宁夏地区奶牛源隐孢子虫分子鉴定与分析

黎玉琼,于有利*,从志鹏,赵正伟,梁小军,王韦健,李继东,李勤凡,文 亮,牛晓昊

(1.宁夏农林科学院,宁夏银川 750002;2.西北农林科技大学,陕西杨凌 712100;3.华南农业大学,广东广州 510642;4.宁夏大学,宁夏银川 750002;5.宁夏农垦乳业股份有限公司渠口牧场,宁夏银川 750002)

隐孢子虫(Cryptosporidium)属于原生生物界(Protozoa)、顶端复合体亚门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoasida)、球虫亚纲(Coccidiasina)、真球虫目(Eucoccidiorida)、艾美耳亚目(Eimeriorina)、隐孢子虫科(Cryptosporidiidae)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)[1],是引起包括人类在内的多种脊椎动物腹泻和胃肠炎的主要病原,尤其是对幼儿和免疫功能低下患者具有很大威胁[2]。目前,主要通过分子生物学方法来评估隐孢子虫的遗传多样性,基于隐孢子虫gp60基因的PCR方法常被用来区分同一虫种的不同亚型[3]。引起牛隐孢子虫的感染通常与微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫和安氏隐孢子虫有关。微小隐孢子虫通常感染人和牛,而安氏隐孢子虫和牛隐孢子虫偶尔也会感染人[4],因此受感染的牛可能是人类感染隐孢子虫的潜在的重要宿主。微小隐孢子虫的常见亚型家族主要包括Ⅱa、Ⅱc和Ⅱd型,其中Ⅱa和Ⅱd型主要存在于人类和反刍动物中,Ⅱc主要存在于人类中[2]。在世界范围内,Ⅱa亚型家族主要存在于发达国家的断奶前犊牛中,Ⅱd亚型家族主要存在于欧洲和中东国家的绵羊和山羊的羔羊中,而Ⅱc亚型家族主要存在于低收入和中等收入国家的人群中[5]。近年来国内诸多研究发现Ⅱd亚型也是导致我国断奶前犊牛感染的主要亚型。目前在已检测到的微小隐孢子虫亚型家族中,ⅡdA15G1、ⅡdA18G1、ⅡdA19G1、ⅡdA20G1[4,6]较为常见,其中ⅡdA15G1亚型在我国西北地区较为常见,ⅡdA18G1在中国中西部地区较为常见[7-8],ⅡdA19G1亚型在我国东部地区较为常见,ⅡdA20G1亚型曾在我国东北地区报道过[6]。关于宁夏地区奶牛中隐孢子虫的分布情况鲜有报道。本研究通过分子生物学方法调查宁夏部分地区奶牛隐孢子虫的分子流行病学特征,以期明确其传播风险及危害,从而为进一步制定相应的防控治疗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 奶牛粪便样品 1 174份奶牛新鲜粪便样品,随机采集自宁夏石嘴山市(33份)、中卫市(16份)、吴忠市(333份)和银川市(792份)4个地区10个集约化奶牛场(表1)。采样方法为直肠采样或收集地面上刚排泄的新鲜粪便,保存于2.5%重铬酸钾溶液的离心管中,同时记录样品详细信息,包括牛的圈舍、牛号、月龄以及粪便性状等。将样品置于4 ℃保存,待检。

表1 奶牛粪便样品的来源信息

1.1.2 主要试剂 重铬酸钾(483044),Sigma-Aldrich公司产品;CellRed核酸染料(41003),北京沃比森科技公司产品;无水乙醇(E7148),Sigma-Aldrich公司产品;FastDNA®SPIN Kit for Soil DNA(116560200),MP Biomedicals公司产品;TaqPCR Master Mix(PC1150 ),Solarbio公司产品; DNA Marker DL1000(D526A),日本Takara公司产品;生理盐水(ST341),Agarose琼脂糖(ST004L),PBS缓冲液(ST447),上海碧云天有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 小型台式离心机(5430),Eppendorf公司产品;PCR扩增仪(S1000TM),Bio-Rad公司产品;凝胶成像系统(Gel Doc XR+),美国Bio-Rad公司产品;均质破碎仪(MP FastPrep®-24),上海迭戈生物科技有限公司产品;多功能电子天平(JD500-2),沈阳龙腾电子有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 粪便样品DNA的提取 称取250.0 mg的粪样装入2 mL的灭菌离心管内,用灭菌双蒸水混合均匀后12 000 r/min离心10 min,双蒸水洗涤3次,弃掉上清,粪便沉淀根据FastDNA®SPIN Kit for Soil DNA试剂盒提取粪便基因组DNA,具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.2.2 目的基因的扩增 基于核糖体小亚基RNA(SSUrRNA)基因鉴定隐孢子虫阳性样品[9],基于微小隐孢子虫表面黏附蛋白gp60鉴定微小隐孢子虫基因型[10],分别针对SSUrRNA和gp60设计套式PCR引物。引物序列及目的片段大小见表2,引物由上海生工生物工程有限公司合成。第1轮套式PCR反应体系为25 μL:GreenTaqMix高保真酶12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,ddH2O 8.5 μL。反应条件为:95 ℃预变性7 min;95 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35个循环;72 ℃延伸1 min,4 ℃停止反应;随后将第1轮反应中的2 μL产物作为模板进行第2轮PCR扩增。第2轮套式PCR扩增体系为25 μL:GreenTaqMix高保真酶 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 8.5 μL。第2轮PCR扩增程序:95 ℃预变性7 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35个循环;72 ℃延伸1 min,4 ℃停止反应。分别取10 μL第2轮PCR产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳,并按照DNA片段快速胶回收试剂盒说明书进行DNA片段纯化。纯化的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表2 套氏PCR引物序列

1.2.3 隐孢子虫的遗传进化分析 根据SSUrRNA测序结果,经Blast序列比对,选用GenBank中C.ryanaeJX416367 DCC-6、C.ryanaeAB777174 isolate 37281、C.ryanaeKP793013 isolate 1226、C.ryanaeKC618591 strain 255C、C.bovisbovine genotype AY7413、C.bovisJX416363 DDC17、C.bovisAB746197 isolate 21、C.felisKJ194109 isolate PS41、C.parvumAF093493、C.parvumKJ808689、C.parvumAB968048、C.andersoniKF826306、C.andersoniKT92229和C.andersoniEU245042为参考序列,并使用ClustalX 2.0.12软件进行序列比对,确定相关虫种/基因型或基因亚型并构建种系发育进化树。

1.2.4 数据的统计分析 利用SPSS 23.0软件对试验数据进行统计分析,试验数据以“平均值±标准误”表示。采用卡方检验对结果进行差异显著性分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 宁夏地区奶牛隐孢子虫的感染率

通过对宁夏地区10个规模化奶牛养殖场采集的1 174份不同月龄奶牛粪便样品基因组DNA提取,并针对SSUrRNA基因进行套式PCR扩增,检测目的片段大小为830 bp(见图1),共有335份样品为隐孢子虫阳性,总感染率为28.5%(335/1 174)。其中中卫市隐孢子虫感染率为25.0%(4/16)、石嘴山市感染率为39.4%(13/33)、吴忠市感染率为58.3%(194/333)以及银川市感染率为15.7%(124/792)。宁夏4个地区隐孢子虫感染率差异极显著(P<0.001)。通过分析隐孢子虫在不同月龄段奶牛感染率的结果,如表4所示,隐孢子虫在0～2月龄犊牛中感染最严重,感染率为47.7%(143/300),3～4月龄犊牛感染率为41.9%(106/253),5～7月龄奶牛感染率为19.6%(71/363),8～12月龄奶牛感染率为0%(0/69),12月龄以上奶牛感染率为7.9%(15/189),不同月龄之间奶牛隐孢子虫感染率差异极显著(P<0.001)。此外,根据奶牛的粪便性状进行划分为腹泻样品(451份)和非腹泻样品(723份)。如表5所示,腹泻样品中隐孢子虫的感染率为37.5%(169/451)显著高于非腹泻样品中的感染率13.0%(94/723),差异极显著(P<0.001)。

M.DNA标准DL 1 000;1～21.部分样品;-.阴性对照;+.阳性对照

M.DNA标准DL 1 000;1～22.部分样品;-.阴性对照;+.阳性对照

2.2 宁夏地区奶牛中隐孢子虫虫种分布

针对335份隐孢子虫阳性样品基因组DNA进行基于SSUrRNA基因的第2轮套式PCR,共检测到4种隐孢子虫虫种,其中微小隐孢子虫感染率为40.6%(136/335),牛隐孢子虫感染率为36.1%(121/335),瑞氏隐孢子虫感染率为19.4%(65/335),安氏隐孢子虫感染率为3.9%(13/335)(见表3)。在宁夏的不同地区奶牛中,牛隐孢子虫(44.8%,87/194)为吴忠市的优势虫种;微小隐孢子虫为石嘴山市(46.2%,6/13)、中卫市(100%,4/4)和银川市(55.6%,69/124)的优势虫种(表3)。以上数据表明微小隐孢子虫是导致宁夏地区奶牛感染的优势虫种。不同月龄段奶牛感染的隐孢子虫虫种也不同,其中微小隐孢子虫(78.3%,112/143)是0～2月龄犊牛的优势虫种;牛隐孢子虫是3～4月龄(53.8%,57/106)和5～7月龄(47.9%,34/71)奶牛的优势虫种;同时瑞氏隐孢子虫(47.9%,34/71)也是5～7月龄奶牛的优势虫种;安氏隐孢子虫(66.7%,10/15)是12月龄以上成年奶牛的优势虫种(表4)。微小隐孢子虫仅在0～4月龄以内犊牛中发现,未在大于4月龄以上的奶牛中发现。另外,腹泻阳性样品中主要是牛隐孢子虫,其次是微小隐孢子虫,非腹泻样品中主要是微小隐孢子虫(表5)。

表3 宁夏地区奶牛隐孢子虫感染情况和感染虫种

表4 不同月龄奶牛隐孢子虫的感染率和感染虫种

表5 不同粪便性状样品中隐孢子虫的感染率和感染虫种

2.3 隐孢子虫虫种在宁夏奶牛中的系统发育分析

基于SSUrRNA基因对宁夏地区奶牛隐孢子虫进行系统发育分析,结果表明本研究获得的样品序列(C.parvumNX cattle,C.bovisNX cattle,C.ryanaeNX cattle和C.andersoniNX cattle)分别与微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫和安氏隐孢子虫位于同一分支上,进一步证实本研究中宁夏奶牛中隐孢子虫分离株为微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫和安氏隐孢子虫,本研究的部分隐孢子虫序列用黑色三角形表示(图3)。

注:黑色三角代表本研究检出的隐孢子虫基因型

2.4 宁夏不同地区奶牛中微小隐孢子虫的亚型分布

针对136份微小隐孢子虫阳性样品基因组DNA基于gp60基因的套式PCR检测微小隐孢子虫的基因亚型(图2),并分别经NCBI BLAST序列比对。共检测出4种基因亚型,其中IIdA15G1感染率为51.5%(70/136),IIdA18G1感染率为19.1%(26/136),IIdA19G1感染率为17.0%(23/136),IIdA20G1感染率为12.5%(17/136)(表6)。在宁夏4个地区奶牛中,IIdA15G1微小隐孢子虫是导致奶牛感染的优势虫种。同样IIdA15G1微小隐孢子虫也是0～2月龄和3～4月龄奶牛以及腹泻样品和非腹泻样品中的优势虫种(表6)。

表6 微小隐孢子虫亚型及其分布

3 讨论

我国是奶牛养殖大国,宁夏地区是全国奶业的优势产区,是公认的“黄金奶源带”。截至2020年,宁夏地区的奶牛存栏量位居全国第8位[11]。随着规模化奶(肉)牛养殖业迅猛发展,由隐孢子虫等寄生虫感染引起的奶牛腹泻和呼吸道疾病发病率和死亡率急剧攀升,严重威胁地区的公共卫生安全。在本次调查中,宁夏地区奶牛隐孢子虫的感染率为28.5%,显著高于之前其他地区如甘肃(4.2%)[12]、新疆(16.0%)[13]、广东省(4.4%)[14]、湖北省(15.5%)[15]、四川省(14.4%)[16]、江西省(12.8%)[17]和河南省(25.1%)[18]报道的奶牛中隐孢子虫的感染率,但低于黑龙江省(47.7%)[19]奶牛隐孢子虫的感染率。此外,不同地区的优势虫种不同,本此调查中发现微小隐孢子虫是导致宁夏地区奶牛感染的优势虫种,这与关于河南省和黑龙江省的报道中牛隐孢子虫是优势虫种不同。造成这些不同可能与不同地区奶牛养殖场的饲养管理以及样品诊断方法和采样季节等多种因素相关。在本研究中,通过对不同月龄奶牛的粪样进行检查和分析发现不同月龄隐孢子虫感染率差异显著,其中0～2月龄犊牛隐孢子虫感染率最高,优势虫种为微小隐孢子虫。诸多学者研究表明,微小隐孢子虫是断奶前犊牛感染的主要虫种,断奶后犊牛、育成牛和12月龄以上奶牛主要感染牛隐孢子虫、安氏隐孢子虫和瑞氏隐孢子虫[20],这与本研究结果一致。本研究基于微小隐孢子虫gp60基因的序列分析中发现微小隐孢子虫的亚型主要为ⅡdA15G1、ⅡdA18G1、ⅡdA19G1和ⅡdA20G1,其中ⅡdA15G1是不同地区、不同月龄以及不同性状粪便检测到最多的,其在宁夏地区也广泛流行[21],同本研究结果一致。

近年来,在绿色养殖理念的指导下,减抗在养殖中得到深入的开展,但是由于尚未有效的替抗产品的出现,集约化养殖中牛隐孢子虫的发病率和死亡率也呈上涨的趋势[22],如何有效控制奶牛腹泻病的发生和发展成了亟待解决的问题。本研究通过系统的研究了宁夏部分地区集约化奶牛场隐孢子虫的流行病学特征及其基因型的分布情况,初步揭示了宁夏地区奶牛中隐孢子虫潜在的公共卫生安全风险,从而为进一步制定针对隐孢子虫感染的高效防控方案提供理论依据。