羔羊源产ESBLs与非产ESBLs大肠埃希氏菌耐药性差异比较及基因型分析

高海慧,康晓冬,王建东

(宁夏农林科学院动物科学研究所,宁夏银川 750002)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)为条件性致病菌,目前由大肠埃希氏菌引起腹泻病的主要治疗手段仍然以抗生素为主,β-内酰胺类药物是医学临床抗感染治疗中使用最广的抗生素之一[1]。

超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)主要由肠杆菌科细菌产生,能够提供多种β-内酰胺类抗菌药物的水解酶[2],β-内酰胺类耐药决定基因在移动元件上的整合,导致大肠埃希氏菌对新型广谱 β-内酰胺类抗生素出现耐药性,同时耐药基因可通过转化等形式在细菌间传播[3-4]。β-内酰胺类耐药基因主要为blaCTX型、blaTEM型、blaOXA型、blaSHV型等[1]。目前,有关宁夏地区腹泻羔羊源产ESBLs与非产ESBLs大肠埃希氏菌耐药性差异及其β-内酰胺类耐药基因型携带情况鲜有报道。因此,本研究开展宁夏地区羔羊产ESBLs大肠埃希氏菌筛选,产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株耐药性、相关优势基因型的比较和分析,为羔羊产 ESBLs大肠埃希氏菌在宁夏地区的感染和耐药情况提供资料,明确大肠埃希氏菌 ESBLs 耐药基因的传播趋势。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2021年1月-2021年10月分离自宁夏地区规模化羊场腹泻羔羊粪便中的大肠埃希氏菌87株,保存于宁夏农林科学院动物科学研究所动物疫病研究室超低温冰箱。

1.1.2 药物 庆大霉素(10 μg±2.5 μg/片),阿米卡星(30 μg±7.5 μg/片),头孢拉定(30 μg/片),卡那霉素(30 μg/片),头孢呋辛(30 μg/片),哌拉西林(100 μg/片),链霉素(10 μg/片),复方新诺明(23.78 μg SMZ/1.25 μg TM/片),红霉素(15 μg/片),头孢氨苄(30 μg/片),诺氟沙星(10 μg/片),环丙沙星(5 μg/片),头孢唑啉(30 μg/片),头孢曲松(30 μg/片)等,杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.3 主要试剂 4.5 mg/mL NaCl溶液,法国生物梅里埃股份有限公司产品;MH琼脂(批号161021),MAC(批号161119),青岛海博生物技术有限公司产品;细菌基因组DNA提取试剂盒,DNA marker,2×TaqPCR Master Mix,天根生化科技(北京)有限公司产品; ESBLs 测定盒[头孢噻肟 (CTX 30 μg),头孢他定(CAZ 30 μg),头孢噻肟/克拉维酸(CTX/clav 30 μg/10 μg),头孢他定/克拉维酸(CAZ/clav 30 μg/10 μg)],杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 全自动微生物鉴定系统(VITEK-2-Compact15),法国梅里埃公司产品;PCR仪,美国BIO-RAD公司产品;超净工作台(SW-CJ-1FD),苏净集团安泰公司产品;电子比浊仪(DensiCHEK Plus),美国 BioMerieux公司产品;电热恒温培养箱(PHP-9162),浙江托普仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 大肠埃希氏菌的复壮 取出超低温冰箱冻存的菌株,将其接种于麦康凯营养琼脂培养基,37 ℃培养箱过夜培养,镜检确保为纯菌。

1.2.2 大肠埃希氏菌产ESBLs菌株的筛选 将大肠埃希氏菌浓度调整为0.5个麦氏单位,接种于MH琼脂培养基,双纸片协同法进行大肠埃希氏菌产ESBLs菌株的筛选[4],过夜培养后,比较加入克拉维酸与不加克拉维酸菌株的抑菌直径,直径差≥5 mm者判定为产ESBLs菌株。

1.2.3 ESBLs引物的合成及PCR检测 参考文献[1,5]设计基因的特异性引物,引物序列见表1。blaCTX、blaTEM、blaOXA、blaSHV基因扩增引物,生工生物工程(上海)技术服务有限公司合成。各基因的PCR体系为20 μL:上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2×TaqPCR Master Mix 10 μL,DNA模板2 μL,ddH2O补至20 μL。PCR条件为 :95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环;72℃ 10 min。各基因退火温度见表1。

1.2.4 耐药性试验 采用K-B法进行耐药性试验,明确大肠埃希氏菌的药物敏感性,结果按照临床实验室标准化委员会(CLSI)标准判定。

1.2.5 数据统计 采用Excel 2010对试验数据进行初步处理,并采用SPSS 18软件中2*2交叉表法进行差异显著性分析,P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 大肠埃希氏菌的复壮结果

87株冻存的大肠埃希氏菌全部复壮成功。在MAC上呈粉色圆形、突起光滑,菌落单一,镜检为革兰氏阴性短杆菌,如图1。

A.MAC平板结果;B.革兰氏染色镜检结果(1 000×)

A.blaCTX基因; B.blaTEM基因; C.blaOXA基因; D.blaSHV基因

2.2 ESBLs的筛选结果

经双纸片协同法筛选后测量抑菌圈直径,87株大肠埃希氏菌有5株为产ESBLs菌株,82株为非产ESBLs菌株,阳性率为5.75%。

2.3 药敏试验结果

产ESBLs株大肠埃希氏菌耐药率大部分高于非产ESBLs株,差异极显著(P<0.01),非产ESBLs株对复方新诺明和红霉素的耐药率极显著高于产ESBLs株;产ESBLs株大肠埃希氏菌对多数试验药物呈耐药状态,耐药率≥40.00%,对诺氟沙星、氧氟沙星、头孢噻肟、头孢呋辛呈较耐药状态,耐药率均为20.00%;而非产ESBLs株大肠埃希氏菌对多数试验药物呈敏感状态,耐药率≤15.00%,对恩诺沙星、复方新诺明和红霉素呈耐药状态,耐药率分别为54.88%、70.73%和30.49%,具体见表2。

2.4 ESBLs相关基因检测

5株产 ESBLs大肠埃希氏菌中,blaCTX和blaTEM基因阳性率均为80%,blaOXA基因阳性率为20.00%,blaSHV基因阳性率为0;而82株非产ESBLs菌株的blaCTX基因阳性率为71.90%,blaTEM基因阳性率为50.00%,blaOXA和blaSHV基因阳性率均为14.63%。产ESBLs菌株携带blaCTX和blaTEM基因阳性率高于非产ESBLs菌株,前者差异极显著(P<0.01),后者差异不显著(P>0.05);而产ESBLs菌株中的blaOXA和blaSHV基因的阳性率均低于非产ESBLs菌株,差异均不显著(P>0.05)。结果见表3。

3 讨论

产超广谱ESBLs微生物首次分离于SHV-2型肺炎克雷伯菌[6],而产ESBLs相关基因通过质粒可在世界范围内不断传播,在各种环境、动物、人体内甚至食物中均被报道过[7-8]。同时,耐药基因间的传播增强了大肠埃希氏菌的耐药性,给临床用药带来了巨大的困难,同时存在向人类传递的风险。

相对于鸡源、猪源、牛源和兔源等产酶菌株的研究,国内针对羊源产酶菌株的报道较少[9]。本研究对分离自宁夏地区羔羊源87株大肠埃希氏菌进行ESBLs表型检测,检出率为5.75%,均低于宁夏地区犊牛源产ESBLs菌株的检出率(68.92%)、青岛地区鸡源产ESBLs菌株的检出率(83.13%)[10]、贵州地区猪源产ESBLs菌株的检出率(66.7%)[11]。由此可见,不同地区不同畜种,产ESBLs大肠埃希氏菌菌株的流行分布存在差异,宁夏地区羔羊源产ESBLs大肠埃希氏菌流行率较低,需要继续通过合理使用抗生素、加强场区疫病防控的方法,预防产ESBLs大肠埃希氏菌在宁夏地区羊养殖场中的传播。

本研究中羊源产ESBLs菌株的耐药性普遍高于非产ESBLs菌株,产ESBLs株对其他药物耐药率均大于20.00%,非产ESBLs株对其他药物耐药率最低为0,差异极显著(P<0.01),故产ESBLs菌株比非产ESBLs菌株耐药严重,且对不同类别的药物表现出高水平的多重耐药性。由于质粒或整合子介导的ESBLs可以在不同细菌间传播与扩散,且产ESBLs细菌的质粒上还携带其它种类抗菌药物的耐药基因,导致细菌产生多重耐药和交叉耐药,故产ESBLs大肠埃希氏菌对 β-内酰胺酶类药物产生耐药的同时,还对氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类等抗菌药物耐药[10]。本研究分离的的87株羊源大肠埃希氏菌药敏试验结果显示,20种药物中,除了复方新诺明和红霉素,其余药物中产ESBLs株的耐药率极显著高于非产ESBLs株,可见产ESBLs菌株的多重耐药性和交叉耐药性比非产ESBLs菌株严重。此外,产ESBLs株对多数试验药物呈耐药状态,对诺氟沙星、氧氟沙星、头孢噻肟、头孢呋辛呈较耐药状态;而非产ESBLs株对多数试验药物呈敏感状态,对头孢曲松呈极度敏感状态,但对恩诺沙星、复方新诺明和红霉素呈耐药状态。河南省羊源大肠埃希氏菌对红霉素耐药率为100%,其他药物如氨苄西林、恩诺沙星、头孢拉定等耐药率均大于20%[12],内蒙地区大肠埃希氏菌分离菌株对氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋等药物耐药率在53.3%以上[13],与本研究一致,羊源大肠埃希氏菌对红霉素、恩诺沙星等药物产生耐药性,因此临床应减少这些药物的使用。宁夏地区羊源大肠埃希氏菌非产ESBLs株可用头孢曲松作临床治疗首选药物,以提高治愈率,减少耐药菌株的出现。

ESBLs的产生导致大肠埃希氏菌对抗菌药耐药率越来越高,流行基因型也逐渐呈现出多样化。目前已发现400多种β-内酰胺酶类,不同地区流行的基因型和亚型存在差异[14],ESBLs的种类根据编码基因同源性的不同可分为blaTEM型、blaSHV型、blaCTX型、blaOXA型和其他型。近年来的研究报道显示,blaCTX型产ESBLs菌株在我国逐渐占主导地位,这与其主要位于结合性质粒的基因结构密切相关[15],blaCTX型其水解头孢菌素类抗生素的能力较其他类型超广谱β-内酰胺酶高,与头孢唑啉和头孢噻呋的耐药表型呈极显著相关[16]。本研究中,5株产ESBLs菌株中,产ESBLs菌株和非产EABLs菌株中的blaCTX基因的阳性率分别为80%和71.90%,这与我国其他地区产ESBLs菌株型流行性相符。blaTEM型ESBLs 都是blaTEM-1和blaTEM-2 基因突变,blaTEM亚型种类有很多,除blaTEM-12 外均由质粒所介导[17]。近年来,blaTEM型流行在我国也呈逐渐增长趋势,曲志娜等[18]、坤清芳等[5]研究中blaTEM的检出率分别为99.52%和63.77%。本研究中产ESBLs与非产ESBLs菌株中blaTEM的检出率分别为80.00%和50.00%,与上述报道结果相似。blaOXA型ESBLs能有效水解苯唑西林,常见于铜绿假单胞菌中,而blaSHV型ESBLs能水解头孢噻吩的疏基。本研究中,产ESBLs菌株携带blaOXA、blaSHV的阳性率分别为20.00%、0.00%,非产ESBLs菌株携带blaOXA、blaSHV基因阳性率均为14.63%,两者在大肠埃希氏菌中检出率较低。产ESBLs菌株携带blaCTX和blaTEM的阳性率高于非产ESBLs菌株,前者差异极显著(P<0.01),后者差异不显著(P>0.05);而产ESBLs菌株中的blaOXA和blaSHV基因的阳性率均低于非产ESBLs菌株,差异均不显著(P>0.05),表明产ESBLs菌株多数药物耐药性极显著高于非产ESBLs菌株,这可能与携带相关的基因型相关。

耐药基因在羊源大肠埃希氏菌中分布广泛,尤其是blaCTX和blaTEM基因型。经过比对产ESBLs菌株和非产ESBLs菌株间的耐药谱型与耐药基因的关系,发现携带同一类耐药基因的产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株耐药表型并不相同,无绝对相关性,这可能与基因的表达状态有关系,也可能是细菌生物被膜的形成,引起临床上多选择性的表型突变[19],也可能与宿主免疫力和抗生素的选择压力有关[20]。