激活以后,刺激其受体募集下游因子形成TNF-α三聚体,诱导下游NF-κB的激活[13],引起神经炎性改变,参与偏头痛。笔者通过KEGG通路富集分析预测柔肝愈偏饮可能通过调控IL-17、TNF信号通路干预偏头痛,这为后续探究柔肝愈偏饮治疗偏头痛的作用机制提供了研究方向。