马流产沙门氏菌研究进展

齐佳欣,邵明杰,崔 平,张玉良,张鹤平*,肖跃强*

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院,河北邯郸 056021;2.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州 256600;3.滨州市畜牧兽医管理服务中心,山东滨州 256600;4.无棣县畜牧兽医管理服务中心,山东无棣 251900)

1885年,沙门氏菌(Salmonella)首先从感染猪瘟病毒的猪肠道中发现并分离。目前,沙门氏菌属分为邦戈尔沙门氏菌(Salmonellabongori)和肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)等,其中肠道沙门氏菌血清型已经发现2 600多种[1]。马流产沙门氏菌是肠道沙门氏菌成员,为宿主适应型,仅对马属动物致病,最早出现在18世纪末至19世纪初的美洲和欧洲地区,我国于20世纪70年代末在华北、西北、东北等养马地区陆续发生由该菌引起的马流产沙门氏菌病[2]。该病全年均可发生,多发生于春、秋两季,呈散发及地方性流行。马属动物感染无年龄限制,但以初产母畜和幼驹的易感性最高[3]。马流产沙门氏菌以垂直和水平两种方式传播,感染动物是重要的病原携带者和传播者,感染母马从阴道向外界排菌时长达几周。有研究报道由该菌引起的母马流产率为10%～60%,若病原菌初次传入未发生过疫情的养殖场,流产率可高达90%[4]。高星熠等[5]对山东聊城、德州、滨州等地的9个规模化驴场进行调查,在流产症状样品中,马流产沙门氏菌检出率最高,为44.29%;高楠楠[6]发现山东、内蒙古、辽宁和河南等4省份11家中小规模驴养殖场均存在较为严重的繁殖障碍性问题,122份流产胎儿样品确诊为流产沙门氏菌的比例达94.3%。论文对马流产沙门氏菌引起的临床症状、致病机制、疫苗研制等方面进行综述,旨在为更好地开展马流产沙门氏菌病的预防、控制和净化等提供参考。

1 临床症状

1.1 母马

马流产沙门氏菌不仅可引起母马流产,还会引起子宫内膜炎等。母马感染初期症状不明显,通常为亚临床感染,在感染后期,孕马对外界刺激反应减弱,并伴有体温升高、精神沉郁、食欲不振、腹泻等症状。严重的反应强烈,表现为频频踢腹、乳房肿胀、阴门水肿、阴道血样液体流出等。孕马流产多发于妊娠中后期,流产前排尿次数增加、阴道有血液流出[7]。流产后,母马可发生子宫内膜炎及阴道炎,导致长时间发情不规律、排卵不正常、受孕率降低从而影响配种,但多数母马可自行好转,若治疗不及时,极少数母马可继发感染发生瘘管萎缩、败血症、化脓性关节炎、胃扩张以及肠梗阻等,甚至死亡[8]。

1.2 公马

马流产沙门氏菌可引起公马睾丸炎,主要表现为体温升高、食欲减退、结膜潮红或黄染、阴囊和睾丸水肿。也会出现关节炎和鬐甲部脓肿等症状,有时脓肿破溃会形成瘘管甚至出现鬐甲炎[9]。

1.3 幼驹

无临床症状的母马所产小马驹,表现为体温升高(可高达41℃),并伴有嗜睡、严重腹泻等症状,严重者在2～3 d内死亡[3]。多数流产胎儿为死胎,伴随胎衣一起分娩而出,胎儿皮肤和实质脏器黄染,羊水浑浊且多为黄色或紫红色,胎膜表面有糠麸样物质。

2 致病机制

目前,马流产沙门氏菌的侵入致病机制有待深入研究。沙门氏菌感染主要经粪-口途径,不同血清型沙门氏菌在不同宿主环境中生存和增殖受多种因素影响,包括宿主环境(pH、温度和附着部位等)的差异、宿主免疫系统及其对不同血清型的反应、宿主体内的共生生物以及病原菌本身的遗传学特性等[10]。当沙门氏菌污染物被机体摄入后,必须能在胃内酸性环境中存活并通过消化系统进入胃肠道器官,在肠道内与肠道菌群竞争,到达并穿过肠黏液层,定殖于肠上皮细胞[11]。当侵入肠上皮细胞黏膜之后,沙门氏菌可进入血液并感染其他器官系统,导致严重的革兰氏阴性败血症症状,如发热、白细胞减少、血凝障碍、乳酸中毒、葡萄糖和氨基酸代谢紊乱、腹泻等,使动物机体体液失衡,进而导致动物机体状况迅速恶化[12]。沙门氏菌的致病性是由毒力岛毒力因子、质粒毒力因子、结构性毒力因子(包括菌毛和鞭毛)、内毒素毒力因子等参与并相互作用所致,因此,了解毒力因子在沙门氏菌感染致病过程中所发挥的作用,对开展马流产沙门氏菌对马属动物致病机制研究具有重要参考意义。

2.1 毒力岛毒力因子

沙门氏菌毒力岛(Salmonellapathogenicity island,SPI)是一段含有毒力相关基因的、不稳定的位于染色体上的DNA片段,大小为10 kb～100 kb,能编码多种毒力蛋白,协同调控沙门氏菌的入侵和感染,从而增强其致病力。目前,沙门氏菌含有20多个SPI,大多数血清型中存在SPI-1至SPI-5[13]。其中SPI-1和SPI-2含有大量与细胞内发病机制相关的毒力基因,共同编码Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion sysem,T3SS),同时与沙门氏菌持续性感染密切相关[14-15]。SPI-1遗传性状稳定,大小为43 kb,含有47个基因,目前在与致病力相关性研究最多且最为清楚的基因有avrA、iacB、invB、sicA、sicP、sipABC、sptP,通过参与细菌侵入宿主细胞引发肠道炎症,进而诱导巨噬细胞凋亡,从而影响沙门氏菌的毒力[16];SPI-2大小约为40 kb,含有编码T3SS相关蛋白的多个基因,包括结构基因(ssa)、调控基因(ssr)、伴侣基因(ssc)、效应基因(sse)等[17],除邦戈尔沙门氏菌外,所有血清型都含有SPI-2[18],目前在与致病力相关性研究最多的基因有ssaBE、sscAB、sseLFG、ttr,它们与引发的宿主全身性感染和在巨噬细胞内的存活及复制有关,主要参与巨噬细胞内全身感染和复制;SPI-3大小为17 kb,包含sugR、rhuM、rmbA、misL、fidL、marT、slsA、cigR、mgtB和mgtC共10个基因,主要与在巨噬细胞的存活和在低镁环境中生长相关[19];SPI-4大小为27 kb,包含SiiA～SiiF等6个主要基因,其中SiiA～SiiD和SiiF基因形成Ⅰ型分泌系统(T1SS),用于分泌黏附素SiiE,利于沙门氏菌黏附在上皮细胞表面,促进沙门氏菌的定植[20]。SPI-5大小为7.6 kb,包含pipA～D、sopB、sig-DE等基因,聚集编码多种T3SS效应蛋白,与在宿主的肠道定植有关。

国内研究人员对马流产沙门氏菌流行菌株毒力岛进行了初步研究。朱曼玲[21]在马流产沙门氏菌AD19菌株中发现了SPI-1～5、SPI-12～14和C63PI毒力岛,其中SPI-1由invA、spaP、spaQ、spaR、spaS、invG、prgH、prgK、invE、invB、invC、spaO、iagB、prgI、prgJ、orgA、sicA、iacP等毒力基因组成,SPI-2由ssaC～ssaU、ssrB、ssrA、sscA、sscB、sseA～sseG、sseJ等毒力基因组成。与此同时,该菌株表现出一个罕见的菌毛基因簇(sste),在肠炎沙门氏菌中,ste簇由6个菌毛基因(steA、steB、steC、steD、steE和steF)组成,在肠道定殖方面发挥重要作用。孙阳阳[22]等人在对山东某驴场流产胎儿分离获得7株沙门氏菌SL1～SL7,选取毒力岛代表性毒力基因(SPI-1:invA、sip;SPI-2:sseA、ttrA;SPI-3:mgtB、mgtC;SPI-4:ssb、soxSR;SPI-5:sopB、sig-D及菌毛基因fimW)进行分析,结果显示,除SL1、SL2、SL3、SL7菌株毒力岛SPI-4上的ssb毒力基因未检出外,7株分离菌均具有沙门氏菌典型毒力基因,虽然分离菌株毒力基因均被检出,但在后续小鼠致病性试验中发现其致病性并不强,因此推断沙门氏菌毒力基因与致病性强弱无必然联系。

2.2 质粒毒力因子

沙门氏菌的毒力质粒(virulence plasmid)在全身性感染宿主过程中发挥重要作用,毒力质粒的携带与特定的血清型有关。在大量的沙门氏菌血清型中,只有少数含有血清型特异性毒力质粒。目前已报道的携带毒力质粒的沙门氏菌血清型有鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、鸡沙门氏菌(Salmonellagallinarum)、都柏林沙门氏菌(Salmonelladublin)、丙型副伤寒沙门氏菌(SalmonellaparatyphiC)、布利丹沙门氏菌(Salmonellablegdam)、御成门沙门氏菌(Salmonellaonarimon)、仙台沙门氏菌(Salmonellasendai)、绵羊流产沙门氏菌(Salmonellaabortusovis)等10种[23],操纵子大小为6.8 kb,含有spvR、spvA～spvD5个基因,主要与沙门氏菌血清抗性、黏附与定居、在肠外组织细胞以及巨噬细胞内存活和生长等有关[24]。

2.3 结构性毒力因子

在各种血清型的沙门氏菌基因组中,菌毛编码基因操纵子广泛存在,含有5～20种菌毛编码基因操纵子,依据其可能的表达和组装方式,菌毛主要分为伴侣蛋白-推进蛋白途径类(chaperone-usher pathway)菌毛、成核沉淀途径类(nucleation-precipitation pathway)菌毛、Ⅳ型菌毛共3种类型[25]。菌毛呈丝状表面结构,利于沙门氏菌对上皮的定殖,在感染过程中,菌毛对宿主的识别、定殖和生物膜的形成至关重要,被认为是介导沙门氏菌与宿主肠上皮相互作用和黏附的主要细胞器。而鞭毛则具有运动、趋化和诱导免疫的能力,在增强沙门氏菌的定殖和侵袭方面发挥重要作用[26]。

3 疫苗研究

疫苗对于马流产沙门氏菌病的防控发挥了积极重要作用。我国在20世纪70年代成功研制了弱毒疫苗,然而,由于该病受到的关注有限,导致疫苗的研究相对滞后。随着新型佐剂的应用与基因工程技术的完善,国内外学者开展了全菌灭活疫苗与亚单位疫苗研究,旨在为该病的防控提供更为安全、有效的疫苗制剂。

3.1 弱毒疫苗

20世纪70年代,房晓文等[27]成功研制了马流产弱毒菌苗(C355株),用马流产沙门氏菌C77-3强毒株通过含醋酸铊肉汤培养基传至355代致弱而成,具有安全性好、毒力稳定、免疫力强及起效快等优点,肌肉注射200亿活菌不会导致流产,免疫后14～21 d产生免疫力,以100亿活菌剂量免疫怀孕母马,每年2次,其保护率可高达100%;该疫苗的广泛使用为我国20世纪防控马流产沙门氏菌病的发生流行起到了积极重要作用。童坤周等[4]通过使用钝感动物雏鸡脑内接种连续传代,再经雏鸡体内与培养基体外连续交替培养致弱,成功研制了C系(C39)菌株弱毒疫苗,同样具有安全、稳定、高效等优点。然而,随着马属动物养殖规模与模式变迁,市场需求规模受到严重限制,导致该类疫苗的商品化生产中断。2018年后,由于马流产沙门氏菌病的持续发生,C355马流产弱毒疫苗恢复生产至今并在养殖场使用,继续为该病的防控起到了积极重要作用。

3.2 灭活疫苗

全菌灭活疫苗同样可以用于防控马流产沙门氏菌引起的流产疫情,在国内外均有应用研究。Stazi M等[28]制备甲醛灭活氢氧化铝佐剂自家疫苗免疫母马,72 h后出现短暂的局部肿胀和颈部僵硬等不良反应,随后改进利用MontanideTMSeppic IMS1313佐剂制备疫苗,该佐剂是一种液体颗粒,粒径10～500 nm,为即用型纳米佐剂,含有免疫刺激化合物,该佐剂疫苗免疫2次均未引起任何局部不良反应,且二免后1年内母马没有再次发生流产疫情。血清学检测数据显示,二免后免疫母马具有较高水平的体液保护作用,通过母源抗体对新生马驹也具有被动免疫保护力。王晓钧等[29]、胡哲等[30]分别以马流产沙门氏菌马源株、马流产沙门氏菌驴源株甲醛灭活抗原研制了MONTANIDE ISA35水包油佐剂疫苗,小鼠免疫1次即能免于强毒株攻击;在本动物马或驴安全性良好,怀孕动物均未发生流产,马源株疫苗除个别出现采食下降、肿胀或者体温短暂升高外,无严重不良反应;驴源株疫苗通过调整抗原含量与佐剂使用量,避免了注射部位破溃等严重不良反应;同时还具有低剂量免疫的优点,推荐1年春、秋季各免疫1次,间隔6个月。刘明等[31]以驴源流产沙门氏菌菌株、马链球菌兽疫亚种分离株为疫苗候选菌株,分别制备氢氧化铝、角鲨烯佐剂驴流产沙门氏菌病-兽疫链球菌病二联灭活疫苗,免疫Babl/c小鼠并以5倍LD50攻毒,氢氧化铝佐剂疫苗对2种病原菌的保护率分别为62.5%和75.0%,角鲨烯佐剂疫苗的保护率均为100%;使用角鲨烯佐剂二联灭活苗免疫驴,针对驴流产沙门氏菌、兽疫链球菌血清杀菌效价分别为1∶16(杀菌效率68.99%)和1∶4(杀菌效率65.47%)。可见,以角鲨烯为佐剂制备的二联灭活苗在小鼠、驴体内均具有较强的免疫保护效力,且显著优于氢氧化铝佐剂疫苗。以上研究表明,灭活疫苗可有效防控马流产沙门氏菌病的流行,同时,灭活疫苗具有自身的优点,包括安全、不发生毒力返祖等。

3.3 噬菌体“裂解物”疫苗

噬菌体(phage)是感染放线菌、藻类、真菌以及细菌等微生物的病毒的总称,在细菌体内增殖到一定阶段可对宿主菌产生裂解作用,具有裂解力强、绿色安全、宿主特异等优点。噬菌体裂解物是由噬菌体裂解的细菌片段组成,不改变抗原性,可诱导细胞和体液免疫反应。Abhishek等[32]利用噬菌体PIZ-SAE-2裂解流产沙门氏菌获得裂解物,并评价了单纯噬菌体裂解物(PL-Plain)和以氢氧化铝胶为佐剂的噬菌体裂解物(PL-Ad)对流产沙门氏菌SAE-742感染保护作用;将PL-Plain与PL-Ad分别腹腔注射4～6周龄雌性豚鼠,剂量为25 μL、50 μL和100 μL,均可诱导良好的体液免疫,且两种裂解物50 μL剂量组间接ELISA抗体滴度均高于100 μL剂量组(文献作者认为100 μL高剂量组可能产生了免疫耐受)和全菌灭活疫苗组,同时,两种疫苗均诱导产生良好的细胞免疫,淋巴细胞转化水平显著高于全菌灭活疫苗组,并以PL-Ad疫苗50 μL剂量组最高;采用脾重量指数评价免疫保护效果,两种疫苗该指数无差异,显著低于全菌灭活疫苗组与PBS对照组,说明对豚鼠的保护效率显著提高。该研究结果说明,噬菌体通过裂解方式灭活菌体可能成为一种可行的替代策略,为开发低剂量使用、安全、有效的裂解物疫苗提供了新的参考。

3.4 亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗具有成本低、安全性好、可制备多联多价、适用范围广等优点。研究表明,当沙门氏菌感染时,鞭毛蛋白可诱导机体产生鞭毛特异性的CD4+/CD8+T细胞活化及相应的体液免疫反应[33],FliC(flagellin C)和FljB(flagellin B)基因则分别编码马流产沙门氏菌鞭毛蛋白的第1、2相鞭毛抗原。2017年,杨康等[34]克隆马流产沙门氏菌新疆分离株FliC基因,原核表达的FliC重组蛋白与弗氏佐剂乳化后制备疫苗,经背部皮下多点注射免疫小鼠,免疫剂量为50 μg/0.2 mL,3周后加强免疫,每次免疫后14 d采血,经ELISA测定,二免后特异性抗体效价可达1∶72 900,与对照组差异极显著,且抗体亚型主要是IgG1,以1 MLD50攻毒,保护率73%,对照组全部死亡。常建新等[35]克隆马流产沙门氏菌新疆分离株XJMS-97FljB鞭毛蛋白基因,同样进行原核表达,疫苗制备、小鼠免疫及抗体检测与文献[34]相同,二免后14 d血清抗体效价为1∶21 500,以5 MLD50攻毒,保护率75%,对照组全部死亡。王浩等[36]比较了FliC与FljB原核表达重组鞭毛蛋白免疫效力,经背部皮下多点注射免疫小鼠,剂量为50 μg/只,共免疫2次,间隔14 d,分别在0、14、35、42 d采血,间接ELISA方法测定抗体效价,结果显示,两种蛋白均可诱导产生较高水平的特异性抗体IgG,主要为IgG1亚型,其中FljB免疫组抗体水平高于FliC免疫组,二免后14 d攻毒结果显示,FljB免疫组保护率87.5%,高于FliC免疫组的75%。以上研究结果均表明,马流产沙门氏菌第1、2相鞭毛原核表达重组抗原具有良好的免疫原性,但均不能提供完全保护,因此需要对其他免疫保护性蛋白展开筛选,挖掘可提供完全保护或者可与鞭毛蛋白协同完全保护的免疫原,从而为新型亚单位疫苗开发奠定坚实基础。

4 展望

明确致病机制、研制高效的疫苗等对于开展马流产沙门氏菌病的防治具有重要意义。然而,马流产沙门氏菌致病机制仍有待深入研究,尤其感染后侵染路径、如何透过胎盘屏障以及在怀孕中后期大量繁殖的诱因等,为开展科学防治提供支撑。同时,马流产沙门氏菌病疫苗的生产或者新兽药申报因市场规模原因,无法低成本运营,限制了其开发应用与推广,这极大的困扰着马流产沙门氏菌病的防治,如若破局,则需要社会各界的共同关注和努力,以促进马属动物产业的特色发展。