再生医学制剂在马骨关节炎治疗中的应用进展

蒋 辉,彭 聪,汤小朋,李 靖,朱怡平

(中国农业大学动物医学院,北京100193)

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是导致马跛行、影响其运动性能的重要疾病之一,大约60%的马匹跛行与骨关节炎有关,其中高达66%的运动马患有骨关节炎[1]。据报道,在美国每年平均治疗一匹骨关节炎患马需要花费3 000～5 000美元,对马产业造成巨大经济损耗。

马骨关节炎发病过程不仅会影响关节软骨,还会累及整个关节,包括软骨下骨、关节韧带、关节囊、滑膜和关节周围组织[2]。其发病机制复杂且尚未阐明,越来越多证据显示先天免疫系统在调节关节内炎性反应进而导致关节软骨损伤的过程中起到关键作用。骨关节炎目前被视为一种多因素疾病,常见因素包括重复性关节软骨微损伤、发育性骨软骨病、自发性退行性病变、关节感染等[3]。

马骨关节炎尚无治愈方法,传统治疗主要通过系统性使用非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)和关节内注射皮质类固醇类药物,传统药物治疗可以缓解疼痛和炎症等症状,但无法逆转骨关节炎发病或修复受损软骨结构。另外有研究显示,针对马骨关节炎长期使用皮质类固醇类药物会抑制M2型巨噬细胞极化及白介素-10(interleukin-10,IL-10)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)等抗炎因子的产生,从而降低机体固有免疫系统活性、破坏关节内稳态,进一步损伤关节软骨[4]。

再生医学(regenerative medicine,RM)是一门新兴的、发展迅速的学科,具有促进细胞、组织或器官再生修复、抑制炎性反应等作用,在运动损伤治疗中具有巨大潜力[5]。目前常用于治疗马骨关节炎的再生医学制剂主要包括间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)、富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)、自体条件血清(autologous serum conditions,ACS)和自体蛋白溶液(autologous protein solution,APS)[6]。

1 再生医学作用机理和分类

再生医学(RM)的起源可追溯到20世纪80年代的软骨再生工程,旨在替换或再生细胞、组织或器官,以恢复或建立因疾病、损伤、老龄化及先天缺陷等因素而丧失的正常功能[5]。再生医学根据不同方法和功能成分主要分为三大类:①组织工程与生物材料;②细胞与细胞因子疗法;③类器官。再生医学的应用通常结合了多种技术手段,在组织损伤修复上不断突破,有望取代传统的移植和替代疗法[7]。

组织工程和生物材料这种方式是在体外培养并构建具有组织形态及生物特点的生物支架,移植进体内后可调节周围组织、细胞等进行修复和再生。细胞与细胞因子疗法通常是对组织中有利于抑制炎症、组织再生的细胞或细胞因子等成分进行富集或培养,再应用到体内的目标部位。干细胞就是这类方法中的典型代表,具有较强的分化和再生功能,还常与生物遗传学、纳米技术等学科重新整合来提高应用效果,在再生医学领域发展十分迅速[8]。再生医学之所以具有较强的促进组织再生能力,主要是通过培养自体或异体细胞、组织或基质架构等建立起复杂的生物信号环境,其中的分子及细胞得以根据周围环境释放不同生物信号,来建立更为稳定健康的生物环境。当在体内应用这些再生制剂后,将通过生物信号调节周围受损组织或细胞的生物活动,甚至动员体内免疫系统的其他成员,共同达到组织修复的目的[9]。

目前软骨组织工程方法已用于局灶性关节软骨缺损的再生,并取得了一定的效果[10]。这种技术对于治疗骨关节炎具有重要意义。在马临床治疗中,再生医学同样应用广泛,主要以细胞及细胞因子疗法为主,常用再生疗法包括MSC、PRP、ACS和APS,在过去10年中已用于治疗包括马骨关节炎在内的临床运动损伤[6]。

2 再生医学制剂在马骨关节炎治疗中的应用

2.1 自体条件血清在治疗马骨关节炎中的应用

自体条件血清(ACS)是一种自体血液制品,它由患马自身血液无菌孵育后,通过离心并提取血清组分获得,是一种无细胞产物,富含球蛋白、白蛋白、白介素1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1RA)等,可抑制炎症级联反应,具有较强抗炎功能[6,11]。

此外,ACS还含有高浓度抗炎细胞因子和生长因子(growth factor,GF),例如IL-4、IL-6、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)等。PDGF、TGF-β1、VEGF等生长因子都存在于血小板颗粒中,参与调节关节软骨代谢和软骨细胞表达,有助于组织损伤修复。

目前,商品化ACS制剂是白介素受体拮抗剂蛋白(interleukin receptor antagonist protein,IRAP),在一项关于马血IRAP蛋白质谱的检测中,发现应用IRAP的样本中检测的细胞因子水平均高于对照组,其中IL-1RA和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平显著升高,表明IRAP具有良好的抗炎效果[12]。在实际应用中,由于ACS中的无细胞成分,也便于储存和运输[6]。

在一项临床研究中,显示应用ACS的马匹在治疗5周后其骨关节炎关节跛行症状显著改善,并且在治疗后10周滑膜增生明显减少[13]。尽管有证据显示ACS可显著缓解马骨关节炎临床症状并改善组织学表现,但由于ACS细胞因子和生长因子含量存在较大的个体差异,使得ACS在一些骨关节炎治疗实验中效果并不明显[6],所以进一步进行ACS临床评估以了解其细胞因子谱效果十分必要。

2.2 富血小板血浆在治疗马骨关节炎中的应用

富血小板血浆(PRP)是通过离心富集血液中血小板成分后得到的生物制剂。它的生产成本相对较低,可以较容易地从全血中分离出来,因其富含对伤口愈合至关重要的PDGF-BB、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、TGF-β1等而被用于促进损伤修复。

PRP具有复杂的生物活性微环境,除血浆中的细胞因子、凝血素、GF外,血小板脱颗粒可释放额外的GF,与一系列关键的组织愈合机制有关[14]。其中PDGF-BB和TGF-β1可促进软骨细胞外基质的产生和滑膜细胞的分化,缓解关节炎症和疼痛,并对关节滑膜和软骨具有促合成代谢、抗炎作用[15]。

在一项应用PRP治疗马匹肌腱损伤的研究中,结果显示由于PRP的纤维基质重塑作用,短期内使用PRP可促进修复组织、改善跛行。长期来看,使用PRP治疗肌腱损伤有利于马恢复到正常的运动水平[16]。在目前PRP治疗马骨关节炎的相关研究中,大多数研究显示PRP有较好治疗效果。研究显示,PRP可以通过刺激软骨细胞增殖、蛋白多糖合成和Ⅱ型胶原的胞外基质合成,促进软骨组织修复。PRP还具有保护软骨作用,其能促进滑膜细胞透明质酸的合成、分泌以及抑制软骨细胞炎症反应[17]。将PRP注射到马匹骨关节炎关节后,马的跛行程度、运动范围和步态均有显著改善[17]。由于目前关于PRP制备技术和PRP治疗方案尚未统一,导致不同试验中得到的PRP治疗效果存在较大差异。因此,标准化PRP制备方案及治疗方案仍值得进一步探究。

2.3 自体蛋白溶液在治疗马骨关节炎中的应用

自体蛋白溶液(APS)是一种浓缩血小板和抗炎细胞因子的制剂。它由富血小板血浆浓缩而成,通过两步离心法浓缩血小板、生长因子和抗炎细胞因子而成。与全血相比,含有更少红细胞的同时,APS含有明显更多白细胞(white blood cell,WBC)、血小板。有试验表明,APS通过白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)靶向介导的炎症通路来治疗骨关节炎,通过关节内注射APS可以有效减轻疼痛并减缓骨关节炎的进展[18]。

骨关节炎发病过程中,炎性因子IL-1和TNF-α是介导炎性反应、组织损伤的主要角色,而APS中含有多种抗炎因子,包括IL-1RA及TNF-α的Ⅰ型、Ⅱ型可溶性受体,即肿瘤坏死因子受体Ⅰ(tumor necrosis factor receptor Ⅰ,TNF-RⅠ)、肿瘤坏死因子受体Ⅱ(tumor necrosis factor receptor Ⅱ,TNF-RⅡ)来缓解炎性反应。在一项研究中,应用APS治疗自然发生骨关节炎的马14天后,马跛行、屈曲疼痛的症状显著改善。与对照组相比,接受APS(IL-1RA/IL-1>1 000)治疗的马匹关节液蛋白质浓度显著降低,临床治疗效果良好[19]。在另一项研究中,APS治疗骨关节炎患马12周和52周后,其基于美国马兽医协会(American Association of Equine Practitioners,AAEP)的跛行评分和舒适度有显著提升,治疗后患马无进一步骨赘和软骨下硬化的影像学病变形成,无关节间隙狭窄情况[17]。总的来说,APS由于其丰富的抗炎成分可促进关节组织的合成代谢、缓解炎性反应,是用于治疗骨关节炎的重要疗法之一[20]。

与ACS相比,APS的生产不需要24 h的孵育期,在治疗效率方面存在优势。与不含血小板等细胞成分的ACS相比,APS中的PDGF等抗炎因子在减少软骨细胞炎性级联反应方面具有较好效果[21]。另外有研究显示,APS中的TGF-β浓度显著高于ACS,而IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子与ACS浓度相似[21]。从目前的研究结果来看,单次关节内注射APS是治疗早期骨关节炎的一种有效疗法。但目前对于ACS的讨论大部分限于体外研究,在其临床治疗效果方面还需要更多研究[18]。

2.4 间充质干细胞在治疗马骨关节炎中的应用

间充质干细胞(MSC)具有一定自我更新能力,能在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨母细胞等多种组织细胞。在马骨关节炎治疗中,MSC可从多种组织获得(例如骨髓、脂肪、外周血、脐带血、关节滑膜等),且增殖迅速并能在体外反复传代后仍保持分化潜能,还具有低免疫排异反应、在宿主体内长期共存等特点[22]。

MSC在抑制马骨关节炎炎症和缓解疼痛方面起到关键作用。一方面,它可通过巨噬细胞和辅助T细胞调节适应性免疫系统和先天免疫系统中的其他细胞。另一方面,MSC可通过许多趋化因子和抗炎细胞因子进行细胞间通讯,或通过生物活性物质(如IL-6、IL-10和TGF-β)来调节炎性反应。TGF-β具有一定促软骨细胞分化能力,在关节软骨细胞合成细胞外基质过程中发挥着重要作用[22]。也有研究表明,MSC通过减少调节性T淋巴细胞(Treg)复制、募集和转化来提升促炎活性,并促进细胞凋亡。且在一些MSC应用于马软组织损伤模型的研究中,证明了MSC具有较低免疫原性,同种异体应用MSC具有良好的安全性和有效性[23]。

MSC在马骨关节炎治疗中有改善局部软骨微环境和新陈代谢的作用。在一项临床前研究中,MSC治疗组的马骨关节炎关节在跛行检查中显示出7周后,其基于AAEP跛行评分显著低于对照组,关节检查结果显示关节积液减少,滑液粘度提高,尸检过程中发现关节软骨形态改善,表现出良好的马骨关节炎治疗效果[24]。但目前认为,MSC用于治疗早期骨关节炎效果更好,可促进纤维软骨再生,当骨关节炎发展到一定程度后更多的是发挥抑制炎性、缓解疼痛等效果[25]。

MSC来源丰富,对于马骨关节炎的治疗最有价值和最可靠的MSC来源仍然存在争议。骨髓和脂肪来源的干细胞是最常见的干细胞来源,但围产期组织例如脐带血、脐带组织、羊膜或羊水来源的MSC也越来越常见。脐带血干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UCMSC)目前被认为是MSC的最佳来源,它的获取不涉及侵入性操作,符合动物福利,且有研究表明UCMSC具有更强的增殖能力和免疫调节能力[26]。一项研究已表明异源马UCMSC(EUC-MSCs)可通过免疫调节的作用机制,缓解骨关节炎患马的跛行症状和疼痛、减缓骨关节炎的进展、促进组织再生,并具有良好的使用安全性。因此,EUC-MSCs可能是未来治疗马骨关节炎一种很好的选择。

由于MSC软骨形成潜能和免疫抑制特性,其有望成为治疗骨关节炎的新兴疗法。然而,用于治疗重度或全身性骨关节炎时MSC的最佳剂量或治疗方案、以及自体或同种异体MSC的安全性和有效性方面还需更多研究验证[27]。目前,内源性滑膜间充质干细胞的扩增以及提高同种异体骨髓间MSC治疗效果是骨关节炎再生医学中的研究重点[23]。

3 展望

再生医学的效果尽管在多个试验、临床前研究、病例报告和对照研究中取得了良好的结果,但仍需更多设计严谨、试验对象数量充足的研究证明其临床应用效果。此外,再生医学领域还面临着几个挑战,如缺乏明确的细胞或生物活性成分来源作为治疗手段,再生医学制剂的作用机制尚不明确等。再生医学方面研究还需进一步规范不同类型再生制剂的制备及应用规范,明确发挥作用成分及机制,以便进一步发挥其抑制炎症、组织修复等作用。例如,标化马ACS孵育时间和条件来研究其对骨关节炎模型中细胞因子和生长因子含量和浓度的影响;规定马PRP制备和治疗骨关节炎方案来研究其治疗机制和效果;进一步探究APS在马骨关节炎不同阶段细胞因子发挥的作用机制;研究MSC免疫调节相关信号通路以提高骨关节炎治疗效果。综上所述,再生医学治疗骨关节炎仍是如今马运动医学中的研究重点,未来还需更多深入研究继续挖掘再生医学的应用潜力。