子宫肌瘤动物模型研究概况

付 涛,谢 娟,韩 伟,黄国宁,武丽红*,杨振山

(1.重庆市妇幼保健院生殖医学中心,重庆 400013;2.重庆医科大学附属妇女儿童医院,重庆 401147;3.华南农业大学兽医学院,广东广州 510642)

子宫肌瘤(Uterine fibroids)是子宫肌层的良性肿瘤,主要发生在育龄期和绝经期后的妇女[1-2]。目前子宫肌瘤的病因尚未完全明确,遗传因素改变、性激素水平异常等都有可能导致子宫肌瘤的发生。在动物医学领域的研究中,实验动物模型作为验证临床假说和实验假说的基础,能够帮助人们高效地认识疾病的病因机理,以及进行药物的研发和评估[3]。动物模型的应用使科研人员更加全面地认识疾病的本质。然而,国内外对子宫肌瘤的动物模型尚无统一的标准。因此,本文综述了子宫肌瘤的相关致病因素以及国内外研究人员所使用的子宫肌瘤自发性动物模型、诱发性动物模型、异种移植动物模型以及基因工程动物模型,并分析各种模型的优缺点和适用性,以期为该领域研究人员开展研究提供参考。

1 子宫肌瘤的病因

1.1 遗传因素

子宫肌瘤的发生可能与遗传因素有关。通过全基因组测序检测子宫肌瘤中的基因序列,结果表明大多数的子宫肌瘤组织中存在中介体复合物亚基12(mediator complex subunit 12,MED12)基因突变[4]。MED12基因的突变使得其蛋白构象发生改变,从而影响通过激酶介导的对子宫肌层干细胞命运的调控,导致子宫肌瘤的发生。此外还有证据揭示高迁移率族蛋白A2(high-mobility group AT-hook 2,HMGA2)在子宫肌瘤中表达显著增高,HMGA2可能通过激活PLAG1(pleomorphic adenoma gene 1)来促进子宫肌瘤的发生[5]。

1.2 性激素因素

子宫肌瘤被认为是雌激素依赖性的肿瘤,因为其主要发生于雌激素分泌旺盛的育龄期女性。当女性绝经后子宫肌瘤停止发展或者缩小[2]。子宫肌瘤组织中的雌激素水平明显高于周围非肌瘤组织。此外,子宫肌瘤细胞中雌激素受体的表达水平也高于正常子宫平滑肌细胞。王玉玲等[6]的临床研究表明,子宫肌瘤局部存在大量雌激素与孕酮激素受体,其发生发展和局部雌激素、孕酮激素以及相应受体的含量密切相关。雌激素受体和信号通路的异常导致子宫肌瘤的发生发展[7]。

1.3 其他因素

饮食习惯变化也可能引起子宫肌瘤的发生。研究表明大量食用蔬菜和水果的女性,患子宫肌瘤的可能性显著降低[8]。大量饮酒与子宫肌瘤患病风险呈正相关[9]。饮食习惯的改变可能会影响妇女体内类固醇激素水平,在一定程度上导致子宫肌瘤的发生。

中医辩证认为,肝郁气滞、冲任气血受损、经产调摄不当、脏腑虚弱、饮食不节是造成子宫肌瘤疾病的主要原因。肾阴阳失调、痰瘀互结,病位兼肝、脾、肾三脏是主要病机[10]。

2 子宫肌瘤动物模型

2.1 自发性动物模型

自发性子宫肌瘤动物模型是一种未经人为干预的特定品系的实验动物,其生长过程中自发产生子宫肌瘤。代表动物有Eker大鼠,日本鹌鹑,大肚猪等。其中,Eker大鼠存在结节性硬化症2基因(tuberous sclerosis complex 2,Tsc2)突变,在3～4月龄后约有65%的概率自发形成子宫肌瘤而被国外学者广泛使用。利用该模型研究人员陆续发现了一些潜在的用于预防和治疗子宫肌瘤的药物。例如,维生素D3(vitamin D3)被证明可以降低患子宫肌瘤的风险[11],色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)能够显著抑制肌瘤的生长速度[12],儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂(Ro41-0960)能够通过促进2-羟基雌激素的积累来引起细胞凋亡,从而阻止子宫肌瘤生长[13]。Eker大鼠目前主要应用于研究内分泌干扰物暴露对子宫肌瘤发病的影响。然而,其作为子宫肌瘤动物模型也存在一些局限性。首先与人类疾病相比,该动物模型的子宫肌瘤组织中含有的胶原结缔组织间质较少,其次Eker大鼠会同时产生良性和恶性的平滑肌肿瘤。这些问题影响了所得结论的有效性。

自发性动物模型具有不需要人工干预以及其病理特征与人类相似的优点,但该类动物模型在使用上也存在一些限制。这些模型价格较高,造模周期较长,并且还可能受到其他因素的干扰,影响实验结果的可靠性。

2.2 诱发性动物模型

单一雌激素造模和雌激素孕酮激素联合造模是两种常用的建立诱发性子宫肌瘤动物模型的方法。一般采用大鼠来建立模型。在单一雌激素造模中,给予动物高剂量的雌激素,如己烯雌酚,可以诱发子宫肌瘤的形成。香卫红等[14]通过给大鼠隔日肌注己烯雌酚40 μg/只,进行9周,成功建立模型。在这之后,陈海刚等[15]给性成熟的雌性大鼠连续8周每周注射两次200 μg雌激素,形成与人相似的子宫肌瘤。该模型大鼠血清雌激素水平显著升高,且肌瘤组织中雌激素受体和孕激素受体表达显著增强,可用于子宫肌瘤的后续研究。

另一种常用的方法是雌激素孕酮激素联合造模。在这种方法中,将动物暴露于雌激素和孕酮的联合作用下,诱发子宫肌瘤的形成。张晓敏等[16]采用腹腔注射的方法每天给SD大鼠注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg,同时每周注射1次孕酮4 mg/kg,连续注射25 d。之后,同时注射苯甲酸雌二醇和孕酮连续5 d。造模结束后,大鼠子宫重量和子宫系数显著增加,子宫平滑肌组织出现局灶性和多发性增生,血清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平显著升高,提示造模成功。王芳芳[17]等延长了前期雌激素的注射时间,先给SD大鼠每天腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg,持续30 d。同时每周注射1次黄体酮4 mg/kg后,连续注射2种激素5 d。通过检测子宫湿重、子宫系数、病理切片染色等指标后判断模型建立成功。相较于单一雌激素造模,雌激素孕酮激素联合造模更稳定,成功率更高,而且更加符合子宫肌瘤发生、发展的过程,是目前国内研究人员主要采取的子宫肌瘤造模方法[18]。

相较于上述短期造模,长期造模方法也在诱发性子宫肌瘤动物模型的建立中被广泛应用。韩云霞等[19]采用连续10周隔日肌注己烯雌酚0.04 mg/只,在此期间给SD大鼠肌注每周注射1次黄体酮,1 mg/只。该方法使大鼠血清中雌二醇以及孕酮水平显著升高,子宫重量增加,子宫系数增大,成功建立模型。类似的,霍安妮等[20]先给SD大鼠肌注0.5 mg/kg的苯甲酸雌二醇,每周3次,进行12周。然后继续肌注5 mg/kg的黄体酮,每周2次,进行4周。随后的形态学与病理学检查表明造模成功。

诱发性子宫肌瘤动物模型能够更好的模拟人子宫肌瘤的生成过程,并具有价格低廉,易于重复的优点,这些模型被广泛被用于研究子宫肌瘤的病理生理机制以及评估潜在的治疗方法。通过该模型,已经发现了一些潜在的治疗子宫肌瘤的药物,如长托宁[16]、紫草素[17]、香虎清妇炎颗粒[19]、丹参注射液[20]等,这些药物能显著抑制子宫肌瘤的增长。然而,对于诱发性子宫肌瘤动物模型的造模方法,如激素选择、给药方法、频率和周期等尚未形成共识。因此仍需要对该方法做进一步的优化与探究。此外,需要进一步研究这些模型与人类子宫肌瘤的相似性,并验证通过动物模型得出的治疗方法在临床上的有效性和安全性。

2.3 异种移植动物模型

子宫肌瘤异种移植模型是将组织或细胞移植到免疫缺陷小鼠体内来建立的模型。Hassan M H等[21]用预先转染腺病毒环氧化酶2(cyclooxygenase-2,Cox2)和腺病毒血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)的人子宫肌瘤组织植入到严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠皮下,移植的组织块在小鼠体内持续生长30 d。研究发现移植的组织与原始患者组织在增殖和凋亡的细胞数量,平滑肌肌动蛋白、结蛋白、波形蛋白、雌激素受体和孕激素受体的表达上相似,表明模型构建成功。Ishikawa H等[22]将人的子宫肌瘤组织移植到切过卵巢的免疫缺陷小鼠的肾包膜下,并向其体内埋植了释放雌激素和孕酮的缓释小球。在雌激素和孕酮的作用下,移植的平滑肌瘤组织不断增大,建立了能够反映子宫肌瘤特征的移植模型。Suzuki Y等[23]在BALB/c裸鼠背部皮肤下移植人子宫肌瘤组织,同时皮下植入雌激素和孕酮的缓释颗粒。试验结果表明移植的子宫肌瘤组织在裸鼠体内能够生长,并改变其原始分布。

相较于组织移植造模,细胞移植造模具有操作简单,样品来源单一,消除了组织移植必须要从临床上获取新鲜子宫肌瘤组织样品的限制等优点。在子宫肌瘤研究中,细胞移植模型也被广泛应用。Drosch M等[24]将人子宫肌瘤来源的细胞注射到有免疫缺陷的Scid/beige小鼠肌层中,形成在组织学上与人子宫肌瘤相似的移植模型。这种模型无需对原代细胞进行遗传修饰,适合研究子宫肌瘤的致病机制。Chen H Y等[25]通过给Foxn1裸鼠皮下注射预先转染荧光素酶的Eker大鼠来源的子宫肌瘤细胞来建立模型。应用该模型发现白藜芦醇具有治疗子宫肌瘤的潜力,其能显著抑制子宫肌瘤的增长并降低细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白的表达。近年来,随着三维细胞培养方法的发展,研究人员还将三维细胞培养方法应用于子宫肌瘤的细胞移植模型:通过将永生化子宫肌瘤细胞接种到基质胶中形成三维细胞培养体系。再将其移植到预先切除卵巢的NOD/SCID小鼠皮下,同时皮下埋植雌激素和孕酮缓释装置来构建动物模型,此方法建模成功率大于90%[26]。Malik M等[27]利用此模型发现姜黄素能作为预防和治疗子宫肌瘤的潜在药物来抑制子宫肌瘤的生长。尽管异种移植动物模型具有造模成功率高且更能反应人类疾病情况的优点,但也存在一些限制。免疫缺陷小鼠价格昂贵,对其生活环境的无菌要求较高,因此对研究人员的实验条件较为苛刻。

2.4 基因工程动物模型

随着生物科学的发展进步,基因工程技术为人们研究子宫肌瘤提供了新的手段。研究人员通过将外源DNA片段导入受精卵或者利用人工构建的特异性核酸酶对目标基因序列进行精准编辑,从而产生具有稳定遗传的可用于研究子宫肌瘤疾病的动物模型。MED12基因的突变被证明与子宫肌瘤有很强的相关性。Mittal P等[28]将带有FLAG标签的单碱基突变(c.131G>A)的Med12基因整合到常染色体ROSA26基因组位点上,构建了条件性敲除(Amhr2-Cre)子宫间充质细胞中Med12基因并表达Med12(c.131G>A)错义突变基因的小鼠。研究结果显示,这些小鼠出现广泛的子宫肌瘤症状,并且在12周龄后,80%的子宫内病变与子宫肌瘤一致。表明MED12基因的突变导致基因组的不稳定是导致人子宫肌瘤的主要原因之一。

基于Eker大鼠模型,Tsc2基因缺失被认为是子宫肌瘤病因的重要分子机制。Prizant H等[29]使用子宫特异性敲除(Pgr-Cre)Tsc2基因的小鼠发现,在12周龄时几乎100%的条件敲除雌鼠发生子宫肌层增生,在24周龄时发生子宫肌瘤。他们还发现,利用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)抑制剂雷帕霉素可以抑制敲除鼠子宫的生长异常。此外在小鼠子宫肌层中过表达PI3K/Akt-mTOR上游基因Gpr10(G-protein-coupled receptor 10)会导致子宫肌层增生,表现出人子宫肌瘤的分子特征[30]。通过基因工程技术,研究人员可以精确的模拟人类子宫肌瘤中的基因突变,并研究这些突变对疾病发展的影响。基因工程动物模型具有特异性强,能够更有效、直接地研究相关基因对子宫肌瘤影响的优点。然而构建这些模型所需的技术要求高、流程繁琐、效率较低、而且价格昂贵。对现有子宫肌瘤动物模型的相关总结见表1。

表1 现有子宫肌瘤动物模型分析

3 总结与展望

子宫肌瘤是育龄女性常发的肿瘤疾病,对患者的健康和生殖生育能力产生负面影响。尽管子宫肌瘤的具体病因机制没有得到完全证实,但目前的研究认为其发生、发展涉及遗传、性激素水平异常等众多因素。需要强调的是,子宫肌瘤的发生不是一种单独因素就能决定,而是由众多因素相互作用所致,这其中涉及许多分子机制。子宫肌瘤动物模型的建立为进一步研究子宫肌瘤的致病分子机理以及治疗方案提供了有效途径。

通过总结国内外子宫肌瘤动物模型研究进展,发现目前国外子宫肌瘤动物模型多采用自发性免疫缺陷Eker大鼠来建立,该模型近年来被广泛应用于研究内分泌干扰物暴露对子宫肌瘤发病的影响。然而,该模型在国内较难购买以及建模周期较长,限制其在国内的应用。目前国内科研人员主要通过外源性雌激素、孕酮激素联合诱导子宫肌瘤模型的建立。与单一雌激素模型相比,雌激素孕酮激素联合诱导模型具有较高的可靠性和稳定性,并与子宫肌瘤的病因和发病机理有一定的关联,更加适合于临床实验研究,以评估某些药物的药理和治疗作用。然而,选择适合的模型仍然取决于具体的研究目的和需求。

基因工程动物模型的发展为科学工作者研究提供了新的方法和手段。通过构建目标基因的条件敲除鼠,研究人员可以更深入的探究子宫肌瘤的相关分子机制以及评价对应药物的治疗效果。结合近年来飞速发展的类器官、单细胞测序以及空间转录组技术,为子宫肌瘤模型研究提供新的方向。这些有望推动子宫肌瘤的预防、诊断以及治疗领域的发展,为寻找新的治疗靶点和开发个体化治疗方案提供新途径。